Sıçan Karaciğer Nakli Modelinde Hemodinamik Değişiklikleri Simüle Ederek Organ İskemi-Reperfüzyon Yaralanması

İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) karaciğer nakli sonrası sık görülen bir komplikasyondur. Hepatik IRI, iskemi aracılı hücre hasarı ve karaciğer reperfüzyonunun anormal bozulmasını içeren patolojik bir süreçtir. Hepatik IRI ve lokal doğuştan gelen immün yanıt, klinik ortamdaki farklılıklara göre sıcak ve soğuk IRI olarak ayrılabilir¹. Sıcak IRI, genellikle karaciğer nakli, şok ve travma sonucu kök hücre yaralanması ile indüklenmiştir². Soğuk IRI, endotel hücrelerinin ve periferik dolaşımın neden olduğu karaciğer naklinin bir komplikasyonudur^3. Klinik raporlar hepatik IRI'nın erken organ yetmezliklerinin% 10'unun ile ilişkili olduğunu ve akut ve kronik ret insidansını artırabileceğini göstermiştir^4,5. Ek olarak, hepatik IRI ayrıca yüksek mortalite ile çoklu organ disfonksiyonu sendromlarına veya sistemik inflamatuar yanıt sendromuna neden olabilir⁶. Ekstrahepatik organ tutulumu olan hastalar hastanede daha uzun süre kalma, daha fazla para harcama ve daha kötü bir prognoza sahip olma eğilimindedir⁷. Komplikasyonların gelişimi karaciğer naklinin anhepatik fazının uzunluğu ile yakından ilgilidir⁸.

Sıçanlarda ortotopik karaciğer nakli (OLT) ilk olarak 1973 yılında Amerikalı profesör Lee tarafından bildirilmiştir. Deneysel operasyon, dikiş yöntemini kullanarak klinik karaciğer naklinin adımlarını ve kan damarlarının anastomozini ve ortak safra kanalını (CBD) simüle etti. Prosedür zor ve zaman alıcıdır düşük bir başarı oranı ile⁹. 1979'da Kamada ve arkadaşları, 26 dakika içinde anhepatik fazı kontrol etmek için portal damarın anastomoz için 'iki manşet yöntemini' yaratıcı bir şekilde kullanarak sıçanlarda OLT'de önemli bir gelişme yaptı¹⁰. Aynı yıl Zimmermann 'tek safra stenti yöntemini' önerdi. Lee'nin çalışmalarına dayanarak Zimmermann, donörün ve alıcının CBD'sini doğrudan anastomoz etmek için polietilen tüpler kullandı, CBD'nin yeniden inşasını basitleştirdi ve sfinkterin işlevini korudu ve bu yöntem OLT modellerinin safra rekonstrüksiyonu için standart haline geldi¹¹. 1980'de Miyata ve arkadaşları portal damar (PV), suprahepatik vena kava (SVC) ve intrahepatik vena kavanın (IVC) manşet yöntemiyle anastomoz edildiği 'üç manşet yöntemini' önerdi. Bununla birlikte, bu yöntemle damarın bozulma riski vardır, bu da inferior vena kava reflüsünün tıkanmasına yol açabilir¹². 1983'te, PV ve IVC'nin anastomoz için manşet yöntemi kullanılarak, ancak SVC¹³için dikiş yönteminin benimsenmesi için 'iki manşet yöntemi' önerildi. Bu yöntem olt modelleri oluşturmak için küresel olarak akademisyenler tarafından benimsenmiştir. O zamandan beri, manşet anastomoz adımları anhepatik fazı kısaltmak ve sıçanların hayatta kalma oranını iyileştirmek için geliştirilmiştir¹⁴. Benzer şekilde, klinik uygulamada anhepatik faz^15'ikısaltmak için geliştirilmiş yöntemler kullanılır. Bununla birlikte, karaciğer naklinden sonra IRI'ya yapılan temel araştırmalar, sağkalım oranının ekstrahepatik organların yaralanma derecesi ile ters ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, daha fazla araştırma yapılması ve karaciğer naklinden sonra IRI'yı simüle etmek için basit ve tekrarlanabilir bir hayvan modeline ihtiyaç vardır.

Anhepatik fazın tanımına dayanarak, karaciğer transplantasyonundaki hemodinamik değişiklikleri simüle ettik ve sıçanlarda ekstrahepatik organların IRI'sı ile sonuçlandı. Burada, karaciğer naklinden sonra IRI ile ilgili temel araştırmaları kolaylaştırmak için sıçanlarda anhepatik fazın (karaciğer iskemisi) bir hayvan modelinin nasıl inşa edeceğine dair ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz.

Hayvan Etik Kurulu, Guangxi Tıp Üniversitesi'nin (No20190920) deneyini onayladı. Tüm hayvanlar Guangxi Tıp Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi tarafından tedarik edildi. 25 ± 2°C oda sıcaklığında tutulan ve %50 ± 10 nem oranına sahip SPF erkek Sprague Dawley sıçanları (200-250 g, 10-12 hafta) kullandık. Beslenme operasyondan 24 saat önce durduruldu; ancak su sağlandı.

NOT: Bir operatör tüm ameliyatları mikrocerrahi temeli veya cerrahi mikroskop olmadan gerçekleştirebilir.

1. Operasyon

1. Tartımdan sonra, sıçanları izofluran ile uyuşturun (%5) bir hayvan anestezi makinesi kullanarak.
2. 1-2 dakika sonra, sıçanın toynaklarını cımbızla hafifçe kenetleyin. Sıçan çimdikledikten sonra yanıt vermezse, anestezi durumuna girmiştir. Kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhem kullanın. Sıçanların vücut sıcaklığını 37-38 ° C'de tutmak için hayvan ısıtma lambaları kullanın.
3. Karın dezenfeksiyonu (povidone iyot çözeltisi) sonrasında, sıçanı hayvan diseksiyon masasına sabitleyin. Dikinç ve makas kullanarak xiphoid işleminin 3 cm altında ortanca bir kesi yapın.
4. Karın boşluğunu açın, karaciğeri bir retraktör kullanarak ortaya çıkarın ve hepatogastrik bağı harekete geçirin. Karaciğerin orta lobunun hafifçe çevrilmek ve porta hepatis'i açığa çıkarmak için yukarı doğru çevirmek için pamuklu çubuklar kullanın. CBD, PV ve HA'yı tanımlayın.
5. İnce bağırsağı pamuklu çubuklar kullanarak sol alt karın boşluğuna doğru itin, ıslak gazlı bezle örtün ve intrahepatik vena kavayı sağ böbrek damarına taşıyın.
6. Portal damarı, hepatik arteri ve alt vena kavayı sağ böbrek damarının üzerinde göz içi lensi ve her biri kayma düğümü olan 3-0 ipek iplikle işaretlenmiş önseçimlerle izole edin.
7. Sol ve sağ alt ekstremite derisini kesin ve oftalmik toksinler kullanarak femoral damarı ortaya çıkarın. Tüm vücudu heparize etmek için femoral damardan düşük moleküler ağırlıklı heparin 625 IU/ kg'ı yavaşça enjekte edin.
8. Portal damarı, hepatik arteri ve alt vena kavasını 45 dakika süren 3-0 numaralı dikişlerle sağ böbrek damarının üzerinde lige alın (Şekil 1). Karın boşluğundaki ince bağırsağı değiştirin ve gazlı bezle örtün. Bu dönemlerde inhalasyon anesteziyi azaltın.
9. 45 dakika sonra, portal damarı, hepatik arteri ve sağ böbrek damarının üstündeki alt vena kavayı serbest bırakın.
10. Kası ve cildi kat kat dikin ve inhalasyon anestezisini sonlandırın. Her 4 saatte bir 5 mg/kg'lık deri altı morfin kullanarak postoperatif analjezi sağlayın.
11. Sıçanı uyanana kadar gözlemleyin ve 25 ± 2 ° C sıcaklık ve 50 ±% 10 nem altında besleyin. Hayvan ısıtma lambaları gereklidir.

Sıçanların karaciğer iskemisine toleransı
Bu hayvan modelinde, ameliyat sırasında kan damarlarının lige edildiği bölgeler Şekil 1'de gösterilmiştir. Sıçanlar rastgele 15 dakika (I15 grubu), 30 dakika (I30 grubu), 45 dakika (I45 grubu), 60 dakika (I60) ve sham grubu için 5 gruba ayrıldı ve her grupta 10 sıçan vardı. Her grubun sağkalım oranı operasyondan 14 gün sonra gözlendi. Tüm sıçanlar I15 grubunda, I30 grubunda ve sahte grupta hayatta kaldı. Sekizi I45 grubunda 14 gün, sadece 2'i I60 grubunda hayatta kaldı. Bu sonuçlar, sıçanların anhepatik fazı en fazla 45 dakika tolere edebileceğini göstermektedir (Tablo 1).

Vasküler ligasyonun sıçanlarda dolaşım üzerindeki etkileri
Deney sırasında Biosystems, anhepatik fazdan önce ve sonra kalp atış hızını ve kan basıncını (sağ iç karotid arter entübasyonu) kaydetti. Vasküler ligasyondan sonra sıçanların kalp atış hızının ve ortalama arteriyel basıncının (MAP) önemli ölçüde değiştiğini gördük (Şekil 2).

Ekstrahepatik organlar üzerindeki etkileri
Hepatik iskemi tıkanıklığı ve ödem ligasyondan sonra bağırsaklarda, mide varislerinde ve dalakta bulundu. Seksen sıçan rastgele 45 dakika (T0), 6 saat (T6), 12 saat (T12), 24 saat (T24), 48 saat (T48), 72 saat (T72), 7 gün (D7) ve 14 gün (D14) iskemi için 8 gruba ayrıldı. Sıçanlar kurban edildikten sonra böbrek, pankreas, ince bağırsak, kalp ve akciğerden doku alınarak hematoksilin-eozin (HE) ile boyandı. Tüm boyama işlemi beş adımdan oluşur: dewaxing, boyama, dehidrasyon, şeffaflık ve sızdırmazlık. Kalp dışında, patolojik puanlar daha önce açıklandığı gibi atandı16,17,18,19.

Ekstrahepatik organlara maksimum yaralanmaya kadar geçen süre değişti; pankreas için operasyondan 6-24 saat sonra ve akciğerler için 24-48 saatti. Bağırsak sistemi ve böbrek 45 dakikalık iskemiden sonra en ağır şekilde yaralandı. Ameliyattan 24 saat sonra bağırsak mukozasının belirgin bir anormalliği yoktu ve böbrekler 48 saat sonra iyileşti. Reperfüzyondan sonra, lokal miyokard hücre nekrozu, hücre parçalanması ve çözünmesi, inflamatuar hücre infiltişi ve lokal vazodilasyon ve tıkanıklık ameliyattan 24-48 saat sonra kalpte bulunmuştur(Şekil 3).

Akciğer
Otofofil infiltrasyon iskemi sonrası akciğer dokusunda bulundu. Reperfüzyon süresinin (T0,T6) artmasıyla akciğer dokusunda bronş lümeninin mukusu da görülebilir. İnflamatuar hücre infiltişi, ciddi şekilde kalınlaşan alveolar duvarda meydana geldi. Alveolar boşluğun çökmesi ve kaybolması da bazı dokularda bulunabilir. Alveolar duvarlarda önemli bir alveolar ödem veya kılcal tıkanıklık yoktu. Ameliyattan 24-48 saat sonra en ağır şekilde yaralandılar, bazı sıçanlar operasyondan 7 gün sonra dispne ve diğer belirtileri gösterdiler. HE boyama sonuçları hava yolunda lenfadenit, alveolar duvarda hafif inflamatuar hücre infiltişi ve lokal kanama önerdi (Şekil 3A, Şekil 4).

Böbrek
Faz T0'da iskemi sonrası renal tübüllerde az miktarda eozinofilik madde bulundu, ancak inflamatuar hücre infiltrasyon ve diğer anormallikler görülmedi. Ancak operasyondan 6-48 saat sonra şişmiş renal tübüler epitel hücreleri, gözenekli veya vakuolasyonlu sitoplazma, az sayıda lümenli nekrotik hücreler, karyopikoz, parçalanma, fırça sınır kaybı ve tüp şeklindeki asidik grup görüldü. Ayrıca granül dejenerasyon ile az sayıda renal tübüler epitel hücresi, operasyondan 48 saat sonra ise gözenekli ve hafif lekeli sitoplazma görüldü. Anlamlı interstisyel telanjiektazi, ancak şiddetli inflamatuar hücre infiltüsü bulunamadı (Şekil 3B, Şekil 5).

İnce bağırsak
İnce bağırsak iskemiden (T0) sonra en ağır şekilde yaralandı. Şiddetli inflamatuar hücre infiltrasyon, mukoza epitel dökülmesi ve telanjiektazi vardı. Reperfüzyon süresinin artmasıyla, yaralanma hızlı bir şekilde iyileşti. Mukozal epitel operasyondan 24 saat sonra tamamen restore edildi ve sadece hafif inflamatuar hücre infiltrasyon görüldü(Şekil 3C, Şekil 6).

Pankreas
Şiddetli inflamatuar hücreler faz T0'da pankreas dokusunun etrafına sızdı. Ancak pankreas lezyonları tek tip değildi. 10 kişiden 6'sına ameliyattan 24 saat sonra pankreas nekrozu ve inflamatuar infiltrasyon, diğer 4'inde ise belirgin bir anormallik yoktu. Operasyondan yirmi dört saat sonra, enflamatuar hücrelerin infiltrasyonuna ek olarak, ödem, interlobüler uzayın genişlemesi, kanama, az sayıda acınar hücrenin nekrozu, hücrelerin belirsiz sınırlanması, nükleer parçalanma ve çözülme ve görme alanında hafif inflamatuar hücre infiltonu vardı. Daha sonra, iltihap yavaşça kayboldu (Şekil 3D, Şekil 7 ).

Kalp
Faz T0 ile kardiyak miyositler düzenli olarak açık sınırlama, normal hücre morfolojisi, lokal geçiş tıkanıklığı ve hafif kahverengi-sarı pigment birikimi ile düzenlenmiştir. Ayrıca miyokard interstisyel ve pervasküler bölgelerde inflamatuar hücre infiltonu gözlendi. Reperfüzyon süresinin artmasıyla ameliyattan 24-48 saat sonra dokularda lokal miyokard hücre nekrozu, hücre parçalanması ve çözünmesi, inflamatuar hücre infiltişi, lokal vazodilasyon ve tıkanıklık bulundu. Bazı örneklerde ventriküler dilatasyon, gözenekli yapı, artmış miyokard interstisyumu ve hafif inflamatuar hücre infiltrasyonu görüldü. 48 saat sonra lokal kardiyomiyositler kayboldu ve hafif inflamatuar hücre infiltrasyonlu az miktarda lifli bağ dokusu ile değiştirildi. O zamana kadar başka belirgin anormallik görülmedi(Şekil 8).

Hemodinamik değişikliklerin karaciğer, böbrek, pankreas ve kalp serolojik indeksleri üzerindeki etkileri
Serum toplandı ve otomatik biyokimyasal analizör tarafından alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz(AST), kreatinin ve amilaz düzeyleri saptandı. Tüm göstergeler patolojik değişikliklerin aksine 24-48 saatte zirve yaptı. Ameliyattan 48 saat sonra bu seviyeler normal olmasına rağmen patolojik hasar devam etti(Şekil 9).

Şekil 1: Ligatürün yeri: PV, HA, IVC sağ renal damarın üst kısmı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Sıçanların karaciğer iskemisine toleransı

Şekil 2: I45 dk grubunda hemodinamik değişiklikler. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Organ histolojisi puanları. (A) akciğer; (B) böbrek; (C) bağırsak; (D) pankreas; *Sham grubuna göre istatistiksel olarak anlamlıdır (P < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Operasyon sonrası akciğerlerde patolojik değişiklikler. (A) Sham grubu; (B) İskemi grubu (T0 grubu); (C) Reperfüzyon 6 saat (T6) grubu; (D) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (E) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (F) Reperfüzyon 24 saat (T24) grubu; (G) Reperfüzyon 48 saat (T48) grubu; (H) Reperfüzyon 7 gün (D7) grubu; (I) Reperfüzyon 14 gün (D14) grubu (ölçek 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Operasyon sonrası böbreklerde patolojik değişiklikler. (A)Sham grubu; (B) İskemi grubu (T0 grubu); (C) Reperfüzyon 6 saat (T6) grubu; (D) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (E) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (F) Reperfüzyon 24 saat (T24) grubu; (G) Reperfüzyon 48 saat (T48) grubu; (H) Reperfüzyon 7 gün (D7) grubu; (I) Reperfüzyon 14 gün (D14) grubu (ölçek 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Operasyondan sonra ince bağırsakta patolojik değişiklikler. (A) Sham grubu; (B) İskemi grubu (T0 grubu); (C) Reperfüzyon 6 saat (T6) grubu; (D) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (E) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (F) Reperfüzyon 24 saat (T24) grubu; (G) Reperfüzyon 48 saat (T48) grubu; (H) Reperfüzyon 7 gün (D7) grubu; (I) Reperfüzyon 14 gün (D14) grubu (ölçek 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Operasyondan sonra pankreastaki patolojik değişiklikler. (A) Sham grubu; (B) İskemi grubu (T0 grubu); (C) Reperfüzyon 6 saat (T6) grubu; (D) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (E) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (F) Reperfüzyon 24 saat (T24) grubu; (G) Reperfüzyon 48 saat (T48) grubu; (H) Reperfüzyon 7 gün (D7) grubu; (I) Reperfüzyon 14 gün (D14) grubu (A ve D ölçeği 50 μm; BCEFGHI ölçeği 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Operasyon sonrası kalpte patolojik değişiklikler. (A) Sham grubu; (B) İskemi grubu (T0 grubu); (C) Reperfüzyon 6 saat (T6) grubu; (D) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (E) Reperfüzyon 12 saat (T12) grubu; (F) Reperfüzyon 24 saat (T24) grubu; (G) Reperfüzyon 48 saat (T48) grubu; (H) Reperfüzyon 7 gün (D7) grubu; (I) Reperfüzyon 14 gün (D14) grubu (Bir ölçek 50 μm; BCDEFGHI ölçeği 100 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Her grupta ALT, AST, kreatinin (Cr) ve amilaz değişiklikleri; *Sham grubuna göre istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu makalenin yazarlarının açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.