Tüm hayvan deneyleri, Kanton Etik Komisyonu Zürih ve ETH Zürih Moleküler Sağlık Bilimleri Enstitüsü’ndeki EPIC hayvan tesisinin standartlarına ve yönetmeliklerine uygun olarak ZH152/17 lisansı altında gerçekleştirildi. NOT: Bu protokol, H19- ve IG-DMR’lerin fazEZ’lerde silinmesiyle başlar. PhaESC hatlarının nasıl oluşturulana ilişkin ayrıntılar için lütfen yayınlananraporlar 10,13’e bakın. Şekil 1A’dabu protokole genel bir bakış ve zaman dilimi (adım 1–14) verilmiştir; ortam, çözümler ve arabellekler Tablo 1’de listelenmiştir. DKO-phaESC hatları kurma prosedürü (adım 1–6) Şekil 1B’degösterilmiştir ve yarı klonlanmış embriyolar oluşturma stratejisi (adım 7-14) Şekil 1C’degösterilmiştir. 1. Fagislerde H19-DMR ve IG-DMR’nin silinmesi için plazmidlerin transfeksiyonu Cas9 çekirdeklerinin birlikte ifade etmesi için CRISPR/Cas9 plazmidleri hazırlayın ve RNA’ları H19-DMR ve IG-DMR’nin hedef silmelerine yönlendirin. Dört çift kılavuz RNA oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, Tablo 2’delistelenen R ) pX330 plazmidlerine.NOT: Bu 4 CRISPR/Cas9 plazmidlerinin hazırlanması için ayrıntılı prosedür hakkında yayınlanan protokole bakın14. Alternatif olarak, genel fare suşları için mevcut plazmidlere bir depodan da erişilebilir (Malzeme Tablosu). 6 kuyulu bir plakanın yüzeyini 10 dakika boyunca 37 °C’de inkübasyonla% 0,2 jelatin çözeltisinin 1 mL’si ile kaplayın. Plaka 2 × antibiyotiksiz haESC ortamında jelatin kaplı kuyuda10 5 wildtype faesc ve plakayı 1 gün boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C’de kuluçkaya yatırın.NOT: Antibiyotikler, sonraki lipofeksiyonun verimliliğini artırmak için ortamdan atlanır. 10. geçitte wildtype fadezleri kullandık. Erken geçiş falcleri kullanmanızı öneririz, ancak çeşitli geçiş numarası başarıyla kullanılmıştır8. Yarı klonlanmış embriyo ve farelerin elde edilmesi için geçiş sayısı ve verimliliği arasındaki korelasyon şu anda bilinmemektedir. Lipofeksiyon reaktifi kullanılarak aynı anda 6 plazmid ile 6 kuyu plakasının kuyusunda (adım 1.3’ten) transfect fazlar: CAG-EGFP transgene taşıyan 50 ng piggyBac plazmid, 50 ng piggyBac transposase plazmid ve 4 CRISPR/Cas9 plazmidlerinin her birinin 600 ng’si (adım 1.1’den itibaren). Transfection’ın ayrıntılı prosedürü hakkında üreticinin protokolüne bakın.NOT: Gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) her yerde ekspresyonu için bir transpozonu faesklerin genomuna entegre etmek için iki piggyBac plazmid kullanılır. Hücrelerin GFP işareti gerekli değilse, bu iki plazmid, pX330 plazmidlerinden biri yerine floresan proteinlerin (örneğin, pX458 plazmid) geçici ekspresyumu için crispr/cas9 plazmid ile değiştirilebilir. Geçici EGFP ifadesi daha sonra transfected hücreleri sıralamak için kullanılabilir. Transfeksiyondan iki gün sonra, ortamı aspire edin ve 800 μL tripsin ekleyin. Plakayı 37 °C’de% 5 CO 2 atmosferinde5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından, trypsin’i söndürmek için 2 mL yıkama tamponu ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için birkaç kez pipet ekleyin. Hücre süspansiyonu 15 mL’lik bir tüpe aktarın. Tüpü 5 dakika boyunca 160 x g’da santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Hücre peletini 15 μg/mL Hoechst 33342 ile desteklenmiş 400 μL haESC bakım tamponunda yeniden biriktirin.NOT: Hoechst 33342’nin potansiyel toksisitesini azaltmak için 15 μg/mL Hoechst 33342 15 yerine 1 μg/mL Hoechst 33342 ve50μM verapamil kullanılmıştır. Hücre süspansiyonu 37 °C’de% 5 CO2 atmosferinde 15 dakika boyunca kuluçkaya yaslanın. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonunu bir hücre süzgeç kapağından 5 mL’lik bir tüpe aktarın ve tüpü bir sonraki adımda kullanıma hazır olana kadar 4 °C’de tutun (bölüm 2). 2. Bir akış sitometresi kullanarak transfected fadesklerin tek hücreli kaplaması Transfected faesklerin sıralanmadan bir gün önce, MEF ortamında 4 ×10 4 hücre/cm 2 yoğunlukta jelatin kaplı 96 kuyu plakalarında plaka ışınlanmış fare embriyonik fibroblastları (MEF’ler). Tipik olarak, hedeflenen silmelere sahip bir phaESC hattı kurmak için 6 plaka hazırlanır. Plakaları %5 CO2 atmosferde 37 °C’de kuluçkaya yatırın.NOT: Işıtılmış MEF’ler ticari olarak mevcuttur. DR4 farelerinin E12.5 embriyolarından elde edilen MEF’leri kullanıyoruz. HemECC’ler JELATIN kaplı plakalarda MEF’ler olmadan büyüyebilse de, sıralanmış tek HEMEC’lerin uygulanabilirliğini artırmak için MEF’leri öneririz. Sıralama gününde, MEF ortamını 96 kuyu plakalarından epire edin ve kuyu başına 120 μL taze haESC ortamı ekleyin. Plakaları %5 CO2 atmosferde 37 °C’de tutun. Üreticinin talimatlarına göre 100 μm nozüllü bir hücre sıralayıcısı kurun. Hoechst 33342 ve EGFP floresanlarının çıkarılması için sırasıyla 355 nm UV lazer ve 488 nm mavi lazer kullanılmaktadır.NOT: Alternatif olarak, Hoechst 33342 405 nm ile ekscitasyon ile tespit edilebilir. G1/S fazında EGFP ekspresyonını gösteren haploid hücrelerini toplamak için bir kapı kullanarak 5 mL tüpteki (adım 1.10’dan itibaren) transfected fadezleri sıralayın. Adım 2.2’den itibaren 96 kuyu plakalarının her kuyusuna tek bir hücre koyun.NOT: Hoechst 33342 boyamasının tespiti genellikle G1 fazındaki haploid hücrelere, G2/M fazındaki haploid hücrelerin ve G1 fazındaki diploid hücrelerin ve G2/M fazındaki diploid hücrelerin bir karışımına karşılık gelen 1n, 2n ve 4n DNA içeriğine sahip 3 hücre tepe noktasını ayırır. G1/S fazındaki haploid hücreler Hoechst 33342 floresan düşük yoğunluklu zirve olarak tanımlanır. Şekil 2A’datemsili bir sonuç ve sıralama kapısı gösterilmiştir. Kaplamadan sonra, 96 kuyu plakalarını% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C’de kuluçkaya yatırın. 3. Transfected phaESC’lerin alt klonlama Tek hücreli kaplamadan üç gün sonra, koloniler mikroskop altında 96 kuyu plakalarının birkaç kuyusunda gözlemlenebilir. Sadece tek kolonilerin büyüdüğü kuyuları işaretleyin.NOT: Deneyimlerimize göre, 96 kuyu plakalarının kuyularının% 20-40’ında tek koloniler gözlenmiştir. Tek hücreli kaplamadan sonraki 4. günde, kuyulardaki ortamın yarısını yeni haESC ortamıyla tek kolonilerle değiştirin. Geçmeden bir gün önce (tek hücreli kaplamadan sonra 4 veya 5. günde), plaka MEF’leri JELATIN kaplı 96 kuyu plakalarına MEF ortamında 4 × 104 hücre/cm2 yoğunlukta ışınladı. Plakaları %5 CO2 atmosferde 37 °C’de tutun. 5 veya 6 günlük tek hücreli kaplamadan sonra, çapı 150 μm’den büyük tek koloniler içeren 96 kuyu plakalarının kuyularını seçin.NOT: Hedeflenen DMR silmeleri ile bir phaESC hattı oluşturmak için tercihen yaklaşık 100 kuyu seçilir. Seçilen kuyulardaki ortamı aspire edin ve 30 μL tripsin ekleyin. 96 kuyu plakalarını 37 °C’de% 5 CO 2 atmosferinde5 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, trypsin’i söndürmek için her kuyuya 30 μL yıkama tamponu ekleyin. Her kuyuya 140 μL haESC ortamı ekleyin ve tek hücre elde etmek için birkaç kez pipet ekleyin. MEF ortamını adım 3.3’te hazırlanan 96 kuyu plakalarının kuyularından aspire edin. Her kuyudaki fazları adım 3.6’dan 3.7 adımından yeni 96 kuyu plakasının yeni bir kuyusuna aktarın. 37 °C’de phaESC alt muhafazaları içeren 96 kuyu plakalarını %5 CO2 atmosferde kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, her kuyudan tüm ortamı aspire edin ve 120 μL yeni haESC ortamı ekleyin. Plakaları %5 CO2 atmosferde 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Hücreler geçiş için birleştiğinde, ışınlanmış MEF’leri jelatin kaplı 24 kuyu plakalarına MEF ortamında 4 × 104 hücre/cm2 yoğunlukta plakalayın. Plakaları %5 CO2 atmosferde 37 °C’de tutun. FazEZ’ler pas geçmek için birleştiğinde, ortamı aspire edin ve 30 μL tripsin ekleyin. 96 kuyu plakalarını 37 °C’de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Trypsin’i söndürmek için her kuyuya 90 μL yıkama tamponu ekleyin. Tek hücre elde etmek için birkaç kez pipet. MEF ortamını adım 3.11’den itibaren 24 kuyu plakalarının kuyularından aspire edin ve 600 μL taze haESC ortamı ekleyin. 3.13 adımındaki her bir kuyudan phaESC altclones süspansiyonunun 60 μL’lik kısmını adım 3.14’ten 24 kuyu plakalarının yeni bir kuyusuna aktarın. DNA ekstraksiyonu ve genotipleme için her bir fazESC alt bendinin kalan süspansiyonunun 4. 24 kuyulu plakaları 37 °C’de phaESC altclones ile %5 CO2 atmosferde kuluçkaya yatırın. Hücre kültürleri geçiş yoğunluğuna ulaşmadan bir gün önce, ışınlanmış MEF’leri JELATIN kaplı 6 kuyulu plakalara MEF ortamında 4 × 104 hücre/cm2 yoğunlukta plakalayın. Plakaları %5 CO2 atmosferde 37 °C’de tutun. FazEZler geçmek için yeterince birleştiğinde, ortamı aspire edin ve 250 μL tripsin ekleyin. 24 kuyu plakasını 37 °C’de 5 dakika kuluçkaya yatırın.NOT: Adım 4.9’da genotiplemeden sonra, yalnızca hem H19-DMR hem de IG-DMR’nin silinen phaESC çizgilerinin geçirilmesi gerekir. Trypsin’i söndürmek için her kuyuya 750 μL yıkama tamponu ekleyin. Pipet tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için birkaç kez. Hücre süspansiyonu 15 mL’lik bir tüpe aktarın. Tüpü 160 x g’da 5 dakika santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 2 mL haESC ortamında yeniden diriltin. MEF ortamını adım 3.17’den itibaren 6 kuyu plakalarının kuyularından aspire edin. PhaESC süspansiyonu her tüpten adım 3.20’den yeni bir kuyuya aktarın. Plakaları %5 CO2 atmosferde 37 °C’de tutun. 3,17 ile 3,21 arası adımları yineleyerek ve plaka boyutunu ve tripsin, yıkama tamponu ve haESC ortamının hacimlerini artırarak hücre klonlarını genişletin. 5. adım için her alt klonlanmış phaESC MEF hattı için bir T25 şişesi hazırlayın.NOT: 5. adıma geçmeden önce her alt klonlanmış fazESC hattının bir aliquot’unun 300 μL donma ortamında dondurulmasını ve sıvı azot deposunda bir kriyostock tutulmasını öneririz. 4. MEF’lerle alt klonlanmış phaESC hatlarının ilk genotipletimi Kalan hücre süspansiyonundan 3.15 adımından genomik DNA çıkarmak için, 96 kuyu plakalarının her kuyusuna 200 μL lizis tamponu ekleyin. Hücre süspansiyonu 1,5 mL tüpe aktarın. Kalan tüm hücreleri kurtarmak ve aynı 1,5 mL tüpte toplamak için her kuyuyu ek 200 μL lizis tamponu ile durulayın. 1,5 mL’lik tüpü karıştırma ile 3 saat boyunca 55 °C’de kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her 1,5 mL tüpe 460 μL izopropanol ekleyin ve bir DNA çökeltisi görünene kadar hafifçe karıştırın. Tüpleri 5 dakika boyunca 10.000 x g’≥ santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. DNA peletlerini% 70 etanol 200 μL ile yıkayın. Tüpleri 5 dakika boyunca 10.000 x g’≥ santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Tüpleri havada 10 dakika kurutun ve ardından DNA’yı 20 μL suya yeniden koyun. Üreticinin protokolünü izleyerek termostable DNA polimeraz kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin.NOT: PCR için astar çiftleri Tablo 2’de listelenmiştir ve şu şekilde kullanılır: H19-DMR-P1 ve P3 (silinen H19-DMR için 407 bp); H19-DMR-P2 ve P3 (H19-DMR wildtype için 623 bp); IG-DMR-P1 ve P3 (silinen IG-DMR için 319 bp); IG-DMR-P2 ve P3 (wildtype IG-DMR için 492 bp). Tüm astar çiftleri için PCR sıcaklık profili aşağıdaki gibidir: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 sn 72 °C), 5 dk 72 °C. H19-DMR ve IG-DMR silmeleri için güçlendirilmiş DNA parçalarının uzunluğu, CRISPR/ Cas9 aracılı düzenleme ile ilişkili homolog olmayan uç birleştirme nedeniyle bazı farklılıklar göstermektedir. PhaESC’ler, H19-DMR ve IG-DMR DNA’sı içeren MOF’larla kültürlendi. Bu nedenle, wildtype DNA parçalarını güçlendiren H19-DMR-P2/P3 ve IG-DMR-P2/P3 astar çiftleri bilgilendirici değildir. Ancak, bu astar çiftleri kontrol olarak dahil edilir ve tüm reaksiyonlarda bir bant vermelidir. PCR parçalarını agarose jel elektroforez ile analiz edin. Elektroforez16’nınayrıntılı prosedürü hakkında yayınlanan protokole bakın. Hem H19-DMR hem de IG-DMR silmeleri olan hücre hatlarını tanımlayın. Elektroforezin temsili bir görüntüsü Şekil 2B’degösterilmiştir.NOT: Olgumuzda 135 alt klonlanmış fazESC hattı arasında hem H19-DMR hem de IG-DMRdelesyonları olan sekiz hücre hattı tanımlanmıştır. 5. Alt klonlanmış fazESC hatlarının haploid hücre saflaştırılması Adım 3.22’den T25 şişelerindeki alt klonlanmış phaESC kültürleri geçmek için yeterince yoğun hale geldiğinde, ortamı aspire edin ve 1,5 mL tripsin ekleyin. Matarayı 37 °C’de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için birkaç kez 4,5 mL yıkama tamponu ve pipet ekleyin. Her hücre süspansiyonu 15 mL’lik bir tüpe aktarın ve tüpü 5 dakika boyunca 160 x g’da santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini 15 μg/mL Hoechst 33342 ile desteklenmiş 400 μL haESC bakım tamponunda yeniden biriktirin. Hücre süspansiyonlarını 37 °C’de 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonlarını bir hücre süzgeç kapağından 5 mL’lik bir tüpe aktarın. Hücre süzgeç kapağını ek 400 μL haESC bakım tamponu ile durulayın ve kalan hücreleri aynı 5 mL tüpte toplayın. Sıralamaya hazır olana kadar tüpü 4 °C’de tutun. Üreticinin talimatlarına göre 100 μm nozullu bir akış sitometresi kurun.NOT: Hoechst 33342, 405 nm’de ekscitasyon ile tespit edilebilir. Burada Hoechst 33342’nin tespiti için 355 nm UV lazer kullanılmaktadır. Akış sitometresindeki sıralanmış hücreleri toplamak için hücre süspansiyonu (adım 5.3’ten itibaren) ve 2 mL haESC bakım tamponu içeren yeni bir 15 mL tüp kurun. Analizi başlatın ve G1/S fazında haploid hücreleri toplamak için sıralama kapısını kurun. G1/S faz fazESC popülasyonunu tanımlamak için Şekil 2A’daki histograma bakın.NOT: Bazı alt klonlanmış fazESC çizgileri, adım 2’deki diploid hücrelerin tamamen diploidizasyonu veya hatalı kaplaması nedeniyle herhangi bir haploid hücresi içermeyebilir. Haploid hücreler G1/S fazında gözlenmezse, sıralama yapmadan başka bir örneğe geçin. Olgumuzda 5 hücre hattında haploid hücre, 3 hücre hattında ise 8 alt klonlanmış faESC hattından sadece diploid hücreler vardı. Hücre sıralamadan sonra, 15 mL toplama tüpünün duvarı boyunca 5 mL yıkama tamponu ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 160 x g’da santrifüj edin. Üsttekini çıkarın. Sıralanmış hücrelerin sayısına bağlı olarak kültleme için uygun boyutta bir plaka seçin. Sırasıyla 1.000-40.000 hücre, 40.000-200.000 hücre ve 200.000-400.000 hücreyi kültüre etmek için 96 kuyulu bir plaka, 24 kuyulu bir plaka ve 12 kuyulu bir plaka kullanın. Hücre peletini sırasıyla 120 μL, 600 μL ve 1,2 mL haESC ortamında yeniden ıslatır.NOT: Düşük izdiham sıraladıktan sonra hücrelerin hücre ölümüne neden olabileceğinden, hücreleri yüksek yoğunlukta plakalayın. Bu noktadan itibaren, fazEZ’ler, adım 6’da genotiplemeyi ve 9. Hücre süspansiyonu uygun boyutta jelatin kaplı bir kuyuya aktardıktan sonra, plakayı% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C’de kuluçkaya yatırın. Artan plaka boyutları ve trypsin, yıkama tamponu ve haESC ortamı hacimlerini artırarak 3,18 ile 3,21 adımlarını tekrarlayarak phaESC kültürlerini genişletmeye devam edin. Hücreler, MEF’leri olmayan jelatin kaplı kuyularda kültürlenir. Her alt klonlanmış phaESC hattı için, sırasıyla 6 ve 9 adımları için 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusunda ve 6 kuyulu bir plakanın bir kuyusunda bir kültür hazırlayın.NOT: Alt klonlanmış her fazESC hattının bazı hücreleri, 9. 6. MEF’ler olmadan alt klonlanmış phaESC hatlarının ikinci genotiplemesi NOT: Alt klonlanmış fazESC çizgilerinin hem H19hem de IG-DMR’lerin silmelerine sahip olduğunu ve MET’lerin çıkarılmasından sonra wildtype alellerinin bulunmadığını doğrulamak için ikinci bir genotipleme turu gerçekleştirilir. Mikroskop altında, adım 5.11’deki 24 kuyu plakalarının kuyularındaki kültürlerin MEF’lerden arındırılmış olduğunu onaylayın.NOT: MF’ler gözlenirse, PCR’nin MEF’lerden wildtype DNA ile kirlenmesini önlemek için MEF’ler kaybolana kadar kültürleri geçirmeye devam etmek gerekir. Ortamı birleştiği kültürlerden apire edin ve 24 kuyu plakasının kuyusu başına 400 μL lizis tamponu ekleyin. Birkaç kez pipetlemeden sonra, hücre süspansiyonu 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın. 1,5 mL’lik tüpü karıştırma ile 3 saat boyunca 55 °C’de kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 1,5 mL’lik tüpe 400 μL izopropanol ekleyin ve bir DNA çökeltisi görünene kadar hafifçe karıştırın. Tüpü 5 dakika boyunca 10.000 x g ≥ santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. DNA peletini% 70 etanol 200 μL ile yıkayın. Tüpü 5 dakika boyunca 10.000 x g ≥ santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Tüpü havada 10 dakika kurutun ve ardından DNA’yı 50 μL suya yeniden koyun. Hem H19hem de IG-DMR’ların silmelerine sahip olan ve wildtype alellerinden arındırılmış hücre hatlarını tanımlamak için 4.7.NOT: Referans için Şekil 2B’de tipik bir ikinci genotipleme analizinin görüntüsü gösterilmiştir. Olgumuzda, haploid hücre saflaştırmasından sonra seçilen 5 hücre hattının tümü (adım 5) wildtype alellerinden arındırılmış ve sadece H19- ve IG-DMR’ların silme alellerine sahipti. Bu ikinci genotiplemeden sonra seçilen alt klonlanmış fazESC çizgilerini DKO-phaESC satırları olarak kullanın. 7. Farelerin süper yumurtlama MII oosit üretimi için, oosit koleksiyonundan önce her B6D2F1 dişi fareye (4-5 haftalık) 63-65 saat hamile mare serum gonadotropin (PMSG) çözeltisinin 5 IU’su intraperitoneal enjeksiyonu ile süper yumurtlamayı başlatın.NOT: B6D2F1 oositleri intrasitoplazmik enjeksiyonu iyi tolere ettiği ve işlemden sonra yüksek gelişim potansiyeli gösterdiği için bu protokol için B6D2F1 fare zorlanması önerilir17. PMSG enjeksiyonundan kırk sekiz saat sonra, intraperitoneally her fareye 5 IU insan koryonik gonadotropin çözeltisi enjekte edin. 8. Oosit koleksiyonu Bir kuyuda 700 μL hyaluronidaz ortamı ve kalan 3 kuyuda 700 μL M2 ortamı içeren 4 kuyulu bir plaka hazırlayın. Ayrıca, 7 mL M2 orta ile 6 cm’lik bir tabak ve 900 μL M16 orta ile bir merkez kuyu yemeği hazırlayın. Tabağı ve yemekleri % 5 CO2 atmosferinde 37 °C’de önceden ısıtın. İntrasitoplazmik enjeksiyon gününde, süperovulated dişileri (adım 7.2’den itibaren) servikal çıkık veya SABAH 8 civarında CO2 soluma ile ötenazi. Cımbız ve makas kullanarak yumurta kanallarını parçalara ayrıştırın. Oviducts M2 orta ile 6 cm’lik yemeğe yerleştirin. Kümülüs-oosit komplekslerini (COC’ ler) oviducts ampullasını 30 G iğne ile yırtarak serbest bırakın. COC’leri önceden ısıtılmış hyaluronidaz ortamına aktarın ve % 5 CO2 atmosferinde 37 °C’de tutun. 2-3 dk sonra, bir ağız pipeti ile kümülüs içermeyen oositleri toplayın ve oositleri 4 kuyulu tabağın diğer 3 kuyusunda taze M2 ortamına aktararak 3 kez yıkayın. İlk kutup cisimlerine sahip olan metafaz II (MII) oositlerini M16 orta boy bir merkez kuyu kabında toplayın ve12. adımda intrasitoplazmik enjeksiyon için kullanılana kadar plakayı% 5 CO 2 atmosferinde 37 °C’de tutun. 9. DKO-phaESC’lerin tedavisi ve toplanması İntrasitoplazmik enjeksiyondan bir gün önce -80 oranında BOF’lar olmadan 6 kuyulu bir tabakta DKO-phaESC kültürü hazırlayın (adım 5.11’den itibaren). M fazında hücre döngüsü durmasına neden olmak için, ortamı tamamen aspire edin ve 0.05 mg/mL demekolsin içeren 2 mL haESC ortamı ekleyin. 8 saat demecolcine tedavisinden sonra, ortamı aspire edin ve 800 μL tripsin ekleyin. Plakayı 5 dakika boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C’de kuluçkalayın, ardından tripsinleri söndürmek için 2 mL yıkama tamponu ve tek hücreli süspansiyon elde etmek için birkaç kez pipet ekleyin. Hücre süspansiyonu 15 mL’lik bir tüpe aktarın. Tüpü 5 dakika boyunca 160 x g’da santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Hücre peletini 15 μg/mL Hoechst 33342 içeren 400 μL haESC bakım tamponunda yeniden biriktirin. Hücre süspansiyonu 37 °C’de% 5 CO2 atmosferinde 15 dakika boyunca kuluçkaya yaslanın. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonunu bir hücre süzgeç kapağından 5 mL’lik bir tüpe aktarın ve 10. 10. M fazlı DKO-fako-fakoların saflaştırılması Üreticinin talimatlarına göre 100 μm nozullu bir akış sitometresi kurun.NOT: Hoechst 33342, 405 nm’de ekscitasyon ile tespit edilebilir. Burada Hoechst 33342’nin tespiti için 355 nm UV lazer kullanılmaktadır. M fazlı tutuklanan DKO-phaESC’leri 9.7 adımından ayarlayın ve analize başlayın. Demecolcine ile tedavi edilen numuneden haploid M faz hücrelerini (2n) toplamak için uygun bir sıralama kapısı seçin.NOT: Demekolsin tedavisinden sonra, Şekil 3B’degösterildiği gibi haploid ve diploid M fazlı tutuklu hücrelere karşılık gelen 2 hücre popülasyonu beklenmektedir. Demekolsin tedavisinden sonra hücre döngüsü durması tamamlanır, böylece haploid 1n DNA zirvesi gözlenmez. Haploid M fazlı hücreler ve diploid G1 hücreleri aynı DNA içeriğine (2n) sahip olduğu ve üst üste binen zirveler üreteceği için bu önemlidir. Akış sitometresindeki sıralanmış hücreleri toplamak için 2 mL haESC bakım tamponu içeren 15 mL’lik bir tüp kurun. Hücre sıralamayı başlatın. Hücre sıralamadan sonra, toplama tüpünün duvarı boyunca 5 mL yıkama tamponu ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 160 x g’da santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. 5 x 105 hücre/mL’lik son konsantrasyon elde etmek için hücreleri uygun bir haESC bakım tamponu hacminde yeniden biriktirin. Hücre süspansiyonu 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın. 12. adımda intrasitoplazmik enjeksiyona hazır olana kadar tüpü buzda tutun. 11. Tutma ve mikroenjeksiyon pipetlerinin hazırlanması NOT: İntrasitoplazmik enjeksiyonun (adım 12) gerçekleştirilmesi için birkaç tutma ve mikroenjeksiyon pipeti gereklidir (Şekil 4A). Bu pipetler ticari bir tedarikçiden özel talep üzerine satın alınabilir veya bir mikropipette çekme ve bir mikroforge kullanılarak uygun cam kılcal damarlardan yapılabilir. Borosilikat cam kılcal damarları bir mikropipette çekme üzerine çekin. Filamentsiz (0,78 x 1,00 x 80 mm) borosilikat cam kılcal damarları çekmek için, referans olarak alevli bir yatay çekme(Malzeme Masası)için aşağıdaki parametreler verilmiştir, ancak diğer aletler ve cam kılcal tipler için farklılık gösterecektir: Isı 510 (Rampa testi 480), Çekme 0, Hız 150, Zaman 175 ve Basınç 200 pipet tutmak için; Isı 510 (Rampa testi 480), Mikroenjeksiyon pipetleri için Çekme 90, Hız 140, Zaman 125 ve Basınç 200.NOT: En uygun parametrelerin ayrı ayrı tanımlanması gerekir, çünkü nem, mikropipette çekme modeli ve cam kılcal damarların çoğu enjeksiyon pipetlerinin şeklini etkileyebilir. Kademeli konik ile uzun bir şekil hedeflenmelidir. Tutma pipetlerinin hazırlanması 11.1. adımda hazırlanan bir çekilmiş kılcal damarı mikroforge’a ayarlayın. Kılcal damarı filament üzerindeki cam boncuk üzerine yerleştirin ve filamenti ısıtırken cam boncukla temas etmek için kılcal damarı diriltin. Dış çapı 60-100 μm olacak şekilde ısıtmayı kapatarak ve cam boncuktan ayrılarak kılcal damarı kırın. Kılcal ucu filament üzerindeki cam boncukla yüzleşecek şekilde yatay olarak yerleştirin. Kılcal ucun iç çapının 10-20 μm çapa erimesini sağlamak için filamenti ısıtın. Kılcal damarı, cam boncuk temas etmeden kılcal uçtan ~1 mm’lik bir noktaya yerleştirilecek şekilde hareket ettirİn. Kılcal damarların 20° açıyla bükülmesini sağlamak için filamenti ısıtın. Bir tutma pipeti olarak terimlenen kılcal damarı mikroforge’dan sökün.NOT: Kılcal damarın boyutunu ölçmek için tercihen mikroforge içine bir göz merceği retikül monte edilir. Mikroenjeksiyon pipetlerinin hazırlanması 11.1. adımda hazırlanan bir çekilmiş kılcal damarı mikroforge’a ayarlayın. Kılcal damarı filament üzerindeki cam boncuk üzerine yerleştirin ve filamenti ısıtırken cam boncukla temas etmek için kılcal damarı diriltin. Dış çapı 6 μm olan bir konumda ısıtmayı kapatarak ve cam boncuktan ayrılarak kılcal damarı kırın. Kılcal damarı, cam boncuk temas etmeden kılcal uçtan ~1 mm’lik bir noktaya yerleştirilecek şekilde hareket ettirİn. Kılcal damarların 20° açıyla yukarı doğru bükülmesini sağlamak için filamenti ısıtın. Mikroenjeksiyon pipetini mikroforge’dan sökün ve daha sonra kullanmak üzere güvenli bir kutuda saklayın.NOT: Mikroenjeksiyon pipetleri aşağıdaki özelliklerle hazırlanmıştır: dış çap, 6 μm; iç çap, 4,5–5 μm; büküm açısı, 20°. Mikroenjeksiyon pipetinin optimal tasarımını tanımlamak intrasitoplazmik enjeksiyonun başarısı için önemlidir. Çok büyük bir iç çap, donör DKO-phESC’lerin plazma zarının yırtılmasını önleyebilir (bkz. tartışma bölümü). İç çapı çok darsa, donör DKO-phESC’lerin düzgün pipetlemini engelleyebilir. Yüksek büküm açısı piezo darbelerinin etkisini etkilediği için büküm açısı < 30° tercih edilir. 12. DKO-fakesklerin intrasitoplazmik enjeksiyonu İntrasitoplazmik enjeksiyondan önce (adım 12.2’den itibaren), 0.6 g PVP içeren 50 mL’lik bir tüpe 5 mL M2 ortamı ekleyerek ve tüpü 2 gün boyunca 4 °C’de bir rocker üzerinde çalkalayarak bir polivinylpyrrolidone (PVP) çözeltisi hazırlayın. PVP tamamen çözüldükten sonra, çözelti steril filtrelendirilir ve 4 ° C’de saklanır. İntrasitoplazmik enjeksiyon gününde, 900 μL KSOM orta ile merkez kuyulu bir yemek hazırlayın ve yemeği% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C’de önceden ısıtın. Baş aşağı yerleştirilmiş 10 cm’lik bir kabın kapağına 5 μL PVP çözeltisi ve 20 μL M2 ortamı damlalarını hizalayarak bir mikromanipülasyon kabı hazırlayın. Damlaları mineral yağ ile örtün ve yemeği enjeksiyon mikroskobu aşamasına yerleştirin.NOT: Mikromanipülasyon kabının önerilen düzenlemesi Şekil 4B’de gösterilmiştir. Mikromanipülatöre bir tutma pipet takın. Mikroenjeksiyon pipetini bir mikro doldurucu ucu kullanarak florokarbon yağı ile doldurun ve piezo aktüatöre monte edin. Camı PVP ile kaplamak ve daha az yapışkan hale getirmek için mikroenjeksiyon pipetini PVP çözeltisi ve pipet ile birkaç kez bir damlaya batırın. Mikroenjeksiyon pipetine küçük hacimli bir PVP çözeltisi yükleyin ve pipetleri M2 ortamı ile bir damlaya taşıyın. Tutma pipetini M2 ortamına daldırın ve damlanın altındaki pipete odaklanın. Adım 10,6’dan M2 orta damlasına yaklaşık 2 μL DKO-phaESC süspansiyon aktarın. Bir ağız pipeti kullanarak 10 MII oositini adım 8.5’ten aynı M2 orta damlasına aktarın. Enjeksiyon için, M2 orta damlasında bir oosit döndürün, böylece perivitellin uzayı mikroenjeksiyon pipetine bakar ve MII plakası mikroenjeksiyon pipetinin yolunda bulunmaz (Şekil 4A). Tutma pipetinden negatif basınç uygulayarak oosit tutun.NOT: Bir MII plakası görsel olarak “kambur” olarak adlandırılan ve genellikle ilk kutup gövdesinin yanında bulunan bir ooplazma çıkıntısı olarak tanımlanır. MII plakası, ekli kromozomlara sahip meiotik iğleri içerir. Milin ve kromozomların mekanik hasarı embriyo gelişimini bozabileceğinden mikroenjeksiyon pipetine ve MII plakasına dokunmaktan kaçınılmalıdır. Hafif negatif basınç uygulayarak mikroenjeksiyon pipet ucuna bir DKO-phaESC yükleyin. Sağlam bir DKO-phaESC enjeksiyonunu önlemek için pipetleme yaparak bir DKO-phaESC’nin plazma zarını yırtın (Şekil 3C; bkz. tartışma).NOT: Bir DKO-phaESC’nin plazma zarının pipetleme ile yırtılmazsa, DKO-phaESC’yi atın ve başka bir DKO-phaESC yükleyin. Mikroenjeksiyon pipetini oosit zona pellucida ile temas halinde yerleştirin ve mikroenjeksiyon pipeti içinde az miktarda negatif basınç uygulayın. Mikroenjeksiyon pipetinin ucunu perivitelline uzayına doğru iterken zonayı kırmak için piezo impulsları (yoğunluk, 20; frekans, 4) uygulayın. Bir mil ve kromozom içeren MII plakasının mikroenjeksiyon pipetinin yolunda yer almadığını onaylayın.NOT: Oolemma’nın hasar görme olasılığını en aza indirmek için ayarı zonayı delmek için en düşük piezo darbelerine ampirik olarak ayarlayın. Zona pellucida parçasını mikroenjeksiyon pipetinden atın ve DKO-phaESC’yi pipetin kenarına yerleştirin. Oosit mikroenjeksiyon pipeti ile nüfuz edin, böylece oolemma karşı tarafa ulaşır.NOT: Mil ve kromozomların zarar görmesini önlemek için MII plakasına dokunmayın. Oolemmayı delmek için bir piezo darbesi (yoğunluk, 6; frekans, 1) uygulayın. Oolemmanın mikroenjeksiyon pipetinin şaftı boyunca gevşeyici olduğundan emin olun.NOT: Oosit hasarını en aza indirmek için oolemmayı kırmak için piezo darbesinin en düşük ayarını ampirik olarak tanımlayın. DKO-phaESC’yi ooplazma minimum miktarda ortam ile enjekte edin ve mikroenjeksiyon pipetini oositten sorunsuz bir şekilde çekin. Enjekte edilen oositleri tutma pipetinden serbest bırakın ve daha sonra toplanması için mikro damlanın yanına yerleştirin. M2 orta damlasındaki diğer MII oositleri için enjeksiyon prosedürünü 12,9 ila 12,17 arasında tekrarlayın.NOT: Oositleri 20 dakikadan fazla kuvözden uzak tutmaktan kaçının. Deneyimlerimize göre, 10 oositlik bir grup, uygun eğitimden sonra 15 dakika içinde rahatça manipüle edilebilir. Enjekte edilen oositlerin grubunu M2 orta damlasından KSOM ortamı ile önceden ısıtılmış bir merkez kuyu kabına aktarın. Yemeği %5 CO 2 atmosferde 37 °C’de1 saat bekletin. Yeterli enjekte edilen oositleri elde etmek için ek MII oosit gruplarıyla 12.5 ve 12.20 adımlarındaki oosit manipülasyonu tekrarlayın. 13. yapılı yarı klonlanmış embriyoların aktivasyonu KSOM ortamının her biri 900 μL ve aktivasyon ortamı ile iki merkez kuyu yemeği hazırlayın. Her kuyuda 700 μL KSOM ortamlı 4 kuyulu bir plaka hazırlayın. %5 CO2 atmosferde bulaşıkları ve tabağı 37 °C’de önceden ısıtın. KSOM ortamında 1 saat sonra, enjekte edilen oositleri adım 12.21’den aktivasyon ortamı ile önceden ısıtılmış merkez kuyu kabına aktarın. Aktivasyon için yemeği %5 CO 2 atmosferde 37 °C’de6 saat tutun. Aktivasyondan sonra, bazı yarı klonlanmış embriyoların, oositlerin birinci ve ikinci kutup cisimleri olan üç kutup gövdesini ve DKO-phaESC’den sahte kutup gövdesini oluşturduğunu gözlemleyin (Şekil 3E). Embriyoları 4 kuyulu bir tabakta KSOM ortamı ile yeni kuyulara aktararak 3 kez yıkayın. Embriyoları KSOM ortamı ile merkez kuyu kabına aktarın ve daha fazla gelişme için yemeği% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C’de tutun. 14. İnşa edilmiş yarı klonlanmış embriyoların geliştirilmesi Adım 13.6’dan itibaren KSOM ortamında 1 günlük kültürden sonra, birkaç yarı klonlanmış embriyo 2 hücreli aşamaya ulaşır (Şekil 5A). Preimplantasyon embriyolarının in vitro olarak daha da geliştirilmesi için, yarı klonlanmış embriyoları KSOM ortamında% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C’de kültleştirmeye devam edin. Yarı klonlanmış embriyoları 2. günde taze KSOM ortamına aktarın. 4. günde, birkaç embriyo blastosist aşamasına ulaşacaktır (Şekil 5A). Yarı klonlanmış farelerin türetlenmesi için, 2 hücreli embriyoları adım 14.1’den sahte hamile alıcı kadınların yumurta kanallarına aktarın. Embriyo transferinden bir gün önce vazektomi olmuş erkeklerle çiftleşerek sözde hamile kadınları tanımlayın ve embriyo transferi için günün sabahında açıkça görülebilen bir fişin varlığına dayanarak seçin (0,5 gün post-coitum (dpc)). Yaklaşık 19,5 dpc, tam süreli yavrular alıcı dişilerden doğal olarak teslim edilir (Şekil 5B).