In vitro transkripsiyon reaksiyonlarını düzenlemek için yeni bir DNA bağlı T7 RNA polimerazının mühendisliğini anlatıyoruz. Protein sentezi ve karakterizasyonu için adımları tartışıyoruz, kavram kanıtı transkripsiyonel düzenlemeyi doğrulıyoruz ve moleküler bilgi işlem, teşhis ve moleküler bilgi işlemedeki uygulamalarını tartışıyoruz.
DNA nanoteknolojisi, nükleik asitlerin çeşitli uygulamalar için kullanıcı tarafından reçete edilen şekil ve dinamiklere programlanabilir bir şekilde kendi kendine bir şekilde birleştirilebilirliğini sağlar. Bu çalışma, DNA nanoteknolojisinden kavramların, faj türevi T7 RNA polimerazının (RNAP) enzimmatik aktivitesini programlamak ve ölçeklenebilir sentetik gen düzenleyici ağlar oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. İlk olarak, oligonükleotid bağlı bir T7 RNAP, N-terminalLY SNAP etiketli bir RNAP ve daha sonra SNAP etiketinin benzilguanine (BG) modifiye edilmiş oligonükleotid ile kimyasal olarak bir bağlantısı ile tasarlanmıştır. Daha sonra, nükleik-asit iplikçik deplasmanı, isteğe bağlı olarak polimeraz transkripsiyonunu programlamak için kullanılır. Ek olarak, yardımcı nükleik asit derlemeleri, DNA programlı T7 RNAP ile DNA şablonları arasındaki etkileşimleri düzenlemek için “yapay transkripsiyon faktörleri” olarak kullanılabilir. Bu in vitro transkripsiyon düzenleyici mekanizması, dijital mantık, geri bildirim, basamaklama ve çoklama gibi çeşitli devre davranışlarını uygulayabilir. Bu gen düzenleyici mimarinin birleştirilmesi tasarım soyutlama, standardizasyon ve ölçeklendirme kolaylaştırır. Bu özellikler, biyo-algılama, hastalık tespiti ve veri depolama gibi uygulamalar için in vitro genetik cihazların hızlı prototiplemesini sağlayacaktır.
DNA hesaplama, hesaplama aracı olarak tasarlanmış bir dizi oligonükleotid kullanır. Bu oligonükleotidler, kullanıcı tarafından belirtilen mantığa göre dinamik olarak bir araya gelmek ve belirli nükleik asit girişlerine yanıt vermek için dizilerle programlanmıştır. Kavram kanıtı çalışmalarında, hesaplamanın çıktısı tipik olarak jel elektroforezi veya floresan plaka okuyucuları aracılığıyla tespit edilebilen floresan etiketli bir dizi oligonükleotidden oluşur. Son 30 yılda, çeşitli dijital mantık basamakları, kimyasal reaksiyon ağları ve sinir ağları1,2,3gibi giderek daha karmaşık DNA hesaplama devreleri gösterilmiştir. Bu DNA devrelerinin hazırlanmasına yardımcı olmak için, sentetik gen devrelerinin işlevselliğini tahmin etmek için matematiksel modeller kullanılmıştır4,5ve ortogonal DNA dizi tasarımı 6 , 7,8,9,10 için hesaplamalı araçlar geliştirilmiştir. . Silikon tabanlı bilgisayarlara kıyasla, DNA bilgisayarlarının avantajları arasında doğrudan biyomoleküllerle arayüz kurabilmeleri, güç kaynağı olmadığında çözelti içinde çalışmalarının yanı sıra genel kompaktlıkları ve stabiliteleri yer almaktadır. Yeni nesil sıralamanın ortaya çıkmasıyla, DNA bilgisayarlarını sentezlemenin maliyeti son yirmi yıldır Moore Yasası11’dendaha hızlı bir şekilde azalmaktadır. Bu tür DNA tabanlı bilgisayarların uygulamaları şimdi ortaya çıkmaya başlıyor, hastalık tanısı için12,13, moleküler biyofizik14‘e güç sağlamak için ve veri depolama platformlarıolarak 15.
Şekil 1: Toehold aracılı DNA iplikçik yer değiştirme mekanizması. Δ, toehold, kısmi çift yönlü serbest, ilişkisiz bir dizidir. İkinci bir iplikçik üzerinde tamamlayıcı bir etki alanı (δ*) tanıtıldığında, serbest δ etki alanı, hibridizasyon için bir toehold görevi görür ve iplikçik geri kalanının (ɑ*) iplikçik geçişi olarak bilinen bir zipping/unzipping geri dönüşümlü reaksiyon yoluyla rakibini yavaşça yerinden etmesine izin verir. δ uzunluğu arttıkça, ileri reaksiyon için ΔG azalır ve yer değiştirme daha kolay gerçekleşir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bugüne kadar, DNA bilgisayarlarının çoğunluğu, toehold aracılı DNA iplikçik yer değiştirmesi olarak bilinen dinamik DNA nanoteknolojisi alanında köklü bir motif kullanmaktadır (TMDSD, Şekil 1)16. Bu motif, kısa “toehold” çıkıntılarını (yani, 7 ila 10 nükleotit (nt) gösteren kısmen çift iplikli DNA (dsDNA) dubleksten oluşur. Nükleik asit “giriş” iplikçikler, kısmi dublekslerle toehold yoluyla etkileşime girebilir. Bu, iplikçiklerden birinin kısmi çift yönlüden yer değiştirmesine yol açar ve bu kurtarılmış iplikçik daha sonra aşağı akış kısmi dubleksleri için giriş görevi görebilebilir. Böylece TMDSD sinyal basamaklama ve bilgi işleme sağlar. Prensip olarak, ortogonal TMDSD motifleri çözümde bağımsız olarak çalışarak paralel bilgi işlemeyi mümkün kılar. TMDSD reaksiyonu üzerinde, toehold aracılı DNA iplikçik değişimi (TMDSE)17,çift uzun alan adları 18 , sıra uyumsuz ayak parmakları19ve “handhold” aracılı iplik yer değiştirme20gibi bir dizi varyasyon olmuştur. Bu yenilikçi tasarım ilkeleri, DNA bilgi işlem performansını artırmak için daha ince ayarlanmış TMDSD enerji ve dinamiklerine olanak sağlar.
Transkripsiyonal gen devreleri gibi sentetik gen devreleri de hesaplama yeteneğine sahiptir21,22,23. Bu devreler, belirli düzenleyici DNA elementlerine bağlanarak bir genin transkripsiyonunu aktive eden veya baskılayan protein transkripsiyon faktörleri ile düzenlenir. DNA tabanlı devrelerle karşılaştırıldığında, transkripsiyon devrelerinin çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, enzimatik transkripsiyon mevcut katalitik DNA devrelerinden çok daha yüksek bir ciro oranına sahiptir, böylece tek bir giriş kopyası başına daha fazla çıktı kopyası üretir ve daha verimli bir sinyal amplifikasyonu aracı sağlar. Ek olarak, transkripsiyonel devreler, farklı uygulamalar için yararlanılabilen hesaplama çıktıları olarak terapötik proteinler için aptamerler veya haberci RNA (mRNA) kodlaması gibi farklı fonksiyonel moleküller üretebilir. Bununla birlikte, mevcut transkripsiyon devrelerinin önemli bir sınırlaması ölçeklenebilirlik eksikliğidir. Bunun nedeni, çok sınırlı sayıda ortogonal protein bazlı transkripsiyon faktörü olması ve yeni protein transkripsiyon faktörlerinin de novo tasarımının teknik olarak zorlu ve zaman alıcı kalmasıdır.
Şekil 2: “Tether” ve “cage” polimeraz kompleksinin soyutlanması ve mekanizması. (A ve B) Bir oligonükleotid tether, SNAP etiketi reaksiyonu yoluyla bir T7 polimerazine enzymatic olarak etiketlenmiştir. Bağ tamamlayıcı çıkıntlı “sahte” bir T7 promotöründen oluşan bir kafes, bağlamaya melezlemesine ve transkripsiyon aktivitesini engellemesine izin verir. (C) Operatör (a * b *mevcut olduğunda, oligonükleotid bağındaki(ab)toehold’a bağlanır ve kafesin b* bölgesini yerinden çıkararak transkripsiyonun gerçekleşmesini sağlar. Bu rakam Chou ve Shih27‘den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RNAP = RNA polimeraz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu makale, transkripsiyonel devrelerin işlevlerini DNA tabanlı devrelerin ölçeklenebilirliği ile birleştiren moleküler bilgi işlem için yeni bir yapı taşı sunun. Bu yapı taşı, tek iplikli dna tether ile birlikte yaygın olarak bağlanmış bir T7 RNAP’tır (Şekil 2A). Bu DNA bağlı T7 RNAP’ı sentezlemek için, polimeraz bir N-terminal SNAP etiketi24 ile kaynaştırıldı ve Escherichia coliile rekombinant olarak ifade edildi. SNAP etiketi daha sonra BG substratı ile işlevsel hale getirilmiş bir oligonükleotid ile tepkilendi. Oligonükleotid tether, MOLEKÜLER misafirlerin DNA hibridizasyonu yoluyla polimerazın yakınında konumlandırılmasını sağlar. Bu konuklardan biri, “kafes” olarak adlandırılan ve aşağı yönde gen olmayan “sahte” bir T7 promotör DNA dubleksinden oluşan rekabetçi bir transkripsiyon blokerdi (Şekil 2B). Kafes, Oligonükleotid bağıyla RNAP’a bağlandığında, RNAP bağlama için diğer DNA şablonlarını alt ederek polimeraz aktivitesini durdurarak RNAP’ı “KAPASI” durumunda işler (Şekil 2C).
Polimerazı “ON” durumuna etkinleştirmek için, genin T7 promotörünün yukarısındaki tek iplikli “operatör” alan adlarına sahip T7 DNA şablonları tasarlanmıştır. Operatör etki alanı (yani, etki alanı a*b* Şekil 2C),kafesi TMDSD aracılığıyla RNAP’tan yerinden etmek ve RNAP proksimalini genin T7 promotörüne konumlandırmak için tasarlanabilir, böylece transkripsiyon başlatılabilir. Alternatif olarak, OPERATÖR dizisinin “yapay transkripsiyon faktörleri” olarak adlandırılan yardımcı nükleik asit iplikçiklerine tamamlayıcı olduğu DNA şablonları da tasarlanmıştır (yani, Şekil 3A’dakiTFA ve TFB iplikçikleri). Her iki iplikçik de reaksiyona girdiğinde, operatör sahasında bir araya gelecek ve yeni bir sahte bitişik etki alanı a*b*oluşturacaktır. Bu alan adı daha sonra transkripsiyon başlatmak için TMDSD aracılığıyla kafesi yerinden edebilir (Şekil 3B). Bu iplikçikler eksojen olarak temin edilebilir veya üretilebilir.
Şekil 3: Üç bileşenli anahtar aktivatör ile polimeraz aktivitesinin seçici programlanması. (A) Transkripsiyon faktörleri (TFA ve TFB)mevcut olduğunda, organizatörün operatör etki alanına bağlanırlar ve kafesi toehold aracılı DNA yer değiştirme yoluyla yerinden edebilen sahte bir tek telli dizi ( a* b *) oluştururlar. (B) Bu a*b* etki alanı, transkripsiyon başlatmak için TMDSD aracılığıyla kafesi yerinden edebilir. Bu rakam Chou ve Shih27‘den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: TF = transkripsiyon faktörü; RNAP = RNA polimeraz; TMDSD = toehold aracılı DNA iplikçik yer değiştirmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
In vitro transkripsiyonal düzenleme için nükleik asit bazlı transkripsiyon faktörlerinin kullanılması, dijital mantık, geri bildirim ve sinyal basamaklama gibi sofistike devre davranışlarının ölçeklenebilir bir şekilde uygulanmasını sağlar. Örneğin, bir yukarı akış geninden gelen transkriptlerin aşağı akış genini aktive edebileceği şekilde nükleik asit dizileri tasarlayarak mantık kapısı basamakları oluşturabilirsiniz. Bu önerilen teknoloji tarafından yetenekli hale getirilebilen basamaklama ve çoklamadan yararlanan bir uygulama, taşınabilir tanılama ve moleküler veri işleme için daha sofistike moleküler bilgi işlem devrelerinin geliştirilmesidir. Buna ek olarak, moleküler bilgi işlem ve de novo RNA sentez yeteneklerini entegre etmek yeni uygulamalara olanak sağlayabilir. Örneğin, bir moleküler devre, kullanıcı tanımlı RNA’ların bir veya bir kombinasyonunu giriş ve çıkış terapötik RNA’lar veya bakım noktası tıbbi uygulamaları için fonksiyonel peptitleri veya proteinleri kodlayan mRNA’lar olarak tespit etmek için tasarlanabilir.
Bu çalışma, N-terminalLY SNAP etiketli bir rekombinant T7 RNAP’ı daha sonra TMDSD reaksiyonlarını programlamak için kullanılan BG fonksiyonelleştirilmiş bir oligonükleotid ile kovalent olarak birleştirerek T7 RNA polimerazının aktivitesini kontrol etmek için DNA nanoteknolojisinden ilham alan bir yaklaşım göstermektedir. Tasarım gereği, SNAP etiketi polimerazın N-terminus’una yerleştirilmiştir, çünkü vahşi tip T7 RNAP’ın C-terminüsü protein yapısı çekirdeğine gömülüdür ve DNA şablon…
The authors have nothing to disclose.
L.Y.T.C, Araştırma Fonu-Keşifte Yeni Sınırlar (NFRF-E), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery Grant ve Kanada İlk Araştırma Mükemmellik Fonu’ndan (CFREF) fon alan Toronto Üniversitesi’nin Tasarım Girişimi tarafından cömert destek aldığını kabul ediyor.
0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
10 mM sodium phosphate buffer (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Tablets used to make 10 mM buffer |
10% ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC910008 | |
100% acetone | Fisher Chemical | A18P4 | |
100% ethanol (EtOH) | House Brand | 39752-P016-EAAN | |
10x in vitro transcription (IVT) buffer | New England Biolabs | B9012 | |
10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Bio Basic | A0026 | |
1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
1M sodium bicarbonate buffer | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
1X Tris-EDTA (TE) buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
2M imidazole | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
2-mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
3M sodium acetate | Bio Basic | SRB1611 | |
40% acrylamide (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
4x LDS protein sample loading buffer | Fisher Scientific | NP0007 | |
5M sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
5mM dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
agarose B powder | Bio Basic | AB0014 | |
BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
BL21 competent E. coli | Addgene | C2530H | |
BLUeye prestained protein ladder | FroggaBio | PM007-0500 | |
bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
coomassie blue (SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S11494 | |
cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S33102 | |
dry dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
formamide | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
glycerol | Bio Basic | GB0232 | |
kanamycin sulfate | BioShop | KAN201.5 | |
lysogeny broth | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
malachite green oxalate | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
NuPAGE MES SDS running buffer (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well | Life Technologies | NP0322BOX | |
oligonucleotide (cage antisense) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
oligonucleotide (cage sense) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
oligonucleotide (malachite green aptamer antisense) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
oligonucleotide (malachite green aptamer sense) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
oligonucleotide (Transcription Factor A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
oligonucleotide (Transcription Factor B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
Pierce strong ion exchange spin columns | Fisher Scientific | 90008 | |
plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes | Genscript | N/A | custom gene insert |
protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) | Fisher Scientific | 88226 | |
rNTP mix | New England Biolabs | N0466S | |
Roche mini quick DNA spin column | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
Ultra Low Range DNA ladder | Fisher Scientific | 10597012 | |
urea | BioShop | URE001.1 |