Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.
Membrana gömülü hücre yüzey reseptörleri arasındaki doğrudan etkileşimler aracılığı ile aracılık edilen hücreler arası iletişim, çok hücreli organizmaların normal gelişimi ve işleyişi için çok önemlidir. Ancak, bu etkileşimleri algılamak teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Bu makale, belirli hücre yüzey tanıma olayları için gerekli hücresel yolları ortaya koyan sistematik genom ölçekli CRISPR/Cas9 nakavt genetik tarama yaklaşımını açıklamaktadır. Bu test, bir memeli protein ekspresyon sisteminde üretilen rekombinant proteinleri hücre tabanlı genetik bir ekranda etkileşim ortaklarını belirlemek için hevesli bağlayıcı problar olarak kullanır. Bu yöntem, membrana gömülü reseptörlerin ektodomains karşılık rekombinant bağlayıcı problar tarafından tespit hücre yüzeyi etkileşimleri için gerekli genleri tanımlamak için kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu yaklaşımın genom ölçekli doğası göz önüne alındığında, aynı zamanda sadece doğrudan reseptör tespit değil, aynı zamanda hücre yüzeyinde reseptör sunumu için gerekli olan hücresel bileşenleri tespit avantajı vardır, böylece reseptörbiyolojisi içine değerli anlayışlar sağlayan.
Hücre yüzeyreseptör proteinleri tarafından ekstrasellüler etkileşimleri doku organizasyonu, konak-patojen tanıma ve bağışıklık regülasyonu gibi önemli biyolojik süreçleri yönlendirir. Membran reseptörleri monoklonal antikorlar gibi sistematik olarak teslim terapötik eyleme hedefleri olduğundan, bu etkileşimleri soruşturma, daha geniş biyomedikal topluluk için ilgi çekicidir. Önemine rağmen, bu etkileşimleri incelemek teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Bunun başlıca nedeni membrana gömülü reseptörlerin amphipatik olması, biyokimyasal manipülasyon için biyolojik membranlardan izole etmelerini zorlaştırması ve etkileşimlerinin zayıf etkileşim yakınlıkları (μM-mMaralığındaki KDs)1. Sonuç olarak, birçok yaygın olarak kullanılan yöntemler protein etkileşimleri bu sınıf tespit etmek için uygun değildir1,2.
Benzersiz biyokimyasal özelliklerini dikkate alan ekstrasellüler reseptör-ligand etkileşimlerini özellikle araştırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir3. Bu yaklaşımların bir kısmı, bu proteinlerin glikanlar ve disülfür bağları gibi yapısal olarak önemli olan çeviri sonrası modifikasyonlar içermesini sağlamak için memeli veya böcek hücre tabanlı sistemlerde çözünür rekombinant protein olarak reseptörün tüm ektoetki alanını ifade etmeyi içerir. Düşük yakınlık bağlama üstesinden gelmek için, ektodomains genellikle bağlayıcı avidite artırmak için oliomerize edilir. Hırslı protein ektodomains başarıyla doğrudan rekombinant protein-protein etkileşim ekranlarında etkileşim ortakları belirlemek için bağlayıcı problar olarak kullanılmıştır4,5,6,7. Geniş başarılı olsa da, rekombinant protein bazlı yöntemler bir membran reseptörünün ektoetkialanı çözünür bir protein olarak üretilmesi gerekir. Bu nedenle, genellikle bitişik bir hücre dışı bölge içeren proteinler için geçerlidir (örneğin, tek geçişli tip I, tip II veya GPI-anchored) ve genellikle membrana birden fazla kez yayılan reseptör kompleksleri ve membran proteinleri için uygun değildir.
Tamamlayıcı DNA’lardan oluşan bir kütüphanenin hücrelere aktarıldığı ve bağlayıcı bir fenotip artışı için test edildiği ekspresyon klonlama teknikleri de hücre dışı protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için kullanılmıştır8. Son yıllarda klonlanmış ve sıralı cDNA ekspresyonu plazmidlerinin büyük koleksiyonlarınınkullanılabilirliği,cDNA’ları kodlayan hücre yüzey reseptörlerini aşırı ifade eden hücre hatlarının etkileşimleri tanımlamak için rekombinant proteinlerin bağlanması için tarandığı yöntemleri kolaylaştırmıştır9,10. CDNA aşırı ekspresyon temelli yaklaşımlar, rekombinant protein bazlı yöntemlerin aksine, plazma membranı bağlamında etkileşimleri belirleme olanağı nı karşılar. Ancak, cDNA ekspresyonu yapılışındaki başarı, hücrelerin proteini doğru katlanmış formda aşırı ifade etme yeteneğine bağlıdır, ancak bu genellikle taşıyıcılar, şaperonlar ve doğru oligomerik montaj gibi hücresel aksesuar faktörleri gerektirir. Bu nedenle tek bir cDNA’nın aktarılması hücre yüzeyi ekspresyonunu elde etmek için yeterli olmayabilir.
CDNA yapıları veya rekombinant protein probları kullanarak tarama teknikleri kaynak yoğun dur ve cDNA veya rekombinant protein kütüphanelerinin büyük koleksiyonlarını gerektirir. Özellikle tasarlanmış kütle spektrometresi tabanlı yöntemler büyük kütüphanelerin montaj gerektirmeyen hücre dışı etkileşimleri belirlemek için son zamanlarda kullanılmıştır. Ancak, bu teknikler hücre yüzeyinde mevcut moleküllerin biyokimyasal doğasını değiştirebilir ve şu anda sadece glikozile proteinler11,12aracılık etkileşimleri için geçerli olan hücre yüzeyinin kimyasal manipülasyon gerektirir. Şu anda mevcut yöntemlerin çoğunluğu da büyük ölçüde glikan, lipidler ve kolesterol gibi moleküller de dahil olmak üzere membran mikroortamdan katkısı göz ardı ederken proteinler arasındaki etkileşimleri üzerinde yoğun olarak odaklanır.
CRISPR tabanlı yaklaşımlar kullanılarak son derece verimli biallelik hedeflemenin son zamanlarda gelişmesi, farklı bağlamlarda yer alan hücresel bileşenleri tanımlamak için sistematik ve tarafsız bir şekilde taranabilen tek bir havuzda tanımlanmış genlerden yoksun hücrelerin genom ölçeğinde kütüphanelerini sağlamıştır, hücresel sinyal süreçlerinin incelenmesi, ilaçlara, toksinlere ve patojenlere karşı direnç sağlayan tedirginliklerin belirlenmesi ve antikorların özgüllüğünün belirlenmesidahil 13,14,15,16. Burada, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için mevcut biyokimyasal yaklaşımlara alternatif sağlayan genom ölçekli CRISPR tabanlı nakavt hücre tarama testini tanımlıyoruz. Membran reseptörlerinin genetik ekranlar aracılığı ile oluşturduğu etkileşimleri tanımlama yaklaşımı, özellikle cd’lerin veya rekombinant proteinlerin büyük kütüphanelerinin derlenmesine gerek duymadığı için bireysel ligandlara odaklanmış bir ilgi duyan araştırmacılar için uygundur.
Bu tahlil üç ana adımdan oluşur: 1) İlgi reseptörünün hücre dışı bölgelerinden oluşan son derece hırslı rekombinant protein bağlama probları floresan esaslı akış sitometrisi-bağlama tahlillerinde üretilir ve kullanılır; 2) Bağlayıcı tahliller rekombinant protein probu etkileşim ortağı ifade eden bir hücre hattı tanımlamak için kullanılır; 3) Etki proteini ile etkileşime girilen hücre hattının Cas9-ekspres versiyonu üretilir ve genom ölçekli CRISPR/Cas9 tabanlı nakavt ekranı yapılır (Şekil 1). Bu genetik ekranda, bir rekombinant proteinin hücre hatlarına bağlanması, sondayı bağlama yeteneğini yitirmiş nakavt kitaplığı içindeki hücrelerin floresan bazlı aktif hücre sıralama (FACS) ve sıralama ile tanımlanan bağlayıcı fenotip kaybına neden olan genler kullanılarak sıralandığı ölçülebilir bir fenotip olarak kullanılır. Prensip olarak, avid probu bağlamaktan sorumlu reseptörü kodlayan genler ve hücre yüzeyi görüntüsü için gerekli olanlar tanımlanır.
Bu protokolün ilk adımı membrana bağlı reseptörlerin ektoetkialanını temsil eden hırslı rekombinant protein problarının üretimini içerir. Bu reseptörlerin ektodomains bir rekombinant çözünür protein1olarak ifade edildiğinde sık sık ekstrasellüler bağlayıcı işlevlerikorumak bilinmektedir. İlgi çekici bir protein için, çözünür rekombinant proteinler, daha fazla bağlayıcı avidite için oliomerize edilebilen herhangi bir formatta uygun ökaryotik protein ekspresyon sisteminde üretilebilir ve floresan bazlı akış sitometrisi bazlı bağlayıcı tahlillerde (örn. HEK293 protein ekspresyonu sistemi kullanılarak membran reseptörlerinin çözünür ektodomains üretimi için ayrıntılı protokoller, hem pentamerik proteinlerin ve monomerik proteinlerin üretimi için farklı multimerizasyon teknikleri ve protein ekspresyonu yapıları daha önce tarif edilmiştir1,17. Buradaki protokol, monomerik biyotinylated proteinlerden floresan avid probları üreterek, doğrudan hücre bazlı bağlayıcı tahlillerde kullanılabilen ve algılama için ikincil bir antikor gerektirmeyen bir avantaja sahip olan bir florokroma (örneğin, phycoerythrin veya PE) konjuge streptavidin’e konjuge ederek floresan avid probları üretme adımlarını açıklayacaktır. Genom ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için genel protokoller zaten tarif edilmiştir20,21, bu nedenle protokol esas olarak Insan V1 kullanarak CRISPR / Cas9 nakavt tarama sistemi kullanarak akış sitometri tabanlı rekombinant protein bağlama ekranları performans özellikleri odaklanmak (“Yusa”) kütüphane18.
Hücresel tanıma ile ilgili hücresel bileşenleri kodlayan genleri tanımlamak için CRISPR tabanlı bir tarama stratejisi tanımlanmıştır. CRISPR aktivasyonu kullanarak benzer bir yaklaşım da büyük protein kütüphaneleri oluşturmak için gerek kalmadan rekombinant proteinlerin doğrudan etkileşim reseptörlerini belirlemek için genetik bir alternatif sağlar26. Ancak, bu yaklaşımın en önemli bir avantajı, hücre üzerinde doğal olarak görüntülenen yüzey molekülleri tarafından aracılık etkileşimleri için geçerli olmasıdır ve reseptörün bağlayıcı avidite etkileyebilir reseptörlerin aşırı ekspresyonu bağlı değildir. Diğer yöntemlerin aksine, bu nedenle, bu teknik reseptörlerin biyokimyasal doğası veya hücre biyolojisi ile ilgili hiçbir varsayımda bulunmaz ve normalde çok büyük proteinler gibi biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak incelenmesi zor olan proteinlerin aracılık ettiği etkileşimleri veya membranı birden fazla kez geçen veya diğer proteinlerle kompleksler oluşturan ve glikan, glikolipid ve fosfolipid gibi proteinler dışındaki molekülleri inceleme fırsatı sağlar. Yöntemin genom ölçekli doğası göz önüne alındığında, bu yaklaşım aynı zamanda reseptör ütülünün tanımlanması değil, aynı zamanda bağlayıcı olay için gerekli olan ek hücresel bileşenlerin de avantajına sahiptir, böylece reseptörün hücre biyolojisi hakkında bilgi sağlar.
Bir yetim proteinin reseptörü tanımlamak için kullanırken bu yöntemin önemli sınırlamalarından biri ilk proteine bağlanan bir hücre hattı tanımlamak için ilk gereksinimdir. Bu her zaman kolay değildir ve genetik ekranlara da izin veren bağlayıcı bir fenotip gösteren bir hücre hattını tanımlamak bu taslağı dağıtmak için zaman sınırlayıcı bir adım olabilir. Bazı hücre hatları diğerlerinden daha fazla proteine bağlanma eğilimindedir. Bu özellikle HS’yi bağlayan proteinler için önemlidir, çünkü bu proteinler yerel bağlama bağlamına bakılmaksızın HS yan zincirlerini gösteren herhangi bir hücre hattına bağlanma eğilimindedirler. Ayrıca hücre hatlarında sindekanların (yani HS içeren proteoglikanlar) yükseltisinin HS bağlayıcı proteinlerin daha fazla bağlanmasına yol açtığını gözlemledik26. Bu tarama için hücre hattı seçerken dikkate alınması gereken bir faktör olabilir. Ancak, dikkat edilmesi gereken önemli olan HS’nin katkı maddesinin belirli bir reseptöre bağlanmasını engellememesidir. Bu, bağlama gözlenirse, bu teşbikte HS’nin aracılık ettiği bağlayıcının19’abağımlı değil katkı maddesi olması nedeniyle yalnızca HS tarafından aracılık edilmesinin mümkün olduğu anlamına gelir. Böyle bir senaryoda, açıklanan heparin engelleme yaklaşımı tam bir genetik tarama yapmaya gerek kalmadan bu tür davranışları belirleyebilir.
Hücre hatları seçmek için yararlı bir kaynak Hücre Modeli Pasaport, genomik içeren, transkripsiyon, ve kültür durum bilgileri ~ 1,000 kanser hücre hatları27. Biyolojik içeriğe bağlı olarak, hücreler ifade profillerine göre seçilebilir. Hücre hatlarının seçimine yardımcı olmak için, ~1.500 premaye edilmiş insan hücresi yüzey glikoproteinleri28 ifadesine göre Hücre Modeli Pasaport ~1.000 hücre hatları kümelenmiş 28 (Ek Şekil 2; büyüme koşulları ile birlikte her hücre hattı için küme bilgileri Ek Tablo 2’deverilmiştir ). Bilinmeyen fonksiyonu ile bir proteinin bağlanması test ederken, reseptörlerin geniş bir yelpazede kapsayan şansını artırmak için her kümeden temsili hücre hatları bir panel seçmek yararlıdır. Bir seçim göz önüne alındığında, kültür ve transduce kolay hücre hatları seçmek için tavsiye edilir. Bu hücre hatları genom ölçekli taramada kullanılacağı için, daha sonraki adımlarda CRISPR tabanlı genetik tarama için sgRNA’nın teslimi için en yaygın yöntem olduğu için, büyük miktarlarda kolayca yetiştirilebilen ve lentiviral transdüksiyona izin verilmesi tercih edilir.
Genellikle, fenotip seçimleri tek bir sıralamada gerçekleştirilir. Ancak, bu kontrol ile karşılaştırıldığında lekeli hücre popülasyonunun parlaklığı ile belirlenir. İstenilen fenotipin sinyal-gürültü oranının düşük olduğu veya ekranın amacının güçlü fenotiplere sahip mutantları belirlemek olduğu senaryolar için yinelemeli seçim turları benimsenebilir. FACS tabanlı ekranlar için yinelemeli bir seçim yaklaşımı kullanırken, sıralama işleminin esas olarak ayıklayıcının katıksız gücü nedeniyle hücre ölümüne neden olabileceğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Böylece, toplanan tüm hücreler sıralama sonraki turda temsil edilecektir.
Kütüphane karmaşıklığı başarılı genetik ekranlar, özellikle negatif seçim ekranları için performans çok önemli bir faktördür, çünkü bu tükenme ölçüde sadece başlangıç kitaplığı mevcut ne sonuçları karşılaştırArak belirlenebilir. Negatif seçim ekranları için, 500-1.000 x karmaşıklıkta kitaplıklar korumak için yaygındır. Pozitif seçim ekranları, ancak, kütüphane boyutları için daha sağlam, bu tür ekranlarda mutantların sadece az sayıda belirli bir fenotip için seçilmesi bekleniyor çünkü. Bu nedenle, burada açıklanan olumlu seçim ekranında, kitaplık boyutu ekranın kalitesinden ödün vermeden 50-100x karmaşıklığa düşürülebilir. Buna ek olarak, bu ekranlarda belirli bir günde belirli bir hücre hattı için bir denetim kitaplığı kullanmak da mümkündür verilen hücre hattı için gün sıralanmış tüm örnekler için bir “genel kontrol” olarak. Bu, üretilmesi ve sıralanmış olması gereken denetim kitaplıklarının sayısını azaltır.
Bu yaklaşımın kullanımı için bir diğer önemli husus in vitro hücre büyümesi için gerekli olan genlerin belirlenmesinde fonksiyon kaybı ekranlarının sınırlamalarıdır. Bu bağlamda ekranların zamanlaması çok önemlidir, çünkü mutant hücreler kültürde ne kadar uzun süre tutulursa, temel genlerdeki mutasyona sahip hücrelerin canlı olma olasılığı da o kadar yüksektir ve artık mutant kütüphanesinde temsil edilmiyor. 300’den fazla hücre hattında Proje Puanı girişiminin bir parçası olarak gerçekleştirilen son genetik ekranlar, KEGG-açıklamalı protein salgılaması ve N-glikozilasyon yolundaki birden fazla genin genellikle bir dizi hücre hattı için gerekli olarak tanımlandığını göstermektedir (Ek Şekil 3)29. Bu durum, hücresel tanıma süreci bağlamında çoğalma ve canlılık için gerekli genlerin etkisinin araştırılamaması durumunda ekran tasarımında göz önünde bulundurulabilir. Bu durumda, ekranların erken bir zaman noktasında (örn. 9. gün posttransdüksiyon) yapılması genel olarak uygun olacaktır. Ancak, yaklaşım genel hücresel yollar yerine güçlü boyut etkileri olan birkaç hedefi tanımlamak için kullanılırsa, daha sonraki bir zaman noktasında (örneğin, gün 15-16 posttransdüksiyon) ekranlar gerçekleştirmek için uygun olabilir.
Tarama sonuçları çok sağlam; geçmişte yapılan sekiz rekombinant protein bağlama ekranlarında, hücre yüzey reseptörü her durumda en çok etkilenen19. Etkileşim ortağını tanımlamak için bu yaklaşımı kullanırken, bu nedenle reseptörün ve yüzeydeki sunumuna katkıda bulunan faktörlerin yüksek istatistiksel güvenle tanımlanması beklenmelidir. Ekran yapıldıktan ve tek bir gRNA nakavt kullanılarak bir vuruş doğrulandıktan sonra, AVEXIS4 gibi mevcut biyokimyasal yöntemler ve yüzey plazmon rezonansı kullanılarak saflaştırılmış proteinlerin doğrudan doygun bağlanması kullanılarak daha fazla takip yapılabilir. Burada açıklanan yaklaşım, çözünür rekombinant bağlayıcı probu oluşturmak mümkün olan tüm proteinler için geçerlidir.
Özetle, bu hücre yüzeyproteinleri tarafından aracılık etkileşimleri belirlemek için bir genom ölçekli CRISPR nakavt yaklaşımdır. Bu yöntem genellikle hücre yüzeyinin tanınması için gerekli hücresel yolları belirlemek için bir organizmanın kendi hücreleri (örneğin, nöral ve immünolojik tanıma) ve konak hücreleri ve patojen proteinler arasında da dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik bağlamlarda uygulanabilir. Bu yöntem, reseptör tanımlaması için tasarlanmış biyokimyasal yaklaşımlara genetik bir alternatif sağlar ve reseptörlerin biyokimyasal doğası veya hücre biyolojisi ile ilgili önceden varsayımlar gerektirmediği için tamamen beklenmedik keşifler yapma potansiyeline sahiptir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, GJW’a verilen 206194 wellcome trust hibe numarası ile desteklenmiştir. Biz Cytometry Core tesisi teşekkür ederiz: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson, ve Christopher Hall FACS ile yardım için.
Anti-mouse alkaline phosphatase | Sigma | A4656 | |
Blasticidin | Chem-Cruz | SC-204655 | |
Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit | Qiagen | 13362 | |
BSA | Sigma | A9647-100G | |
Diethanolamine | Sigma | 398179 | |
DMEM | Gibco | 31966-021 | |
Dneasy Blood and Tissue kit | Qiagen | 69504 | |
DynaMag-96 Side Magnet | Invitrogen | 12331D | |
HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | |
Heparin | Sigma | H4784-1G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa | KK2602 | |
Lipofectamine LTX with PLUS reagent | Invitrogen | 15338100 | |
MoFlo XDP cell sorter | BD | ||
Ni2+-NTA agarose beads | Jena Bioscience | AC-501-25 | |
OPTI-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
OX-68 antibody | AbD Serotec | MCA1022R | |
p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 1040-506 | |
PD-10 desalting columns | GE healthcare | 17085101 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Polypropylene tubes with 5 mL bed volume | Qiagen | 34964 | |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 3115879001 | |
Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix | NEB | M0494L | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
SCFA filter | Nalgene | 190-2545 | |
Sony Cell sorter | Sony | ||
SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads) | Beckman | A63881 | |
Streptavidin-coated microtitre plates | Nalgene | 734-1284 | |
Streptavidin-PE | Biolegend | 405204 |