Özet

3D Sferoid Modelinde Zaman Çözülen Floresan Görüntüleme ve Kanser Hücre İstilasının Analizi

Published: January 30, 2021
doi:

Özet

Burada bir küresel görüntüleme cihazının üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu cihaz kanser hücre sferoidlerinin dinamik veya boyuna floresan görüntülemesini sağlar. Protokol ayrıca kanser hücre invazyonunun analizi için basit bir görüntü işleme prosedürü sunmaktadır.

Abstract

Birincil tümörden kanser hücrelerinin bitişik sağlıklı dokulara istilası metastazda erken bir adımdır. İnvaziv kanser hücreleri büyük bir klinik zorluk oluşturur, çünkü yayılmaları başladıktan sonra ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem yoktur. Kanser hücre invazyonunu düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine yol açabilir. Tümörlere fizyolojik benzerlikleri nedeniyle, kollajene gömülü sferoidler, kanser hücresi istilasını hücre dışı matrise (ECM) yöneten mekanizmaları incelemek için araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu test (1) küresellerin ECM’ye gömülmesi üzerinde kontrol eksikliği ile sınırlıdır; (2) kollajen I ve cam alt yemeklerin yüksek maliyeti, (3) antikorların ve floresan boyaların verimsiz penetrasyonu ve (4) verilerin zaman alıcı görüntü işlemesi ve nicelemesi nedeniyle güvenilmez immünofluoresan etiketleme. Bu zorlukları ele almak için, üç boyutlu (3D) küresel protokolü, kollajen I’e gömülü floresan etiketli kanser hücrelerini zaman atlamalı videolar veya boyuna görüntüleme kullanarak görüntülemek ve kanser hücresi istilasını analiz etmek için optimize ettik. İlk olarak, sferoidleri güvenilir bir şekilde ve minimal bir kollajen I hacmine gömmek için bir küresel görüntüleme cihazının (SID) imalatını tarif ediyoruz ve test maliyetini azaltıyoruz. Daha sonra, canlı ve sabit küresellerin sağlam floresan etiketlemesi için adımları tanımlamaktadır. Son olarak, görüntü işleme ve veri nicelemesi için kullanımı kolay bir Fiji makrosu sunuyoruz. Tamamen, bu basit metodoloji kollajen I’de kanser hücresi invazyonunu izlemek için güvenilir ve uygun fiyatlı bir platform sağlar. Ayrıca, bu protokol kullanıcıların ihtiyaçlarına uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir.

Introduction

Kanserin ilerlemesi sırasında, kanser hücreleri hareketli ve invaziv bir fenotip elde edebilir, tümör kütlesinden kaçmalarını ve çevre dokulara istila etmelerini sağlar1. Sonunda, bu invaziv kanser hücreleri ikincil organların içine ulaşabilir ve büyüyebilir, kanser metastazı1. Metastaz kansere bağlı ölümlerin% 90’ından fazla neden olur2. Bunun bir nedeni, lokalize tümörler klinik olarak yönetilebilir olsa da, metastatik yayılma meydana geldikten sonra invaziv kanser hücrelerinin ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem bulunmamasıdır. Bu nedenle, invaziv kanser hücrelerinin ortaya çıkması ve lokalize bir hastalıktan invaziv bir hastalığa geçiş büyük bir klinik zorluk oluşturmaktadır. Kanser hücrelerinin invaziv bir davranışı nasıl başlattığını ve sürdürdüğünü belirlemek, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine neden olabilir.

3D küresel model, kontrollü, ancak fizyolojik olarak ilgili koşullar altında kanser hücrelerinin hareketli davranışlarını araştırmak için ideal bir platformdur3. Gerçekten de, bu testte, kanser hücrelerinin küreselleri hücre dışı matrisin (ECM), örneğin basitleştirilmiş bir tümörü taklit eden kollajen I’in içine gömülür. Daha sonra, görüntüleme, kanser hücrelerinin sferoidden kollajen matrisine invazyonunun görselleştirilmesi için kullanılır. Ancak, birden çok zorluk bu yordamı sınırlar.

İlk zorluk, sıvı kollajen matrisinin çanak yüzeyine yayılabileceği ve küreselin yemeğin dibine dokunmasına neden olan gömme adımında gerçekleşir. Sonuç olarak, küreselden gelen hücreler iki boyutlu (2D) yüzeye yayılır ve üç boyutlu (3D) küresel morfolojiyi kırır. Kollajen hacmini artırmak verimli, ancak maliyetli bir çözümdür. Hücrelerin 2D yüzeye yayılmasını önlemek için, minimum miktarda kollajen korurken, 1 mm kalınlığında, 3 delikli bir polidimetilsiloksan (PDMS) kesici ucu cam bir alt kabın üzerine bağlayarak bir küresel görüntüleme cihazı (SID) geliştirdik.

Küresel testin ikinci zorluğu, sferoid boyutu ile artan bir etki olan antikorların ve floresan boyaların zayıf penetrasyonu ile sınırlı olan sferoidlerdeki kanser hücrelerinin etiketlenilmesidir. Hücreleri etiketlemek için ideal çözüm, floresan proteinleri(leri) kasten ifade eden hücre hatlarının kurulması olsa da, bu seçenek çoğunlukla ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarıyla sınırlıdır ve floresan protein chimeras mevcudiyeti ile sınırlıdır. Burada, sabit sferoidlerin immünofluoresans boyanmasının yanı sıra, küreseli gömmeden hemen önce hücreleri etiketlemek için sitoplazmik bir boyanın verimli kullanımı için optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz.

Küresel testlerin üçüncü zorluğu, zaman içinde hücre istilasının yarı otomatik ölçülmesi için basit Fiji makrolarının olmamasıdır. Bu zorluğu ele almak için, zaman içinde küresel alanı analiz etmek için basit bir metodoloji açıklıyoruz. Örnek olarak 4T1 ve 67NR hücre çizgilerini kullanarak bu protokolün avantajlarını gösteriyoruz.

Protocol

1. Küresel gömmeyi optimize etmek için bir Küresel Görüntüleme Cihazının (SID) imalatı (Süre 1 gün) Aralayıcıyı bir 3D yazıcı kullanarak oluşturun (Şekil 1A, B ve Tamamlayıcı Dosya 1). Polidimetilsiloksan (PDMS) oluşturmak için plastik bir kapta 10:1 (wt/wt) taban polimer:çapraz bağlantı oranını [örneğin, 20 g etilbenzen baz polimer ve 2 g silikon reçine çaprazlayıcı] tartın. PDMS çözeltisini tek kullanımlı…

Representative Results

Biyouyumluluğu nedeniyle PDMS, mikropatterning ve mikroakışkan cihazlarda devrim yapan hapsedici kuyuların, pulların ve kalıpların mikrofabrikasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada açıklanan yöntemde, Sferoid gömme ve görüntüleme prosedürünü optimize eden SID’ler, özelleştirilebilir kuyular oluşturmak için kullanılır. Şekil 1, SID’lerin imalatında kullanılan ana bileşenleri göstermektedir. PDMS kalıbını dökmek için, 1 mm kalınlığında bir a…

Discussion

3D baskılı aralayıcı, deneysel uygulamaların gerektirdiği şekilde, pdms’nin çeşitli şekillerini kolayca oluşturmak için kullanılabilecek 1 mm kalınlığında PDMS sayfaları oluşturmak için tasarlanmıştır. İmalatının basitliği ve tasarımı değiştirme özgürlüğü nedeniyle, SID’nin ilk tasarımı için bu PDMS döküm yöntemi seçildi. Yüksek hacimli SID’ler gerekiyorsa, zaten üç eşit aralıklı deliği olan PDMS diskleri içeren 3D baskılı bir kalıp oluşturularak ve işlem tek adıma…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Temple Bioengineering üyelerine değerli tartışmalar için teşekkür ederiz. Akış sitometri çekirdeğinden (Lewis Katz Tıp Fakültesi) David Ambrose’a hücre ayıklama konusundaki yardımı için ve IDEAS Hub’dan (Mühendislik Koleji, Temple Üniversitesi) Tony Boehm’e 3D baskı konusunda yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca finansman kaynaklarımıza da teşekkür ediyoruz: Amerikan Kanser Derneği Araştırma Bursiyeri Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Genç Araştırmacı Ödülü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, R00 CA172360 ve R01 CA230777, hepsi BG’ye.

Materials

1 N NaOH Honeywell Fluka 60-014-44
10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) Gibco SH30028.LS
16% paraformaldehyde (PFA) Alfa Aesar 43368-9M
1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012027
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D1306
48-well plate Falcon T1048
Alexa Fluor 647 phalloidin Life Technologies A20006
Anti cortactin antibody Abcam ab33333 1 to 200 dilution
Anti E-cadherin antibody Invitrogen 13-1900 1 to 100 dilution
Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) Advanced Biomatrix 501050ML
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A4503-50G
CellTracker Red CMTPX Dye Invitrogen C34552
Conical tubes Falcon 352095
Coverslips FisherBrand 12-548-5E
Disposable container Staples Plastic cups
Disposable transfer pipette Thermo Scientific 202
DMEM Fisher Scientific 11965118
Double-faced tape Scotch
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500ML
Fetal bovine serum (FBS) Bio-Techne S11550
Fluoromount-G eBioscience 00-4958-02
Glutaraldehyde Sigma Aldrich G5882-100mL
Hoescht nuclear stain Thermo Fischer 62249
Isopropanol Thermo Fischer S25371A
MatTek dish (glass bottom dish) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Methyl cellulose Sigma Aldrich M6385-100G
MilliQ water
Penicilin/streptomycin solution Thermo Fischer 15140122
Petri dish Corning 353003
Pipet tips Fisherbrand 02-707
Pipets Gilson F167300
Poly-L-Lysine Sigma P8920
Primary antibodies, user specific
Rat Tail Collagen I Corning 47747-218
Razor Blade Personna 74-0001
Secondary antibodies, user specific
Slides Globe Scientific 1354W-72
Sylgard 184 Silicone Dow Corning 4019862
Tape Scotch
Triton X100 Sigma Aldrich 10789704001
Tween 20 Sigma Aldrich 655204-100ML

Referanslar

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  2. Noone, A., et al. . SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
  3. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  4. Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
  5. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
  6. Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
  7. Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
  8. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  9. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  10. Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
  11. Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
  12. Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V., Dmitriev, R. I. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).
  13. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Perrin, L., Tucker, T., Gligorijevic, B. Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model. J. Vis. Exp. (167), e61902, doi:10.3791/61902 (2021).

View Video