Özet

Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Published: November 09, 2020
doi:

Özet

Burada, bir çapraz bağlayıcı varlığında gliserol gradyan santrifüjleme olan Grafix’in (Gradyan Fiksasyonu), spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanımını açıklıyoruz.

Abstract

Pre-mRNA birleştirme, karmaşık bileşenlerin montajı, RNA işlemesi ve serbest bırakılması sırasında spliceosome alt komkomplexlerinin birçok moleküler yeniden düzenlenmesini içeren çok dinamik bir süreçtir. Gliserol gradyan santrifüjleme fonksiyonel ve yapısal çalışmalar için protein veya RNP (RiboNucleoProtein) komplekslerinin ayrılması için kullanılmıştır. Burada, ilk olarak tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi için makromoleküler kompleksleri arındırmak ve stabilize etmek, spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için geliştirilen Grafix’in (Gradyan Fiksasyonu) kullanımını açıklıyoruz. Bu yöntem, kompleksleri stabilize etmek için numunelerin artan bir sabitleme reaktif konsantrasyonuna santrifüjlenmesine dayanmaktadır. Gliserol gradyanlarına yüklenen maya toplam özlerinin santrifüjlenmesinden sonra, geri kazanılan fraksiyonlar spliceosome alt komplekslerinin tanımlanması ve bireysel birleştirme faktörlerinin varlığının belirlenmesi için nokta lekesi ile analiz edilir.

Introduction

Birleştirme, çok sayıda faktörün koordineli bir şekilde bağlanmasını ve serbest bırakılmasını gerektiren son derece dinamik bir işlemdir. Bu birleştirme faktörleri arasında RNA bağlayıcı proteinler, ATPases, helicases, protein kinazları ve fosfatazlar, ubiquitin ligases, diğerleri arasında1,2,3; ve moleküler yeniden düzenlemelerin gerçekleşmesine izin vermek için, bu faktörlerin bazıları çok geçici olarak spliceosome alt komitelerine bağlanır ve bu RNP ara komplekslerinin izolasyonu ve tanımlanmasını çok zorlaştırır.

İşte, Grafix yöntemi4,5’i, maya birleştirme faktörü Cwc24’ün Bact complex6 ile etkileşimini stabilize etmek için kullandık, bu alt sıkıştırıcıya birlikte bağlı diğer faktörlerin tanımlanmasına izin vermek ve ubiquitin ligase Prp19, Cwc24’ün on dokuz (NTC) kompleksine bağlanmasında veya serbest bırakılmasında ve aktivasyondan önce intronun 5′ ucuna kadar herhangi bir rol oynar ve ilk transesterifikasyon reaksiyonu alır yer. Makromolekülleri gliserol gradyanı boyunca artan bir çapraz bağlantı konsantrasyonuna maruz kalmanın avantajı, kompleksler arası çaprazbağlantılardan 4,5ve dolayısıyla agregaların oluşumunu önlemesidir.

Bu yöntem, büyük komplekslerin izolasyonuna izin vermesine rağmen, büyük dinamik kompleksler içinde geçici etkileşimleri sürdürmek için güvenilir olmayabileceği protein koimmunoprecipitation ve çekme tahlillerinin tamamlayıcısı olarak kullanılmıştır7,8. Gliserol gradyanındaki fiksasyon reaktiflerinin kullanımı, bu faktörlerin bağlanmasını stabilize ederek, belirli proteinlerin birleştirme altcomplexes ile etkileşimlerinin onaylanmasını sağlar. Seçilen çapraz bağlantı kimyasal olarak geri döndürülemez olduğundan, geri kazanılan fraksiyonlarda bulunan proteinler gradyan santrifüjlemeden sonra nokta lekesi ile analiz edildi.

Protocol

1. Maya toplam özü hazırlığı 1 L YNB-glu ortam (%2 m/v glikoz ile desteklenmiş Maya Nitrojen Temeli)9’da TAP etiketine kaynaşmış birleştirme faktörlerinden birini uygun amino asitler veya çekirdek bazlarla ifade eden maya hücrelerini büyütün, Bu durumda, adenin (20 μg/mL), lösin (30 μg/mL), triptofan (30 μg/mL), OD600 = 1.0’a kadar. 1 L kültüründen hücreleri 17.000 x g’da üç adet 500 mL santrifüj şişesinde 4 °C’de 10 dakika san…

Representative Results

Cwc24-TAP’ın sedimantasyon profilini analiz etmek ve Grafix yönteminin birleştirme altkompanlarına bağlanmasını stabilize etmek için etkili olup olmadığını belirlemek için, Cwc24-TAP’ı ifade eden hücrelerin toplam maya özlerini gliserol gradyanları üzerinde santrifüjleme yoluyla, çapraz bağlama ajanı olarak glutaraldehitin varlığında veya yokluğunda ayırdık. Yirmi dört 500 μL fraksiyon örnekleri daha sonra TAP etiketinin CBP kısmına karşı antikor içeren yuva lekesi ile analiz edildi. S…

Discussion

Protein-protein ve ribonik asitler-protein etkileşimleri çapraz bağlama ajanları kullanılarak stabilize edilebilir. Elde eden kompleksin gliserol gradyanı üzerinde ultrasantrifüjasyona dayanacak şekilde kararlı olması önemlidir. Ayrıca, arabellek koşulları etkileşime izin vermeli, ancak belirli olmayan bağlamayı önlemek için yeterince katı olmalıdır. Burada gösterilen deneylerde, in vitro birleştirme reaksiyonları için önceden kurulmuş bir tampon çözeltisi kullandık15</su…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma bir FAPESP hibesi (15/06477-9) tarafından desteklendi.

Materials

Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Millipore 07-482
ECL anti-Rabbit IgG GE Healthcare NA934
EconoSystem Bio-Rad 1-800-424-6723 Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
Fraction Recovery System Beckman Coulter 270-331580 Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip Biocomp 107-201M
Mixer Mill MM 200 Retsch 207460001 Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex Thermo Scientific 096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific 36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX Hitachi 901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) Beckman Coulter 344059

Referanslar

  1. Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
  2. Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
  3. Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
  4. Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
  5. Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
  6. Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
  7. Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
  8. Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
  11. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
  12. Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).
  13. Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
  14. Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
  15. Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. Yeast mRNA splicing in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Carvalho, F. A., Barros, M. R. A., Girotto, T. P. F., Perona, M. G., Oliveira, C. C. Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes. J. Vis. Exp. (165), e61994, doi:10.3791/61994 (2020).

View Video