Özet

İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti

Published: July 08, 2020
doi:

Özet

mikroRNA’lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.

Abstract

İmmünoglobulin A (IgA) nefropatisi, IgA’nın anormal birikimi ile karakterize bir primer glomerülonefrit türüdür ve son dönem böbrek yetmezliğine yol açar. Son yıllarda IgA nefropatisinin patogenezinde mikroRNA’ların (miRNA’lar) tutulumu bildirilmiştir. Bununla birlikte, küçük hayvan modelleri kullanılarak IgA nefropatisinde miRNA’ların profilini çıkarmak için belirlenmiş bir yöntem yoktur. Bu nedenle, bir IgA fare modelinin (HIGA fare) böbreğindeki miRNA’yı analiz etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu protokolün amacı, HIGA farelerinin böbreklerindeki miRNA’ların değişmiş ekspresyon seviyelerini, kontrol farelerinin böbreklerindeki seviyelerle karşılaştırıldığında tespit etmektir. Kısacası, bu yöntem dört adımdan oluşur: 1) HIGA farelerinden böbrek örnekleri almak; 2) böbrek örneklerinden toplam RNA’nın saflaştırılması; 3) toplam RNA’dan tamamlayıcı DNA’nın sentezlenmesi; ve 4) miRNA’ların kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR). Bu yöntemi kullanarak, HIGA farelerinin böbreklerindeki birkaç miRNA’nın (miR-155-5p, miR-146a-5p ve miR-21-5p) ekspresyon seviyelerini başarıyla tespit ettik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA’ların profilini çıkaran diğer çalışmalara uygulanabilir.

Introduction

İmmünoglobulin A (IgA) nefropatisi, renal glomerüler mezangial bölgede anormal IgA birikimi ile karakterize bir primer glomerülonefrit türüdür 1,2. Primer glomerülonefritin en sık görülenidir ve hastaların% 20-40’ında son dönem böbrek yetmezliğine yol açar2. Nedeni hala bilinmemekle birlikte kalıcı mukozal enfeksiyon 1,3 ile ilişkilendirilmiştir. Kortikosteroidler, immünsüpresanlar ve renin-anjiyotensin sistemi inhibitörleri terapötik yöntemler olarak önerilmiştir1,3, ancak tam olarak belirlenememiştir3. Bu nedenle, IgA nefropatisinin etiyolojisini ve tedavi yöntemlerini açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

mikroRNA’lar (miRNA’lar), gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan küçük, kodlamayan RNA’lardır 4,5. miRNA’ların çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynadığı bildirilmiştir ve bazıları hastalık biyobelirteçleri ve terapötik ajanlar olarak tanımlanmıştır 4,5. Son yıllarda miRNA’lar ile IgA nefropatisinin patogenezi arasında bir ilişki olduğu da bildirilmiştir 2,6,7. Örneğin, miR-148b’nin IgA nefropatisi 2,6,7 olan hastalarda IgA’nın yapısal anormalliklerine dahil olduğu gösterilirken, miR-148b ve let-7b, IgA nefropatisi 7’yi saptamak için yeni biyobelirteçler olarak belgelenmiştir. MiRNA’ların IgA nefropatisi üzerindeki etkilerini anlamak, etiyolojiyi ve tedaviyi daha fazla aydınlatmaya yardımcı olabilir2, küçük hayvan modelleri kullanılarak IgA nefropatisinde miRNA’ların profilini çıkarmak için standart yöntemler henüz oluşturulmamıştır2.

Burada, bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki miRNA ekspresyon seviyelerini ölçmek için basit ve güvenilir bir yöntem geliştirdik. HIGA faresi, özellikle yüksek serum IgA seviyesini ve böbrek glomerüllerinde anormal IgA birikimini gösteren karakteristik bir ddY suşudur 8,9,10,11. Bu nedenle, HIGA fareleri bir IgA nefropati fare modeli 8,9,10,11 olarak kullanılabilir. Yöntemimiz dört ana adımdan oluşmaktadır: Birincisi, HIGA farelerinden cerrahi olarak böbrek örnekleri elde etmek; ikincisi, numunelerin homojenleştirilmesi ve silika membran bazlı bir spin sütunu kullanılarak toplam RNA’nın saflaştırılması; üçüncüsü, ters transkripsiyon kullanarak toplam RNA’dan tamamlayıcı DNA’nın (cDNA) sentezlenmesi; ve dördüncüsü, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile miRNA’nın ekspresyon seviyelerinin saptanması. Bu yöntemin gerekçesi ve sonuçların güvenilirliği önceki raporlara dayanmaktadır12,13. Bunun bir IgA nefropatisi fare modelinde miRNA ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için yararlı bir teknik olduğunu ve IgA nefropatisindeki miRNA’lara yönelik gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Protocol

Hayvan deneyleri, Jichi Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu’ndaki Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı kılavuzlarına uygundur. 1. HIGA farelerinden böbrek örnekleri alınması NOT: HIGA fareleri, 8,9,10,11 yaşından sonra 25 haftalıktan sonra stabil bir IgA nefropatisi fenotipi gösterir.<su…

Representative Results

HIGA farelerinin böbreklerindeki miRNA’ların ekspresyon düzeyleri araştırıldı (n=10). Bu sonuç tamamen tarif edilen protokole dayanarak elde edildi. Kontrol olarak Balb/c farelerin böbrekleri seçildi (n=10). Her iki grupta da 25 haftalık yaş seçildi. Tedarikçiden sadece dişi HIGA fareleri temin edilebiliyordu. Üç miRNA’nın ekspresyon seviyeleri (miR-155-5p, miR-146a-5p ve miR-21-5p; Şekil 1) daha önce IgA nefropatisi ile ilişkili olduğu bildirilen15,16…

Discussion

Bu yeni yöntemi kullanarak bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki miRNA’ların ekspresyon seviyelerini ölçebildik. IgA nefropatisi, etiyolojisini ve terapötik hedeflerini açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyan açıklanamayan bir hastalıktır 1,3. Bununla birlikte, insan böbrek örneklerinin elde edilmesi oldukça invazivdir. Bu yeni teknik, küçük hayvanlar kullanılarak IgA nefropatisinin incel…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu makalenin taslağını düzenlediği için Edanz Group’tan (www.edanzediting.com) Dr. Sarah Williams’a teşekkür ederiz.

Materials

BALB/cCrSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit Qiagen 218161 Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2) Qiagen MS00033740 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p) Qiagen MS00001701 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p) Qiagen MS00001638 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p) Qiagen MS00009079 miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder Qiagen 79654 biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument software
takara biomasher standard Takara Bio 9790B silicon homogenizer

Referanslar

  1. Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
  2. Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
  3. Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
  4. Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
  5. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
  6. Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
  7. Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
  8. Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
  9. Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
  10. Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
  11. Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
  12. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  13. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  14. Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
  15. Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
  16. Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Kaneko, S., Yanai, K., Ishii, H., Aomatsu, A., Ito, K., Hirai, K., Ookawara, S., Ishibashi, K., Morishita, Y. Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice. J. Vis. Exp. (161), e61535, doi:10.3791/61535 (2020).

View Video