Bu protokol, drosophila larvalarının sağlam canlı hayvanlarda 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme elde etmek için bir yöntem inşama yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem larva gövde duvarına yakın birçok biyolojik süreci görüntülemek için kullanılabilir.
Canlı görüntüleme hücre biyolojisi sorularını araştırmak için değerli bir yaklaşımdır. Larva vücut duvarı ve iç organların çoğu saydam olduğu için Drosophila larvaözellikle in vivo canlı görüntüleme için uygundur. Ancak, 30 dakikadan uzun süre bozulmamış Drosophila larvalarının sürekli canlı görüntülemesi, invaziv olarak hareketsiz hale getirmek uzun süre larvaları hareketsiz hale getirmek zor olduğu için zor olmuştur. Burada larvaSPA adı verilen ve 10 saatten uzun süre yüksek temporal ve mekansal çözünürlüğe sahip canlı Drosophila larvalarının sürekli görüntülenmesine olanak tanıyan larvaspa adı verilen bir montaj yöntemi salıyoruz. Bu yöntem, uv-reaktif tutkal kullanarak coverslip’e kısmen larva takmayı ve ayrıca polidimethylsiloxane (PDMS) bloğu kullanarak larva hareketini kısıtlamayı içerir. Bu yöntem ikinci instar dan üçüncü instar wandering gelişim aşamalarında larvalar ile uyumludur. Drosophila somatosensoriyel nöronların dinamik süreçlerini incelerken bu yöntemin uygulamalarını gösteriyoruz, buna dendrit büyümesi ve yaralanmaya bağlı dendrit dejenerasyonu da dahil. Bu yöntem aynı zamanda larva gövde duvarı yakınında meydana gelen diğer birçok hücresel süreçleri incelemek için uygulanabilir.
Hızlandırılmış canlı görüntüleme dinamik hücresel süreçleri incelemek için güçlü bir yöntemdir. Zaman atlamalı filmlerin sağladığı mekansal ve zamansal bilgiler hücre biyolojisi sorularını yanıtlamak için önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Şeffaf vücut duvarı iç yapıların noninvaziv görüntüleme için izin verir çünkü Drosophila larva canlı görüntüleme kullanarak araştırmalar için popüler bir in vivo modeli olmuştur1,2. Buna ek olarak, çok sayıda genetik araçlar Drosophila floresanca etiket anatomik yapılar ve makromoleküllermevcuttur 3. Ancak, Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesi zordur. Sabit erken embriyolar veya pupa aksine, Drosophila larvaları sürekli hareket, canlı görüntüleme için immobilizasyon gerektiren. Canlı Drosophila larvaları hareketsizleştirmenin etkili yolları arasında kloroform4ile halokarbon yağımontajı, izofluran veya Dichlorvos solüsyonukullanılarakanestezi 5 , ve kapak kaymave mikroskop slayt ı arasında sıkıştırma6. Bu yöntemlerden bazıları mikroskopi için kullanılmış olsa da, bunların hiçbiri uzun süreli canlı görüntüleme de etkili değildir. Konvansiyonel konfokal mikroskopi veya ışık sayfası mikroskobu7,8,9kullanılarak tarama larvalarında vücut duvarı nöronlarının görüntülenmesi için başka yöntemler geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemler larvaların hareketi nedeniyle hücresel dinamikleri izlemek için ideal değildir.
Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesini sağlamak için yeni yöntemler geliştirilmiştir. Bir polidimethylsiloxane kullanarak (PDMS) “larva çipi”, Drosophila larva etkili anestezi olmadan özel bir mikrohazret vakum üretilen emme yoluyla immobilize edilebilir. Ancak, bu yöntem hücre biyolojisi çalışmaları için yüksek zamansal çözünürlük sunmuyor ve hayvan boyutu üzerinde sıkı sınırlamalar vardır10. Bir anestezi cihazı kullanarak başka bir yöntem birden fazla zaman noktalarında Drosophila larvacanlı görüntüleme elde ve nöromüsküler kavşaklar 11 çalışma için uygulanmıştır11,12,13,14,15,16. Ancak, bu yöntem aynı zamanda 30 dakikadan daha uzun süre sürekli görüntüleme için izin vermez ve tekrar tekrar desfluran kullanarak gerektirir, hangi nöral aktiviteyi inhibe edebilir ve biyolojik süreci etkileyebilir17,18. Son zamanlarda, mikroakışkan cihaz ve kriyoanestezi birleştiren yeni bir yöntem kısa süreler için çeşitli boyutlarda larvaları hareketsiz leştirmek için kullanılmıştır (dakika)19. Ancak, bu yöntem bir soğutma sistemi ve immobilizasyon uzun süre lervalar tekrarlanan soğutma gerektirir gibi özel cihazlar gerektirir.
Burada 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme ile uyumlu Drosophila larvaları hareketsiz hale getirmenin çok yönlü bir yöntemini salıyoruz. “Kısmi Bağlanmaya Göre Larva Stabilizasyonu” (LarvaSPA) dediğimiz bu yöntem, larva miğanınözel olarak yapılmış bir görüntüleme odasında görüntüleme için bir kapak kaymasına yapıştırılmasını içerir. Bu protokol, görüntüleme odasının nasıl yapılacağını ve larvaların çeşitli gelişim evrelerinde nasıl monte edilebildiğini açıklar. LarvaSPA yönteminde, istenilen gövde segmentleri UV-reaktif tutkal kullanılarak kapak kaymasına yapıştırılır. Bir PDMS kübik ayrıca larvalara basınç uygulayarak kaçışı önler. Görüntüleme odasındaki hava ve nem, görüntüleme sırasında kısmen hareketsiz olan larvaların hayatta kalmasını sağlar. LarvaSPA’nın diğer tekniklere göre avantajları şunlardır: (1) Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip, bozulmamış Drosophila larvalarının saatlerce sürekli canlı görüntülenmesine olanak sağlayan ilk yöntemdir; (2) Yöntemin larva boyutu üzerinde daha az sınırlaması vardır; (3) Görüntüleme odası ve PDMS kübikler en az maliyetle imal edilebilir ve yeniden kullanılabilir.
Larva montaj yöntemini tanımlamanın yanı sıra, Drosophila dendritik arborization (da) nöronlarının dendritgelişimi ve dendriter dejenerasyonu için uygulamanın birkaç örneğini savuruyoruz.
Burada LarvaSPA, uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için canlı Drosophila larvamontaj çok yönlü bir yöntem açıklar. Bu yöntem, larvaların kurtarılmasını veya yeniden monte edilmesini gerektirmez ve kesintisiz görüntüleme sağlar. Bu nedenle, dendrite dejenerasyonu ve rejenerasyon gibi tamamlanması saatler alan biyolojik süreçleri izlemek için idealdir. Bu yöntem aynı zamanda hücre içi kalsiyum dinamikleri ve mikrotübül büyümesi gibi hücre altı olayları görüntüleme i…
The authors have nothing to disclose.
Biz LarvaSPA yönteminin önceki bir sürümünü kurmak için Lingfeng Tang teşekkür; Glenn Swan Cornell Olin Hall Machine mağazasında görüntüleme odasının önceki prototipleri yapmak için; Philipp Isermann metal çerçeveler inşa etmek ve PDMS kübik ler yapma konusunda öneriler sunmak için; Mikroskoplara erişim için Cornell BRC Görüntüleme tesisi (NIH hibe S10OD018516 tarafından finanse edilmektedir); Maria Sapar makalenin eleştirel okuması için. Bu çalışma, H.J.’e verilen Cornell Bursu ile desteklenmiştir; C.H.J. ve C.H.’ye verilen Bir Cornell başlangıç fonu ve NIH hibeleri (R01NS099125 ve R21OD023824) projeyi tasarladı ve deneyleri tasarladı. Deneyleri H.J. yaptı. Taslağı H.J. ve C.H. yazdı.
6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |