Özet

Programlanabilir In vitro Transkripsiyon ve Moleküler Hesaplama için DNA-Bağlı RNA Polimeraz

Published: December 29, 2021
doi:

Özet

In vitro transkripsiyon reaksiyonlarını düzenlemek için yeni bir DNA bağlı T7 RNA polimerazının mühendisliğini anlatıyoruz. Protein sentezi ve karakterizasyonu için adımları tartışıyoruz, kavram kanıtı transkripsiyonel düzenlemeyi doğrulıyoruz ve moleküler bilgi işlem, teşhis ve moleküler bilgi işlemedeki uygulamalarını tartışıyoruz.

Abstract

DNA nanoteknolojisi, nükleik asitlerin çeşitli uygulamalar için kullanıcı tarafından reçete edilen şekil ve dinamiklere programlanabilir bir şekilde kendi kendine bir şekilde birleştirilebilirliğini sağlar. Bu çalışma, DNA nanoteknolojisinden kavramların, faj türevi T7 RNA polimerazının (RNAP) enzimmatik aktivitesini programlamak ve ölçeklenebilir sentetik gen düzenleyici ağlar oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. İlk olarak, oligonükleotid bağlı bir T7 RNAP, N-terminalLY SNAP etiketli bir RNAP ve daha sonra SNAP etiketinin benzilguanine (BG) modifiye edilmiş oligonükleotid ile kimyasal olarak bir bağlantısı ile tasarlanmıştır. Daha sonra, nükleik-asit iplikçik deplasmanı, isteğe bağlı olarak polimeraz transkripsiyonunu programlamak için kullanılır. Ek olarak, yardımcı nükleik asit derlemeleri, DNA programlı T7 RNAP ile DNA şablonları arasındaki etkileşimleri düzenlemek için “yapay transkripsiyon faktörleri” olarak kullanılabilir. Bu in vitro transkripsiyon düzenleyici mekanizması, dijital mantık, geri bildirim, basamaklama ve çoklama gibi çeşitli devre davranışlarını uygulayabilir. Bu gen düzenleyici mimarinin birleştirilmesi tasarım soyutlama, standardizasyon ve ölçeklendirme kolaylaştırır. Bu özellikler, biyo-algılama, hastalık tespiti ve veri depolama gibi uygulamalar için in vitro genetik cihazların hızlı prototiplemesini sağlayacaktır.

Introduction

DNA hesaplama, hesaplama aracı olarak tasarlanmış bir dizi oligonükleotid kullanır. Bu oligonükleotidler, kullanıcı tarafından belirtilen mantığa göre dinamik olarak bir araya gelmek ve belirli nükleik asit girişlerine yanıt vermek için dizilerle programlanmıştır. Kavram kanıtı çalışmalarında, hesaplamanın çıktısı tipik olarak jel elektroforezi veya floresan plaka okuyucuları aracılığıyla tespit edilebilen floresan etiketli bir dizi oligonükleotidden oluşur. Son 30 yılda, çeşitli dijital mantık basamakları, kimyasal reaksiyon ağları ve sinir ağları1,2,3gibi giderek daha karmaşık DNA hesaplama devreleri gösterilmiştir. Bu DNA devrelerinin hazırlanmasına yardımcı olmak için, sentetik gen devrelerinin işlevselliğini tahmin etmek için matematiksel modeller kullanılmıştır4,5ve ortogonal DNA dizi tasarımı 6 , 7,8,9,10 için hesaplamalı araçlar geliştirilmiştir. . Silikon tabanlı bilgisayarlara kıyasla, DNA bilgisayarlarının avantajları arasında doğrudan biyomoleküllerle arayüz kurabilmeleri, güç kaynağı olmadığında çözelti içinde çalışmalarının yanı sıra genel kompaktlıkları ve stabiliteleri yer almaktadır. Yeni nesil sıralamanın ortaya çıkmasıyla, DNA bilgisayarlarını sentezlemenin maliyeti son yirmi yıldır Moore Yasası11’dendaha hızlı bir şekilde azalmaktadır. Bu tür DNA tabanlı bilgisayarların uygulamaları şimdi ortaya çıkmaya başlıyor, hastalık tanısı için12,13, moleküler biyofizik14‘e güç sağlamak için ve veri depolama platformlarıolarak 15.

Figure 1
Şekil 1: Toehold aracılı DNA iplikçik yer değiştirme mekanizması. Δ, toehold, kısmi çift yönlü serbest, ilişkisiz bir dizidir. İkinci bir iplikçik üzerinde tamamlayıcı bir etki alanı (δ*) tanıtıldığında, serbest δ etki alanı, hibridizasyon için bir toehold görevi görür ve iplikçik geri kalanının (ɑ*) iplikçik geçişi olarak bilinen bir zipping/unzipping geri dönüşümlü reaksiyon yoluyla rakibini yavaşça yerinden etmesine izin verir. δ uzunluğu arttıkça, ileri reaksiyon için ΔG azalır ve yer değiştirme daha kolay gerçekleşir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bugüne kadar, DNA bilgisayarlarının çoğunluğu, toehold aracılı DNA iplikçik yer değiştirmesi olarak bilinen dinamik DNA nanoteknolojisi alanında köklü bir motif kullanmaktadır (TMDSD, Şekil 1)16. Bu motif, kısa “toehold” çıkıntılarını (yani, 7 ila 10 nükleotit (nt) gösteren kısmen çift iplikli DNA (dsDNA) dubleksten oluşur. Nükleik asit “giriş” iplikçikler, kısmi dublekslerle toehold yoluyla etkileşime girebilir. Bu, iplikçiklerden birinin kısmi çift yönlüden yer değiştirmesine yol açar ve bu kurtarılmış iplikçik daha sonra aşağı akış kısmi dubleksleri için giriş görevi görebilebilir. Böylece TMDSD sinyal basamaklama ve bilgi işleme sağlar. Prensip olarak, ortogonal TMDSD motifleri çözümde bağımsız olarak çalışarak paralel bilgi işlemeyi mümkün kılar. TMDSD reaksiyonu üzerinde, toehold aracılı DNA iplikçik değişimi (TMDSE)17,çift uzun alan adları 18 , sıra uyumsuz ayak parmakları19ve “handhold” aracılı iplik yer değiştirme20gibi bir dizi varyasyon olmuştur. Bu yenilikçi tasarım ilkeleri, DNA bilgi işlem performansını artırmak için daha ince ayarlanmış TMDSD enerji ve dinamiklerine olanak sağlar.

Transkripsiyonal gen devreleri gibi sentetik gen devreleri de hesaplama yeteneğine sahiptir21,22,23. Bu devreler, belirli düzenleyici DNA elementlerine bağlanarak bir genin transkripsiyonunu aktive eden veya baskılayan protein transkripsiyon faktörleri ile düzenlenir. DNA tabanlı devrelerle karşılaştırıldığında, transkripsiyon devrelerinin çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, enzimatik transkripsiyon mevcut katalitik DNA devrelerinden çok daha yüksek bir ciro oranına sahiptir, böylece tek bir giriş kopyası başına daha fazla çıktı kopyası üretir ve daha verimli bir sinyal amplifikasyonu aracı sağlar. Ek olarak, transkripsiyonel devreler, farklı uygulamalar için yararlanılabilen hesaplama çıktıları olarak terapötik proteinler için aptamerler veya haberci RNA (mRNA) kodlaması gibi farklı fonksiyonel moleküller üretebilir. Bununla birlikte, mevcut transkripsiyon devrelerinin önemli bir sınırlaması ölçeklenebilirlik eksikliğidir. Bunun nedeni, çok sınırlı sayıda ortogonal protein bazlı transkripsiyon faktörü olması ve yeni protein transkripsiyon faktörlerinin de novo tasarımının teknik olarak zorlu ve zaman alıcı kalmasıdır.

Figure 2
Şekil 2: “Tether” ve “cage” polimeraz kompleksinin soyutlanması ve mekanizması. (A ve B) Bir oligonükleotid tether, SNAP etiketi reaksiyonu yoluyla bir T7 polimerazine enzymatic olarak etiketlenmiştir. Bağ tamamlayıcı çıkıntlı “sahte” bir T7 promotöründen oluşan bir kafes, bağlamaya melezlemesine ve transkripsiyon aktivitesini engellemesine izin verir. (C) Operatör (a * b *mevcut olduğunda, oligonükleotid bağındaki(ab)toehold’a bağlanır ve kafesin b* bölgesini yerinden çıkararak transkripsiyonun gerçekleşmesini sağlar. Bu rakam Chou ve Shih27‘den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RNAP = RNA polimeraz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu makale, transkripsiyonel devrelerin işlevlerini DNA tabanlı devrelerin ölçeklenebilirliği ile birleştiren moleküler bilgi işlem için yeni bir yapı taşı sunun. Bu yapı taşı, tek iplikli dna tether ile birlikte yaygın olarak bağlanmış bir T7 RNAP’tır (Şekil 2A). Bu DNA bağlı T7 RNAP’ı sentezlemek için, polimeraz bir N-terminal SNAP etiketi24 ile kaynaştırıldı ve Escherichia coliile rekombinant olarak ifade edildi. SNAP etiketi daha sonra BG substratı ile işlevsel hale getirilmiş bir oligonükleotid ile tepkilendi. Oligonükleotid tether, MOLEKÜLER misafirlerin DNA hibridizasyonu yoluyla polimerazın yakınında konumlandırılmasını sağlar. Bu konuklardan biri, “kafes” olarak adlandırılan ve aşağı yönde gen olmayan “sahte” bir T7 promotör DNA dubleksinden oluşan rekabetçi bir transkripsiyon blokerdi (Şekil 2B). Kafes, Oligonükleotid bağıyla RNAP’a bağlandığında, RNAP bağlama için diğer DNA şablonlarını alt ederek polimeraz aktivitesini durdurarak RNAP’ı “KAPASI” durumunda işler (Şekil 2C).

Polimerazı “ON” durumuna etkinleştirmek için, genin T7 promotörünün yukarısındaki tek iplikli “operatör” alan adlarına sahip T7 DNA şablonları tasarlanmıştır. Operatör etki alanı (yani, etki alanı a*b* Şekil 2C),kafesi TMDSD aracılığıyla RNAP’tan yerinden etmek ve RNAP proksimalini genin T7 promotörüne konumlandırmak için tasarlanabilir, böylece transkripsiyon başlatılabilir. Alternatif olarak, OPERATÖR dizisinin “yapay transkripsiyon faktörleri” olarak adlandırılan yardımcı nükleik asit iplikçiklerine tamamlayıcı olduğu DNA şablonları da tasarlanmıştır (yani, Şekil 3A’dakiTFA ve TFB iplikçikleri). Her iki iplikçik de reaksiyona girdiğinde, operatör sahasında bir araya gelecek ve yeni bir sahte bitişik etki alanı a*b*oluşturacaktır. Bu alan adı daha sonra transkripsiyon başlatmak için TMDSD aracılığıyla kafesi yerinden edebilir (Şekil 3B). Bu iplikçikler eksojen olarak temin edilebilir veya üretilebilir.

Figure 3
Şekil 3: Üç bileşenli anahtar aktivatör ile polimeraz aktivitesinin seçici programlanması. (A) Transkripsiyon faktörleri (TFA ve TFB)mevcut olduğunda, organizatörün operatör etki alanına bağlanırlar ve kafesi toehold aracılı DNA yer değiştirme yoluyla yerinden edebilen sahte bir tek telli dizi ( a* b *) oluştururlar. (B) Bu a*b* etki alanı, transkripsiyon başlatmak için TMDSD aracılığıyla kafesi yerinden edebilir. Bu rakam Chou ve Shih27‘den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: TF = transkripsiyon faktörü; RNAP = RNA polimeraz; TMDSD = toehold aracılı DNA iplikçik yer değiştirmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

In vitro transkripsiyonal düzenleme için nükleik asit bazlı transkripsiyon faktörlerinin kullanılması, dijital mantık, geri bildirim ve sinyal basamaklama gibi sofistike devre davranışlarının ölçeklenebilir bir şekilde uygulanmasını sağlar. Örneğin, bir yukarı akış geninden gelen transkriptlerin aşağı akış genini aktive edebileceği şekilde nükleik asit dizileri tasarlayarak mantık kapısı basamakları oluşturabilirsiniz. Bu önerilen teknoloji tarafından yetenekli hale getirilebilen basamaklama ve çoklamadan yararlanan bir uygulama, taşınabilir tanılama ve moleküler veri işleme için daha sofistike moleküler bilgi işlem devrelerinin geliştirilmesidir. Buna ek olarak, moleküler bilgi işlem ve de novo RNA sentez yeteneklerini entegre etmek yeni uygulamalara olanak sağlayabilir. Örneğin, bir moleküler devre, kullanıcı tanımlı RNA’ların bir veya bir kombinasyonunu giriş ve çıkış terapötik RNA’lar veya bakım noktası tıbbi uygulamaları için fonksiyonel peptitleri veya proteinleri kodlayan mRNA’lar olarak tespit etmek için tasarlanabilir.

Protocol

1. Tampon hazırlığı NOT: Protein saflaştırma tampon hazırlığı herhangi bir günde gerçekleşebilir; Burada, deneylere başlamadan önce yapıldı. 50 mM tris (hidroksimetil)aminometan (Tris), 300 mM sodyum klorür (NaCl), %5 gliserol ve 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8 içeren lizis/denge tamponu hazırlayın. 50 mL santrifüj tüpüne 1,5 mL 1M Tris, 1,8 mL 5M NaCl, 1,5 mL gliserol,25,2mL deiyonize su (ddH 2 O) ekleyin ve kullanımdan hemen önce 10,5 μL 14…

Representative Results

Şekil 5: SNAP T7 RNAP ekspresyonunun SDS-PAGE analizi ve in vitro transkripsiyon tahlil. (A) SNAP T7 RNAP protein saflaştırma analizi, SNAP T7 RNAP moleküler ağırlığı: 119.4kDa. FT = sütundan akış, W1 = safsızlık içeren yıkama tamponunun elüsyon fraksiyonları, saflaştırılmış ürün içeren E1-3 = elution fraksiyonları …

Discussion

Bu çalışma, N-terminalLY SNAP etiketli bir rekombinant T7 RNAP’ı daha sonra TMDSD reaksiyonlarını programlamak için kullanılan BG fonksiyonelleştirilmiş bir oligonükleotid ile kovalent olarak birleştirerek T7 RNA polimerazının aktivitesini kontrol etmek için DNA nanoteknolojisinden ilham alan bir yaklaşım göstermektedir. Tasarım gereği, SNAP etiketi polimerazın N-terminus’una yerleştirilmiştir, çünkü vahşi tip T7 RNAP’ın C-terminüsü protein yapısı çekirdeğine gömülüdür ve DNA şablon…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.Y.T.C, Araştırma Fonu-Keşifte Yeni Sınırlar (NFRF-E), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery Grant ve Kanada İlk Araştırma Mükemmellik Fonu’ndan (CFREF) fon alan Toronto Üniversitesi’nin Tasarım Girişimi tarafından cömert destek aldığını kabul ediyor.

Materials

0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20) BioShop TWN510.5
0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio Basic SD8135
10 mM sodium phosphate buffer (pH 7) Bio Basic PD0435 Tablets used to make 10 mM buffer
10% ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich A3678-100G
100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC910008
100% acetone Fisher Chemical A18P4
100% ethanol (EtOH) House Brand 39752-P016-EAAN
10x in vitro transcription (IVT) buffer New England Biolabs B9012
10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Bio Basic A0026
1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I5502-1G
1M sodium bicarbonate buffer Sigma Aldrich S6014-500G
1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma Aldrich 648311-1KG
1X Tris-EDTA (TE) buffer ThermoFisher 12090015
2M imidazole Sigma Aldrich 56750-100G
2-mercaptoethanol (BME) Sigma Aldrich M3148
3M sodium acetate Bio Basic SRB1611
40% acrylamide (19:1) Bio Basic A00062
4x LDS protein sample loading buffer Fisher Scientific NP0007
5M sodium chloride (NaCl) Bio Basic DB0483
5mM dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 43815-1G
6x gel loading dye New England Biolabs B7024S
agarose B powder Bio Basic AB0014
BG-GLA-NHS New England Biolabs S9151S
BL21 competent E. coli Addgene C2530H
BLUeye prestained protein ladder FroggaBio PM007-0500
bromophenol blue Bio Basic BDB0001
coomassie blue (SimplyBlue SafeStain) ThermoFisher LC6060
cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain) Fisher Scientific S11494
cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain) Fisher Scientific S33102
dry dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D12345
formamide Sigma Aldrich F9037-100ML
glycerol Bio Basic GB0232
kanamycin sulfate BioShop KAN201.5
lysogeny broth Sigma Aldrich L2542-500ML
malachite green oxalate Sigma Aldrich 2437-29-8
N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Sigma Aldrich T9281-25ML
NuPAGE MES SDS running buffer (20x) Fisher Scientific LSNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well Life Technologies NP0322BOX
oligonucleotide (cage antisense) IDT N/A TATAGTGAGTCGTATTAATTTG
oligonucleotide (cage sense) IDT N/A TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA
TTAATACGACTCACTATA
oligonucleotide (malachite green aptamer antisense) IDT N/A GGATCCATTCGTTACCTGGCT
CTCGCCAGTCGGGATCCTATA
GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT
TATCGCCGTAGTTGGTGTACT
oligonucleotide (malachite green aptamer sense) IDT N/A TAATACGACTCACTATAGGATC
CCGACTGGCGAGAGCCAGGT
AACGAATGGATCC
oligonucleotide (Transcription Factor A) IDT N/A AGTACACCAACTACGAGTGAG
oligonucleotide (Transcription Factor B) IDT N/A TCAGTCACCTATCTGGCGATAA
TGGAACTG
oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether) IDT N/A GCTACTCACTCAGATAGGTGAC
TGA/3AmMO/
Pierce strong ion exchange spin columns Fisher Scientific 90008
plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes Genscript N/A custom gene insert
protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) Fisher Scientific 88226
rNTP mix New England Biolabs N0466S
Roche mini quick DNA spin column Sigma Aldrich 11814419001
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100ML
Ultra Low Range DNA ladder Fisher Scientific 10597012
urea BioShop URE001.1

Referanslar

  1. Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
  2. Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).
  3. Chen, Y. -. J., et al. Programmable chemical controllers made from DNA. Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).
  4. di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting synthetic gene networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  5. Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects. Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).
  6. Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).
  7. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational sequence design with R2oDNA Designer. Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).
  8. Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach. Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).
  9. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  10. Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).
  11. Wetterstrand, K. DNA sequencing costs: Data. Genome.gov. , (2020).
  12. Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics. Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).
  13. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  14. Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).
  15. Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. Dynamic and scalable DNA-based information storage. Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).
  16. Yurke, B., Mills, A. P. Using DNA to power nanostructures. Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).
  17. Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA. Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).
  18. Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. Effective design principles for leakless strand displacement systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).
  19. Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement. Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).
  20. Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -. B. V., Ouldridge, T. E. Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions. bioRxiv. , (2020).
  21. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  22. Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150 (3), 647-658 (2012).
  23. Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).
  24. Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles. Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).
  25. Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits. Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).
  26. Baugh, C., Grate, D., Wilson, C., Doudna, J. A. 2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11. Journal of Molecular Biology. 301 (1), 117-128 (2000).
  27. Chou, L. Y. T., Shih, W. M. In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors. ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).
  28. Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis. Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).
  29. Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
  30. Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase. Biyokimya. 36 (10), 2908-2918 (1997).
  31. Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).
  32. Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step. Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).
  33. Zhang, W. -. B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Lee, R. C., Douglas, T. R., Chou, L. Y. T. DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation. J. Vis. Exp. (178), e62073, doi:10.3791/62073 (2021).

View Video