Özet

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Published: July 21, 2020
doi:

Özet

Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.

Abstract

Epitelyal organoid modelleri, bir organ sisteminin temel biyolojisini incelemek ve hastalık modellemesi için değerli araçlar olarak hizmet eder. Organoidler olarak yetiştirildiğinde, epitelyal progenitör hücreler kendi kendini yenileyebilir ve in vivo meslektaşlarınınkine benzer hücresel fonksiyonlar sergileyen farklılaştırıcı döller üretebilir. Burada, bölgeye özgü progenitörleri insan akciğerinden izole etmek ve deneysel ve doğrulama aracı olarak 3D organoid kültürler üretmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Akciğerin proksimal ve distal bölgelerini, bölgeye özgü progenitör hücreleri izole etmek amacıyla tanımlıyoruz. Toplam hücreleri akciğer ve trakeadan izole etmek için enzimatik ve mekanik ayrışmanın bir kombinasyonunu kullandık. Spesifik progenitör hücreler daha sonra, bazal hücreleri sıralamak için NGFR ve alveolar tip II hücreleri sıralamak için HTII-280 gibi hücre tipine özgü yüzey belirteçlerine dayanan floresan ilişkili hücre sıralama (FACS) kullanılarak proksimal veya distal orijinli hücrelerden fraksiyone edildi. 3D organoid kültürleri oluşturmak için izole bazal veya alveoler tip II progenitörler kullanıldı. Hem distal hem de proksimal progenitörler, 30. günde 5000 hücre/kuyu kaplandıklarında distal bölgede %9-13, proksimal bölgede %7-10 kolon oluşturan etkinliğe sahip organoidler oluşturdular. Distal organoidler kültürde HTII-280+ alveoler tip II hücrelerini korurken, proksimal organoidler 30. günde siliyer ve sekretuar hücrelere farklılaştı. Bu 3D organoid kültürler, akciğer epiteli ve epitel mezenkimal etkileşimlerinin hücre biyolojisini incelemek ve ayrıca bir hastalıkta epitel disfonksiyonunu hedefleyen terapötik stratejilerin geliştirilmesi ve doğrulanması için deneysel bir araç olarak kullanılabilir.

Introduction

İnsan solunum sisteminin hava sahaları, sırasıyla gazların taşınmasına ve daha sonra epitel-mikrovasküler bariyer boyunca değişimine aracılık eden iletken ve solunum bölgelerine ayrılabilir. İletken hava yolları trakea, bronşlar, bronşiyoller ve terminal bronşiyolleri içerirken, solunum hava boşlukları solunum bronşiyolleri, alveoler kanallar ve alveolleri içerir. Bu hava sahalarının epitel astarı, fonksiyonel olarak farklı her bölgenin benzersiz gereksinimlerini karşılamak için proksimo-distal eksen boyunca kompozisyonda değişir. Trakeo-bronşiyal hava yollarının psödostratifiye epiteli, fırça, nöroendokrin ve iyonosit 1,2,3 dahil olmak üzere daha az miktarda hücre tipine ek olarak, bazal, salgı ve siliyer olmak üzere üç ana hücre tipinden oluşur. Bronşiyoler hava yolları, morfolojik olarak benzer epitel hücre tiplerini barındırır, ancak bolluklarında ve fonksiyonel özelliklerinde farklılıklar vardır. Örneğin, bazal hücreler bronşiyoler hava yollarında daha az bulunur ve salgı hücreleri, trakeo-bronşiyal hava yollarında baskın olan seröz ve kadeh hücrelerine karşı kulüp hücrelerinin daha büyük bir bölümünü içerir.  Solunum bölgesinin epitel hücreleri, alveoler kanalların ve alveollerin alveoler tip I (ATI) ve tip II (ATII) hücrelerine ek olarak, solunum bronşiyollerinde kötü tanımlanmış bir küboidal hücre tipini içerir 1,4.

Her bölgede epitelin korunmasına ve yenilenmesine katkıda bulunan epitel kök ve progenitör hücre tiplerinin kimliği eksik tanımlanmıştır ve büyük ölçüde hayvan modellerinde yapılan çalışmalardan çıkarılmıştır 5,6,7,8. Farelerde yapılan çalışmalar, psödotabakatize hava yollarının bazal hücrelerinin veya bronşiyoler hava yollarının kulüp hücrelerinin veya alveoler epitelin ATII hücrelerinin, sınırsız kendini yenileme ve multipotent farklılaşma kapasitesine dayanan epitel kök hücreleri olarak işlev gördüğünü göstermiştir 7,9,10,11,12 . İnsan akciğer epitel hücre tiplerinin köklülüğünü değerlendirmek için genetik soy izleme çalışmalarının yapılamamasına rağmen, epitel kök ve progenitör hücrelerin fonksiyonel potansiyelini değerlendirmek için organoid bazlı kültür modellerinin mevcudiyeti, fare ve insan arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar için bir araç sağlamaktadır13,14,15,16,17.

Epitel hücre tiplerinin insan akciğerinin farklı bölgelerinden ve kültürlerinden izole edilmesi için bölgesel hücre tiplerini özetlemek için 3D organoid sistem kullanarak yöntemleri açıklıyoruz. Diğer organ sistemlerinden epitel hücrelerinin fonksiyonel analizi ve hastalık modellemesi için de benzer yöntemler geliştirilmiştir 18,19,20,21. Bu yöntemler, bölgesel epitel progenitör hücrelerinin tanımlanması, regülasyonlarını ve mikroçevrelerini araştıran mekanik çalışmalar yapmak, hastalık modellemesi ve ilaç keşfini sağlamak için bir platform sağlar. Hayvan modellerinde yapılan akciğer epitel progenitör hücreleri üzerine yapılan çalışmalar, in vivo veya in vitro analizden yararlanabilse de, insan akciğer epitelyal progenitör hücrelerinin kimliğine ilişkin bilgiler büyük ölçüde model organizmalardan ekstrapolasyona bağlı olmuştur. Bu nedenle, bu yöntemler, insan akciğer epitel hücre tiplerinin kimliğini ve davranışını, kök / progenitör hücrelerin düzenlenmesini araştıran çalışmaları ile ilişkilendirmek için bir köprü sağlar.

Protocol

İnsan akciğer dokusu, ölen doku bağışçılarından, Uluslararası Tıbbın İlerlemesi Enstitüsü (IIAM) tarafından geliştirilen ve Cedars-Sinai Tıp Merkezi İç İnceleme Kurulu tarafından onaylanan rıza prosedürlerine uygun olarak elde edilmiştir. 1. Akciğer hücrelerinin trakeo-bronşiyal veya küçük hava yolu/parankimal (küçük hava yolları ve alveoller) bölgelerinden izolasyonu için doku işleme Tüm diseksiyon aletlerini, cam eşyaları ve uygun çözeltil…

Representative Results

Kaynak akciğer dokusuTrakea ve ekstrapulmoner bronş (Şekil 1A) proksimal hava yolu epitel hücrelerinin ve sonraki jenerasyon proksimal organoidlerin izolasyonunda kaynak doku olarak kullanıldı. Hem parankimi hem de çapı 2 mm’den küçük küçük hava yollarını içeren distal akciğer dokusu (Şekil 1A), küçük hava yolu ve alveoler epitel hücrelerinin (distal akciğer epiteli) izolasyonu ve küçük hava yolu veya alveoler orga…

Discussion

Moleküler veya fonksiyonel analiz ve hastalık modellemesi için insan akciğer dokusundan tanımlanmış akciğer hücrelerinin alt popülasyonlarının izolasyonu için güvenilir bir yöntem tanımladık. Yöntemlerin kritik unsurları, taze izole edilmiş hücrelerin antikor aracılı zenginleştirilmesine izin veren yüzey epitoplarının korunması ile doku ayrışmasını sağlama yeteneğini ve bölgeye özgü epitel organoidlerinin verimli bir şekilde üretilmesi için kültür yöntemlerinin optimizasyonunu i…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

IFC ve H ve E boyama için Mizuno Takako’nun, doku kesiti için Vanessa Garcia’nın ve el yazması hazırlanmasına yardımcı olduğu için Anika S Chandrasekaran’ın desteğine teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) ve Celgene IDEAL Konsorsiyumu tarafından desteklenmektedir.

Materials

Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip Fisher scientific BD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip VWR BD302832
Biohazard bags VWR 89495-440
Biohazard bags VWR 89495-440
connecting ring Pluriselect 41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) sigma Aldrich DN25-1G
Disposable Petri dishes Corning/Falcon 25373-187
Funnel Pluriselect 42-50000
HBSS Corning 21-023
Liberase TM Research Grade sigma Aldrich 5401127001
needle 16G VWR 305198
needle 18G VWR 305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50070-51
Razor blades VWR 55411-050
Red Blood Cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS Octo Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS Columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand** Miltenyi Biotech 130-042-303
Thermomixer Eppendorf 05-412-503
Thermomixer Eppendorf 05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin B Thermo fisher scientific 15290018 2ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free Thermo fisher scientific AM9260G 500µl
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106 10ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml VWR 45000-456 500ml bottle
HEPES (1 M) Thermo fisher scientific 15630080 5ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture Thermo fisher scientific 15640055 5ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody BioLegend 369820 1:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set Fisher Scientific BDB552843
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935 20µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-045-801 20µl/ 107 total cells
DAPI Sigma Aldrich D9542-10MG 1:10000
FITC anti-human CD235a BioLegend 349104 1:100
FITC anti-human CD31 BioLegend 303104 1:100
FITC anti-human CD45 BioLegend 304054 1:100
FITC anti-mouse IgM Antibody BioLegend 406506 1:500
Mouse IgM anti human HT2-280 Terrace Biotech TB-27AHT2-280 1:300
PE anti-human CD271(NGFR) BioLegend 345106 1:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5 ATCC CCL-171
PneumaCult -ALI Medium Stemcell Technologies 5001
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium PromoCell C-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile Greiner Bio-One 662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) Stemcell Technologies 72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin B Thermo fisher scientific 15290018 50 µl
DMEM/F-12, HEPES ThermoFisher scientific 11330032 50 ml
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106 5 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) ThermoFisher scientific 41400045 500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture Thermo fisher scientific 15640055 500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) Stem cell 72234 5 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid based Vector H-3300 937 µl in 100ml water
Histogel Thermo Scientific HG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280 Terracebiotech TB-27AHT2-280 1:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) Thermo Fisher Scientific 14-9965-82 1:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody R and D systems MAB4218 1:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] Biolegend 905901 1:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) Thermo Fisher Scientific MA5-12178 1:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) LifeSpan Biosciences LS-C143022-100 1:300
Purified Mouse Anti-E-Cadherin BD biosciences 610182 1:1000
Sox-2 Antibody Santa Cruz biotechnologies sc-365964 1:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488 Thermo Fisher Scientific A-21206 1:500
FITC anti-mouse IgM Antibody BioLegend 406506 1:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-21113 1:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21121 1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21131 1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-21134 1:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-21144 1:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing Solution TBS with 0.1% Tween 20

Referanslar

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  3. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  4. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  5. Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
  6. Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
  7. Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
  8. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  9. Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
  10. McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
  11. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
  12. Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
  13. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
  14. Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
  17. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  18. Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  19. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  20. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
  21. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
  22. Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
  23. Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
  24. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  27. Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Konda, B., Mulay, A., Yao, C., Beil, S., Israely, E., Stripp, B. R. Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture. J. Vis. Exp. (161), e61541, doi:10.3791/61541 (2020).

View Video