Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX) genişletilmiş in vitro kültürünü mümkün kılacak yöntemleri göstermektedir. Bir adım, 3D hidrojellerde çok hücreli küme kültürlerinin genel canlılığını, canlı olmayan tek hücrelerin doğrudan çıkarılması yoluyla artırır. İkincibir adım, pdx kültürü için en iyi uygulamaları perfüzyonlu mikroakışkan bir platformda gösterir.
Hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX), rezeke edilen hasta tümör dokusu doğrudan immünazatlı farelere aşılandığında ortaya çıkan, biyolojik olarak stabil kalır, böylece moleküler, genetik ve histolojik özelliklerin yanı sıra orijinal tümörün heterojenliği de korur. Ancak, bu modellerin uyuşturucu taraması da dahil olmak üzere çok sayıda deney icra etmek için kullanılması hem maliyet hem de zaman açısından engelleyicidir. Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri yaygın olarak kanser hücrelerinin biyokimyasal etkileşimler, morfoloji ve mimari yoluyla biyolojik bütünlüklerini korudukları platformlar olarak görülür. Ekibimiz hyaluronik asit (HA) oluşan 3D matrisler kullanarak in vitro PDX hücreleri kültürleme geniş bir deneyime sahiptir. PDX’lerle ilişkili fare fibroblaststromal hücrelerini ayırmak için, stromal hücrelerin doku kültürü yle tedavi edilmiş plakaların yüzeyine yapıştığı, ayrıştırık PDX tümör hücrelerinin yüzdüğü ve çok hücreli kümelere kendi kendini bağdaştırdığı rotasyon kültürünü kullanıyoruz. Ayrıca supernatant yüzen tek, genellikle ölü hücreler, hangi 3D hücre kültürü için hidrojeller içine aşağı kapsülleme için canlı PDX kümeleri toplama bir sorun mevcut. Bu tek hücreleri canlı hücre kümelerinden ayırmak için yoğunluk adım gradyan santrifüj uyguladığız. Burada açıklanan protokol, daha fazla in vitro deney için kullanılacak hücre kümelerinin sağlıklı popülasyonundan canlı olmayan tek hücrelerin tükenmesine olanak sağlar. Çalışmalarımızda, kültür sırasında medya perfüzyonuna olanak sağlayan mikroakışkan plakalara 3Boyutlu kültürleri dahil ediyoruz. Arınmış ve saflaştırılmayan hücrelerin floresan görüntü tabanlı canlılık tahsini kullanılarak ortaya çıkan kültürleri değerlendirdikten sonra, elde edilen sonuçlar, bu ek ayırma adımının kültürlerimizden canlı olmayan hücrelerin sayısını önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.
Son on yılda, kanser araştırma alanı hasta kaynaklı ksenogreftler için yenilenen coşku göstermiştir (PDXs) kanser hücre yolu güven ve ilaç duyarlılık değerlendirmek için bir araç olarak1. En sık görülen PDX modelleri insan tümör hücrelerinin deri altı veya ortotopik implantasyonu ile kurulur-bir tümör parçası, ayrışmış tümör türevi hücrelerin bir küme, ya da izole dolaşan tümör hücrelerinin bir örnek (CtCs)—bir kemirgen konak içine. Tümör “almak” başarılı olursa, ksenogreft hücreleri çoğalır, vaskülarite, ve aksi takdirde bir tümör oluşturmak için konak doku ile etkileşim, hangi optimal boyutta hasat edilebilir, bölünmüş, ve diğer konakiçine yeniden implante. Bir model sistemi olarak birçok avantajları arasında, PDXs genellikle yerli tümör hücre nüfusunun heterojenlik önemli bir kısmını korumak ve insana özgü yollar ve hücre yanıtları değerlendirilmesi sağlamak2,3. In vivo bağlam vaskülatür ve diğer komşu stroma ile tümör etkileşimi sağlar ve ilaç difüzyon dinamikleri gibi doku özellikleri recapitulates, oksijen gerginliği, ve ekstrasellüler matriks etkisi biyolojik ve mekanik tümör ilerlemesini etkiler. PDXs olumsuz bir yönü bir kemirgen konak onların güven, tümör genişlemesi için hem de sonuçta hipotez testi için. Birçok PDX’ler, arzu edilen özelliklerinin çoğunu kaybetmeden doku kültürü polistiren geleneksel iki boyutlu (2D) kültüre adapte olamayacağından, bu nispeten kontrollü in vitro yöntemi ile in vivo PDX kullanımı için gider, tesis ve zaman gereksinimlerindeki önemli artış arasında araştırmacılar için en az orta zemin olmuştur.
Biz destekleyici bir matris içinde 3D hücre kültürü uygulamak birden fazla in vitro modelleri tarif ettik, ve son zamanlarda birden fazla prostat kanseri ex vivo kültürünü göstermek için bu işi genişletti (PCa) türetilmiş PDXs, hem tek başına ve kemik iliği kaynaklı fibroblastlar ile co-kültür4,5. Hyaluronik asit (HA) bazlı hidrojel matrisler, hidrojelderinliği6 ile görüntüleme için hidrojel özellikleri ve optik netlik üzerinde kolay kontrol ile, her iki hücre tipleri için özelleştirilebilir ve biyolojik olarak ilgili destek sağlar.
Olgun PDX tümör dokuları heterojen insan kanser hücreleri ve fare stroma (fibroblastlar, endotel hücreleri, vb) değişken bir karışımını oluşturmaktadır. İn vitro tümör ilerlemesiiçin hücre tipi spesifik katkıları incelemek için, tümörleri ayırmak, hücre popülasyonlarını ayırmak ve deneysel olarak hücreler arası iletişim yollarını ayırmak için düzenli bir şekilde birleştirmek avantajlı olabilir. Doku digestates içinde karışık hücre popülasyonları belirli kültür koşulları ile diferansiyel uyumluluk var. Örneğin, tümörle ilişkili fibroblast canlılığı ya yüzey ekibe veya integrin ligandlarla işlevsel 3D matrisler gerektirirken, epitel kaynaklı PDX hücreleri genellikle bu gereksinimlere sahip değildir, bunun yerine hücre-hücre etkileşimlerini tercih eder. Bu farklılıklar, PDX hücrelerinin fare stromal hücrelerini kontamine olmaktan etkin bir şekilde ayrılmasını sağlamak için kullanılabilir. Doku digestates rotasyon kültürü doku-hücre yapışıklıkları 24−48 h supernatant çok hücreli kümeler oluşturmak için dönen kültür yüzeyinin üzerinde yüzen PDX hücreleri sürücü ise doku kültür yüzeyine stromal hücre yapışmasını sağlar. Bu kümelerin özel özellikleri PDX’e (örn. büyük, sıkı, yüksek küresel kümeler veya üzüm demetlerini andıran daha küçük, daha gevşek agregalar) göre değişir, ancak genellikle biyolojik olarak ilgili boyutlardadır (50−250 μm çapında), hücreler arası temaslara dayanan hücresel etkileşimleri değerlendirmek için yeterlidir.
Tümör alımı ve işlenmesi kaçınılmaz olarak, mekanik/enzimatik bozulmadan kaynaklanan kısa süreli hasar veya alt popülasyonların seçilen kültür koşullarıyla uzun süreli uyumsuzluğu nedeniyle kaçınılmaz olarak bir miktar teminat hücre ölümüyle sonuçlanır. İlk toplu ayırma olarak rotasyon kültürünün yararına rağmen, ölü veya ölmekte olan hücreler kaçınılmaz olarak PDX kümeleri ile aktarılır ve ortaya çıkan kültürü etkileyebilir. Bu ölü hücreler genellikle bir kümeye entegre olmayan tek tek PDX hücreleri, seçili kültür koşullarında yaşayamayan fare stromal fibroblastları veya özellikle kırılgan endotel hücreleridir. Bu tür ölmekte olan hücreler “hayatta kalanların” deneysel sonuçlarını etkileyebilir ve floresan görüntü tabanlı canlılık tarama testlerinden sayısallaştırmayı önemli ölçüde etkileyebilir. Bu yöntemden canlı PDX hücrelerinin seçimini iyileştirmek için, PDX karışımlarından tek tek ölü/ölmekte olan hücreleri kolayca çıkarmak ve ağırlıklı olarak canlı çok hücreli kümeleri korumak için yoğunluk adımlarıyla santrifüj yöntemlerini uyarladık.
3D kültürde ortaya çıkan PDX kaynaklı kümelerin çalışmasını geliştirmek için, mikroakışkan tabanlı perfüzyon kültür platformu organoPlate(Şekil 1),96 kişiye kadar özel perfüzyon, 3D kültürlerin 384 kuyudaki mikrotiter plaka tabanı(Şekil 1A) 77,8‘ e kadar eşzamanlı kültüre olanak tanıyan yüksek işletilmiş bir organ-on-a-chip platformundan yararlandık. 2 şeritli mikroakışkan plakada, tek bir doku çipi iki mikroakışkan kanalla bağlanır(Şekil 1B, jel kanal: kırmızı, perfüzyon kanalı: mavi) üst üste dört kuyuya yayılan. İki mikroakışkan kanal, komşu komşu kanaliçine bir kanal taşmasını önler phaseguide denilen kısa bir plastik sırt ile ayrılır, ve aynı anda jel ve perfüzyon kanal9içeriği arasında bir membran-free arayüzü sağlar . Mikroakışkan plakanın alt kısmı mikroskop sınıfı camdan oluştuğu için, kültürler standart veya otomatik mikroskopla plakanın alt kısmından gözlem penceresinden görülebilir. Perfüzyon, mikroakışkan plaka içinde programlanabilir bir rocker ile kurulur, mikroakışkan kanallar aracılığıyla medya sürücü yerçekimi kullanarak, rezervuar kuyuları arasında(Şekil 1C). Perfüzyon akışı-mimik daha yakından statik kültüre göre tümör mikroortamı özetler, kesme stresi ve gazve besin lerin gelişmiş dağılımı dahil edilmesine olanak sağlar. Mikroakışkan plaka bir perfüzyon kanser hücresi kültürünün korunmasının yararları daha önce aynı hücrelerin statik 3D kültür ile karşılaştırıldığında optimum canlılık sergilenen perfüzyon meme kanseri kültürleri olarak tarif edilmiştir7.
Bu rapor, canlı çok hücreli PDX kümelerini yalıtmak için uyarlanmış bir yoğunluk gradyan santrifüj yöntemini açıklar ve perfusable mikroakışkan plakalar içinde 3D PDX kültürleri oluşturmada yarar göstermektedir. Giderek artan sayıda araştırma laboratuvarı PDX kullanımını kolaylaştırmak için yöntemler aradığından, burada sunulan protokollerin hemen faydalı olacağını öngörüyoruz.
Burada, yüksek iş yapımı, perfüzyonlu 3D kültür sisteminde uygulanabilir PDX kaynaklı tümör hücrelerinin işlenmesi ve kültürlenmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolpca PDX dokusu nu kullanırken, diğer epitel kaynaklı tümörler için de aynı derecede etkilidir. Tümör özellikleri, menşe dokuda (prostat, meme, vb.) bile bireysel PDX çizgileri arasında farklılık gösterir. Bazı PCa PDX hatları daha fibrotik ve diğerleri daha hücresel iken canlı hücreleri izole etmek zordur. Burad…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü SBIR Faz I (HHSN26120700015C) ve P01CA098912 tarafından desteklenmiştir.
1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
6-well tissue culture plates | any suitable | ||
70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
Forceps | any suitable | ||
HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
Razor blades | any suitable | ||
Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
Scalpel handle | any suitable | ||
Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |