Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.
Epitelyal organoid modelleri, bir organ sisteminin temel biyolojisini incelemek ve hastalık modellemesi için değerli araçlar olarak hizmet eder. Organoidler olarak yetiştirildiğinde, epitelyal progenitör hücreler kendi kendini yenileyebilir ve in vivo meslektaşlarınınkine benzer hücresel fonksiyonlar sergileyen farklılaştırıcı döller üretebilir. Burada, bölgeye özgü progenitörleri insan akciğerinden izole etmek ve deneysel ve doğrulama aracı olarak 3D organoid kültürler üretmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Akciğerin proksimal ve distal bölgelerini, bölgeye özgü progenitör hücreleri izole etmek amacıyla tanımlıyoruz. Toplam hücreleri akciğer ve trakeadan izole etmek için enzimatik ve mekanik ayrışmanın bir kombinasyonunu kullandık. Spesifik progenitör hücreler daha sonra, bazal hücreleri sıralamak için NGFR ve alveolar tip II hücreleri sıralamak için HTII-280 gibi hücre tipine özgü yüzey belirteçlerine dayanan floresan ilişkili hücre sıralama (FACS) kullanılarak proksimal veya distal orijinli hücrelerden fraksiyone edildi. 3D organoid kültürleri oluşturmak için izole bazal veya alveoler tip II progenitörler kullanıldı. Hem distal hem de proksimal progenitörler, 30. günde 5000 hücre/kuyu kaplandıklarında distal bölgede %9-13, proksimal bölgede %7-10 kolon oluşturan etkinliğe sahip organoidler oluşturdular. Distal organoidler kültürde HTII-280+ alveoler tip II hücrelerini korurken, proksimal organoidler 30. günde siliyer ve sekretuar hücrelere farklılaştı. Bu 3D organoid kültürler, akciğer epiteli ve epitel mezenkimal etkileşimlerinin hücre biyolojisini incelemek ve ayrıca bir hastalıkta epitel disfonksiyonunu hedefleyen terapötik stratejilerin geliştirilmesi ve doğrulanması için deneysel bir araç olarak kullanılabilir.
İnsan solunum sisteminin hava sahaları, sırasıyla gazların taşınmasına ve daha sonra epitel-mikrovasküler bariyer boyunca değişimine aracılık eden iletken ve solunum bölgelerine ayrılabilir. İletken hava yolları trakea, bronşlar, bronşiyoller ve terminal bronşiyolleri içerirken, solunum hava boşlukları solunum bronşiyolleri, alveoler kanallar ve alveolleri içerir. Bu hava sahalarının epitel astarı, fonksiyonel olarak farklı her bölgenin benzersiz gereksinimlerini karşılamak için proksimo-distal eksen boyunca kompozisyonda değişir. Trakeo-bronşiyal hava yollarının psödostratifiye epiteli, fırça, nöroendokrin ve iyonosit 1,2,3 dahil olmak üzere daha az miktarda hücre tipine ek olarak, bazal, salgı ve siliyer olmak üzere üç ana hücre tipinden oluşur. Bronşiyoler hava yolları, morfolojik olarak benzer epitel hücre tiplerini barındırır, ancak bolluklarında ve fonksiyonel özelliklerinde farklılıklar vardır. Örneğin, bazal hücreler bronşiyoler hava yollarında daha az bulunur ve salgı hücreleri, trakeo-bronşiyal hava yollarında baskın olan seröz ve kadeh hücrelerine karşı kulüp hücrelerinin daha büyük bir bölümünü içerir. Solunum bölgesinin epitel hücreleri, alveoler kanalların ve alveollerin alveoler tip I (ATI) ve tip II (ATII) hücrelerine ek olarak, solunum bronşiyollerinde kötü tanımlanmış bir küboidal hücre tipini içerir 1,4.
Her bölgede epitelin korunmasına ve yenilenmesine katkıda bulunan epitel kök ve progenitör hücre tiplerinin kimliği eksik tanımlanmıştır ve büyük ölçüde hayvan modellerinde yapılan çalışmalardan çıkarılmıştır 5,6,7,8. Farelerde yapılan çalışmalar, psödotabakatize hava yollarının bazal hücrelerinin veya bronşiyoler hava yollarının kulüp hücrelerinin veya alveoler epitelin ATII hücrelerinin, sınırsız kendini yenileme ve multipotent farklılaşma kapasitesine dayanan epitel kök hücreleri olarak işlev gördüğünü göstermiştir 7,9,10,11,12 . İnsan akciğer epitel hücre tiplerinin köklülüğünü değerlendirmek için genetik soy izleme çalışmalarının yapılamamasına rağmen, epitel kök ve progenitör hücrelerin fonksiyonel potansiyelini değerlendirmek için organoid bazlı kültür modellerinin mevcudiyeti, fare ve insan arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar için bir araç sağlamaktadır13,14,15,16,17.
Epitel hücre tiplerinin insan akciğerinin farklı bölgelerinden ve kültürlerinden izole edilmesi için bölgesel hücre tiplerini özetlemek için 3D organoid sistem kullanarak yöntemleri açıklıyoruz. Diğer organ sistemlerinden epitel hücrelerinin fonksiyonel analizi ve hastalık modellemesi için de benzer yöntemler geliştirilmiştir 18,19,20,21. Bu yöntemler, bölgesel epitel progenitör hücrelerinin tanımlanması, regülasyonlarını ve mikroçevrelerini araştıran mekanik çalışmalar yapmak, hastalık modellemesi ve ilaç keşfini sağlamak için bir platform sağlar. Hayvan modellerinde yapılan akciğer epitel progenitör hücreleri üzerine yapılan çalışmalar, in vivo veya in vitro analizden yararlanabilse de, insan akciğer epitelyal progenitör hücrelerinin kimliğine ilişkin bilgiler büyük ölçüde model organizmalardan ekstrapolasyona bağlı olmuştur. Bu nedenle, bu yöntemler, insan akciğer epitel hücre tiplerinin kimliğini ve davranışını, kök / progenitör hücrelerin düzenlenmesini araştıran çalışmaları ile ilişkilendirmek için bir köprü sağlar.
Moleküler veya fonksiyonel analiz ve hastalık modellemesi için insan akciğer dokusundan tanımlanmış akciğer hücrelerinin alt popülasyonlarının izolasyonu için güvenilir bir yöntem tanımladık. Yöntemlerin kritik unsurları, taze izole edilmiş hücrelerin antikor aracılı zenginleştirilmesine izin veren yüzey epitoplarının korunması ile doku ayrışmasını sağlama yeteneğini ve bölgeye özgü epitel organoidlerinin verimli bir şekilde üretilmesi için kültür yöntemlerinin optimizasyonunu i…
The authors have nothing to disclose.
IFC ve H ve E boyama için Mizuno Takako’nun, doku kesiti için Vanessa Garcia’nın ve el yazması hazırlanmasına yardımcı olduğu için Anika S Chandrasekaran’ın desteğine teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) ve Celgene IDEAL Konsorsiyumu tarafından desteklenmektedir.
Cell Isolation | |||
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
HBSS | Corning | 21-023 | |
Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
needle 16G | VWR | 305198 | |
needle 18G | VWR | 305199 | |
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
Razor blades | VWR | 55411-050 | |
Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
Equipment’s | |||
GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
Leica ASP 300s Tissue processor | |||
LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
HBSS+ Buffer | |||
Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
List of antibodies for FACS | |||
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
Composition of Organoid Culture mediums | |||
MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
Mouse Basal medium: | |||
Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
Primary Antibodies | |||
Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
Buffers | |||
Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |