Özet

Anevrizma Hiperlipidemi Fare Modelinde Yağ Kırmızı O-Boyalı Bütün Aort Lezyonlarının Görüntülenmesi ve Analizi

Published: May 02, 2022
doi:

Özet

Bu protokol, farelerde aterosklerotik yükü analiz etmek için adım adım bir prosedür sağlar. Araştırmacılar bu protokolü farklı hayvanlardaki aterosklerotik lezyonların bolluğunu, yerini ve boyutunu karşılaştırmak için kullanabilirler.

Abstract

Apolipoprotein E (Apoe) veya düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Ldlr) eksikliği olan hiperlipidemik fareler, ateroskleroz araştırması için en sık kullanılan iki modeldir. Çeşitli genetik faktörlerin ve farklı hücre tiplerinin aterosklerotik lezyon oluşumu üzerindeki etkisini incelemek ve yeni tedavilerin gelişimini test etmek için kullanılırlar. Tüm aortun izolasyonu, eksizyonu ve Yağ Kırmızı O boyalı aterosklerotik lezyonların miktarının belirlenmesi aterosklerotik yükü değerlendirmek için kullanılan temel morfometrik yöntemlerdir . Bu protokolün amacı, Oil Red O ile fare aortlarındaki aterosklerotik lezyonları diseke etmek, perfüzyon-fix, izole etmek, boyamak, görüntülemek ve analiz etmek için optimize edilmiş, adım adım cerrahi bir yöntemi tanımlamaktır. Aterosklerotik lezyonlar tüm aort ağacının herhangi bir yerinde oluşabildiğinden, tüm bu aort Yağı Kırmızı O boyama yöntemi, tüm aorttaki lipit yüklü plakları ve tüm dalları tek bir farede değerlendirme avantajına sahiptir. Yağ Kırmızı O boyamasına ek olarak, taze izole edilmiş bütün aortlar çeşitli in vitro ve in vivo deneyler ve hücre izolasyonları için kullanılabilir.

Introduction

ABD’de önde gelen bir mortalite nedeni olan koroner arter hastalığına genellikle arteriyel duvarların içinde plak birikmesine yol açan bir süreç olan ateroskleroz neden olur1. Hiperlipidemiye eğilimli Apee ve Ldlr eksikliği olan fareler, ateroskleroz ve komplikasyonlarının araştırılmasında ve tedavilerin geliştirilmesinde merkezidir2,3,4,5. Aterosklerotik lezyonların en face aorttan nicelleştirilmesi, farklı hücre tiplerinde genetik manipülasyonun etkisini değerlendirmek için önemli bir son nokta analizidir. Ayrıca, aterosklerotik hastalığın başlamasını, ilerlemesini ve regresyonunu etkilemek için tasarlanmış yeni tedavilerin incelenmesine yardımcı olur. Aterosklerotik lezyonlar aort ve dallarının herhangi bir yerinde oluşabilir (yani, göğüsteki brakiyosefalik, karotis ve subklaviyen arterlerin yanı sıra diyaframın altındaki böbrek, yaygın iliak ve femoral arterler)6. Ateroskleroz yükünün kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi ve uygun tedavi, farklı yerlerdeki hastalık yükünün değerlendirilmesini gerektirir ve bu da genellikle göz ardı edilen bir zorluktur.

Bu protokol, açılmamış bir bütün aort ile başlayıp yüz hazırlığına kadar ilerleyen aterosklerotik lezyonların kapsamlı bir analizinin tek bir farede nasıl yapılacağını açıklar. Açılmamış bütün aort Yağı Kırmızı O boyaması, tüm aort ve dallarındaki lipit yüklü plakların hızlı, kalitatif bir şekilde değerlendirilmesini sağlarken, en yüz hazırlığı fare aortundaki aterosklerotik lezyon dağılımının nicel bir değerlendirmesini sağlar.

Teknik, Apoe-/– hiperlipidemik arka plan üzerinde düz kas hücresine özgü TGFβR2 delesyonuna sahip 8 haftalık fareleri kullanır (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe/-; bundan böyle TGFβR2iSMC-Apoe fareleri olarak anılacaktır) ve çöp arkadaşı Apoe-/- kontrolleri (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe/-; bundan böyle Apoe-/- fareler olarak anılacaktır). Hayvanlar, çalışma materyalleri olarak yüksek kolesterollü yüksek yağlı bir diyette (HCHFD) 16 hafta boyunca tutulur7. Çalışma sonlandırma sırasında, açılmamış bütün aortlar, lipid yüklü plakların kalitatif değerlendirmesi için Yağ Kırmızı O ile boyanır ve görüntülenir (tüm ana dallar dahil). Aortlar en yüz hazırlığı ile kesilir ve tüm aterosklerotik lezyonlar görüntülenir ve ölçülür. Bu protokol, Apoe-/- veya Ldlr-/- hiperlipidemi fare modellerinde aterosklerotik lezyon gelişimini incelemek için kullanılabilir ve genel aortla ilişkili vasküler biyoloji uygulamalarına genişletilebilir.

Protocol

mT/mG (stok no. 007676) ve Apoe-/- (stok no. 002052) fareleri Jackson Laboratuvarı’ndan satın alındı. Myh11-CreERT2 fareleri Stefan Offermanns’ın bir hediyesiydi (Jackson Laboratuvarı’ndan stok numarası 019079 olarak temin edilebilir). Tgfbr2fl/fl fareleri Harold L. Moses’tan (Vanderbilt Üniversitesi) elde edildi. Tüm hayvan prosedürleri, Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokoller kullanılarak gerçekleştirild…

Representative Results

Bu protokolde, TGFβR2iSMC-Apoe farelerdeki aterosklerotik lezyonlar HCHF diyetinde 4 ay sonra analiz edildi7. Yaygın ateroskleroza ek olarak, bu fareler daha önce bildirildiği gibi hem torasik hem de abdominal aort anevrizmaları geliştirdi. Apoe-/- farelerle karşılaştırıldığında, TGFβR2iSMC-Apoe farelerinin aort duvarları ciddi ateroskleroz göstererek lezyonların diseksiyonunu zorlaştırdı (Şekil 2C, D, E).<s…

Discussion

Apolipoprotein E (Apoe) ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Ldlr) eksikliği olan fareler, aterosklerozun gelişimini ve tedavisini incelemek için yararlıdır. Araştırmacılar, genetik ve terapötik manipülasyonların, tüm aortun Yağ Kırmızı O boyamasını kullanarak aterosklerozla ilişkili hastalıkların başlaması, ilerlemesi ve regresyonu üzerindeki etkisini değerlendirebilirler9. Aort Yağı Kırmızı O boyama ve lezyon miktarının belirlenmesi a…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, kısmen, NIH hibesi P30AR070253 (P.-Y.C.) ve HL135582 (MS) kapsamında sağlanan Ortak Biyoloji Konsorsiyumu Microgrant tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan fareleri korudukları için R. Webber ve L. Coon’a minnettarız.

Materials

1.5 mL Eppendorf tube DENVILLE C2170
10 mL syringe BD 302995
16% Formaldehyde Polysciences 18814-10
70% ethanol VWR RC2546.70-5 To clean the dissection tools
Black dissection wax CR Scientific C3541
Corn oil Sigma C8267 Solvent for Tamoxifen
DNeasy Blood & Tissue kit QIAGEN 69506 To isolate DNA from mouse ear
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 Gibco 14190-144
Fine scissors Fine Science Tools 14059-11 To cut the mouse skin and open the ribcage
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-A3
High cholesterol high fat diet Research Diets D12108 To induce atherosclerosis
Imaging software National Institutes of Health Image J Aortic lesion quantification
Isopropanol VWR JT9079-5
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A To clean the glass microscope slides
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors ROBOZ RS-5602 To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches
Microscope control software Olympus DP Controller For aorta imaging
Minutien pins Fine Science Tools 26002-10
Needle-25G BD 305124
NonWoven Sponge McKesson 94442000
Oil Red O Sigma O-0625 To stain the atherosclerosis lesions
Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane VWR 28143-312 To filter working Oil Red O solution
Spring Scissors Fine Science Tools 15021-15 To dissect and clean the aorta
Statistical software GraphPad Prism 8 Statical analysis
Stereomicroscope Nikon SMZ1000 For aorta dissection
Stereomicroscope Olympus SZX16 For aorta imaging
Tamoxifen Sigma T5648 To induce Cre-loxP recombination
Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek VWR 25608-930
Tweezer Style 4 Electron Microscopy Sciences 0302-4-PO To cut the mouse skin and open the ribcage
Tweezer Style 5 Electron Microscopy Sciences 0302-5-PO To dissect and clean the aorta

Referanslar

  1. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  2. Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
  3. Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
  4. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
  5. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
  6. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
  7. Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
  8. Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
  10. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
  11. Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Chen, P., Qin, L., Simons, M. Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model. J. Vis. Exp. (183), e61277, doi:10.3791/61277 (2022).

View Video