İplik Embolisi Yöntemi ile Üstün Sagittal-Sinüs Oklüzyonunun Sıçan Modelinin Kurulması

Serebral venöz sinüs trombozu (CVST), tüm inme nedenlerinin sadece% 0.5-1.0'ini oluşturan ancak çocuklarda ve genç yetişkinlerde nispeten yüksek bir oluşum oranına sahip olan serebral venöz sistemin nadir bir hastalığıdır¹. Otopsi sırasında SEREBROVASKÜLER hastalık ölümlerinin %10'unun nedeni CVST bulunmuştur². Tromboz intrakraniyal venöz sistemin herhangi bir bölümünde ortaya çıkabilir. Üstün sagittal sinüs (SSS), CVST'de en sık etkilenen bölgelerden biridir ve birden fazla kan damarını içerebilir. Venöz sinüslerin darlığı veya tıkanması nedeniyle, genellikle artan intrakraniyal basınç³ile birlikte intrakraniyal venöz geri dönüş engellenir. CVST'nin klinik bulguları karmaşıktır ve zamanla değişir; semptomların özgüllüğü eksikliği olmasına rağmen, en sık görülen semptomlar baş ağrısı (%77,2), nöbetler (%42,7) ve nörolojik eksiklikler (%39,9) arasındadır. Ciddi vakalarda koma ve hatta ölüm meydana gelebilir^4,5. Son yıllarda, tıp ve sağlık standartlarının genel olarak iyileştirilmesi ve halk sağlığı farkındalığı nedeniyle, ilgili risk faktörlerinin oranı değişmiş, travma ve enfeksiyon oranı azalmış ve hamilelik, puerperium, oral kontraseptifler ve diğer nedenlerden kaynaklanan CVST oranı giderek artmıştır⁵.

Şu anda, CVST patogenez hala iyi anlaşılamamıştır. CVST'yi derinlemesine keşfetmek için daha fazla patofizyolojik araştırmaya ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, bu araştırma yöntemlerinin çoğu invazivdir ve bu nedenle klinik olarak uygulanması zordur. Klinik araştırmaların birçok sınırlaması nedeniyle, hayvan modelleri temel ve çevirisel araştırmalar açısından yeri doldurulamaz avantajlara sahiptir.

CVST'nin nedeni karmaşıktır, çünkü ilk başlangıcı genellikle tanınmaz ve trombüs oluşumunun yeri oldukça değişkendir. Neyse ki, hayvan modelleri bu faktörlerin daha iyi kontrolünü sağlayabilir. Son birkaç on yılda, çeşitli CVST hayvan modelleri kuruldu ve her modelin kendi dezavantajları var. Farklı üretim yöntemlerine göre, kabaca aşağıdaki kategorilere ayrılabilirler: basit SSS-ligasyon modeli^6,7; SSS dahili enjeksiyon hızlandırıcı modeli^8; ferrik-klorür kaynaklı SSS tromboz modeli^9; fotokimyasal kaynaklı SSS tromboz modeli^10; ve kendi kendine yapılan emboli-tıkanıklık SSS model¹¹. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu hayvanın serebral korteksinde invaziv hasarı atlatamaz ve iskemik zamanı ve yeri doğru bir şekilde kontrol edemez. Bazı modellerde trombüs kendiliğinden yeniden canlanacaktır; diğer modellerde, SSS kalıcı olarak tıkanır. Ayrıca bu modellerde komplike operasyonlar ve/veya ciddi yaralanmalar sonraki patofizyolojik bulguları etkileyebilir.

Bu çalışmada, hasarı en aza indiren, hassas kontrol edilebilirliği sağlayan ve iyi stabilite sağlayan bir CVST modelini başarıyla oluşturmak için Sprague-Dawley (SD) sıçanlarının SSS'sine bir diş fişi yerleştirilmiştir. Ayrıca, modelin etkinliğini doğrulamak için küçük hayvan manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve lazer benekli kan akışı görüntülemesi birleştirildi. Modelimizin kurulmasından önce ve sonra serebral kan akışındaki değişiklikleri değerlendirdik ve modelimizin stabilitesini değerlendirdik, CVST'nin oluşumunu, gelişimini ve ilgili patofizyolojik mekanizmalarını araştıran daha fazla çalışma için bir temel attık.

Hayvan konularını içeren prosedürler Wenzhou Tıp Üniversitesi Tıbbi Normlar ve Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili Çin mevzuatına uygundur.

1. Diş fişinin, SD sıçanların ve deneysel ekipmanın hazırlanması

1. Diş fişinin ana gövdesi olarak 0,28 mm çapında bir naylon iplik kullanın.
   NOT: Naylon ipliğin yumuşaklığı ve sertliği orta olmalıdır.
2. Naylon ipliğin bir ucunu silikon malzeme ile örtün. Diş fişinin silikon kısmının uzunluğu yaklaşık 1,2 cm ve çapı yaklaşık 1,2 mm'dir. Baş ucu koniktir ve silikon kısmı silindiriktir. 5-7 cm daha ayır. Naylon ipliğin kelepçelenmesi kolaydır ve operasyondan sonra özel ihtiyaçlara göre kesilebilir.
3. İplik fişini operasyondan önce 3 dakika bekletmek için% 75 etanol kullanın ve takmadan önce normal salin ile kalan etanolleri durulayın.
4. 280 ila 320 g ağırlığında 12 erkek SD sıçan seçin ve rastgele bir sahte gruba ve deneysel gruba bölün (grup başına n = 6). Bir haftalık çevresel adaptasyondan sonra, sıçanları 12 saat boyunca oruçlayın ve operasyondan önce 4 saat boyunca susızlaştırın.
5. Deney için gerekli olan aşağıdaki deneysel ekipmanı hazırlayın: küçük bir hayvan anestezi makinesi, beyin stereotaksik aleti, bir diseksiyon mikroskobu, yüksek hızlı kafatası matkabı, makas, cımbız, damar forsepsleri, iğne tutucu, iğne ipliği, 2 mL şırınga, lazer benekli kan akışı görüntüleme sistemi ve küçük hayvan MRI tarayıcısı.

2. Diş Embolizasyonu ile SD-Rat SSS-Embolizasyon Modelinin yapımı

1. SD sıçanı anestezi indüksiyon kutusuna yerleştirin ve anesteziyi teşvik etmek için% 4 izofluran vermek için küçük bir hayvan anestezi makinesi kullanın. Bundan sonra, SD sıçanın arka uzuvlarının ve ayak parmaklarının orta derecede sıkışmaya yanıt vermediğini doğrulamak için tokmak kullanın.
2. SD sıçanı, beyin stereotaksik cihazında eğilimli pozisyonda tıraş edilmiş üst saçlarla hızlı bir şekilde sabitleyin. %1,5-2,0 izofluran ile anesteziyi koruyun (0,5 L/dk hızında) ve solunum hızını 40-60 nefes/dak'ta stabilize edin. Sıçanın vücut sıcaklığını 37±0±2 ° C'de bir ısıtma yastığı ile stabilize edin.
   1. Anestezi sırasında korneaların kurumasını korumak için sıçan stereotaksik çerçeveye yerleştirildikten sonra steril oftalmik göz yağı uygulayın.
3. Sıçanın başının üstündeki yüzeyi% 75 etanol ile üç kez değişen% 5 povidon iyot ile sterilize edin. Başın ortasında bir cilt kesisi (2,0 cm uzunluğunda) yapın ve ardından kafatasını tamamen ortaya çıkarmak için üst fasya ve periosteumu dikkatlice soyun.
   1. Ön fontanelle, posterior fontanelle, koronal dikiş, sagittal dikiş ve balıksırtı dikişinin pozisyonlarını onaylayın.
4. Koronal dikiş ile herringbone dikişi arasındaki bölgeyi kan akışı gözlem alanı olarak kullanın. Lazer benekli kan akışı görüntüleme sırasında kafatasının gözlemi etkilemesini önlemek için, kan damarları açıkça görünene kadar kafatasını gözlem alanında inceltir. İncelen kafatasının büyüklüğü yaklaşık 1,0 cm × 1,0 cm olmalıdır. Bu adım ve aşağıdakiler diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir.
   1. Kafatası taşlama sırasında, serebral korteksteki yüksek sıcaklık yanıklarını önlemek için matkabı tekrar tekrar durulamak için normal sıcaklık salin kullanın.
5. Bregma bölgesinin SSS'lerini ortaya çıkarmak için kafatasını bregma merkezli 6,0 mm x 4,0 mm kemik pencere içinde öğütmek için yüksek hızlı bir matkap kullanın.
   1. Taşlama sırasında kafatasını soğutmak için normal salin kullanın. Kafatası inceldiğinde, SSS'nin yırtılmasını önlemek için kalan kemik parçalarını dikkatlice çıkarmak için cımbız kullanın.
6. Uygun bir diş fişi seçin, fiş noktası olarak SSS bregma noktasını kullanın, 2 mL şırınga iğnesi ile dikkatlice delin ve diş fiş kafasını hızlı bir şekilde fiş noktasına takın.
   1. Şu anda, diş fişi kafasının ucu ile SSS arasındaki açı yaklaşık 30-45 ° olmalıdır; ardından diş fişinin ucu ile SSS arasındaki açıyı 0-10 dereceye ayarlayın ve kafa sinüs confluence'ın arka kenarına ulaşana kadar SSS'yi yavaşça merkeze yerleştirin. Daha sonra kuyruğun fazla kısmını kesin.
      NOT: SSS delindiğinde hızlı kanama meydana gelebilir. Diş fişinin ucu bir kerede fiş noktasına hızlı bir şekilde takılamıyorsa, fiş noktasını dikkatlice göstermek için yavaşça aşağı kayarken fiş noktasına hafifçe basmak için küçük bir gazlı bez veya pamuk topu kullanın ve ardından tel cıvatanın ucunun ucunun SSS'ye hızlı bir şekilde yerleştirilmesini isteyin. Diş fişi takıldıktan sonra, fiş noktasında kanama varsa, kanamayı durdurmak için jelatin süngeri gibi hemostatik malzemeler kullanılabilir.

3. SD Sıçanların Beyin YüzeyindeKi Kan Akışının Tespiti

1. Kan akışı gözlem alanını düzgün bir şekilde aydınlatmak için bir lazer ışık kaynağı kullanın. Yansıyan ışık bir kamera tarafından toplanır ve analiz için bir bilgisayara iletilir. Lazer benekli kan akışı görüntüleme sistemi için aşağıdaki parametre ayarlarını kullanın: dalga boyu: φ = 785 nm; ve görüntü pozlama süresi: T = 10 ms.
2. SD-sıçan kan akışı gözlem alanını lazer benekli kan akışı görüntüleme sisteminin görüş alanına ortalayın ve beyin yüzeyindeki kan akışını 2 dakika boyunca sürekli olarak takip edin. Her SD sıçanı için embolizasyondan önce ve sonra kan akışı verilerini toplayın ve işleyin ve gözlemlenen bölgenin lazer benekli kan akışı haritasını elde edin.
3. Kemik kalıntılarını ve kalıntılarını yıkamak için ameliyat edilen bölgeyi normal salinle tekrar tekrar durulayın. Cildi dikin (0# iplik) ve iodophor ile dezenfekte edin.
4. Ameliyattan sonra sıçan uyanana kadar vücut sıcaklığını koruyun ve daha sonra yiyecek ve su sağlanan ad libitumile tek bir kafeste barındırın. Sham grubu takılamıyor.
5. Veri toplama tamamlandıktan sonra, işlem sonrası gerçekleştirin.
   1. Lazer benekli kan akışı görüntüleme sistemi yazılımı tarafından sağlanan araçlarla ilgi çekici bölgenin (ROI) tam seçimi. Elde edilen değerler, yatırım getirislerindeki ortalama kan akışı değeri ve embolizasyon öncesi ve sonrası lokal serebral kan akışı değerleridir. Embolizasyondan önce kan akışı değerini temel değer olarak kullanın.
   2. Dört ROI seçin ve her yatırım getirisinde serebral kan akışındaki göreli değişimi ölçün, temel değerden yüzde değişimi olarak ifade edilir.

4. Küçük hayvanların MRI'ında iplik konumunun tespiti

1. MRI görüntüleme sistemi için aşağıdaki T2 ağırlıklı görüntüleme (T₂WI) parametrelerini kullanın: yankı süresi (TE) = 33 ms, tekrarlama süresi (TR) = 3000 ms, ekscitasyon sayısı (NEX) = 4, Dilimler = 28, dilim kalınlığı = 0,8 mm, matris boyutu = 256 * 256 mm², çevirme açısı = 80°, görüş alanı (FOV) = 30 *30 mm², tarama süresi = 6 dk 24 s; manyetik rezonans anjiyografi (MRA) parametreleri aşağıdaki gibi ayarlanmıştır: TE = 4.4 ms, TR = 12 ms, NEX = 4, dilimler = 80, dilim kalınlığı = 0,4 mm, matris boyutu = 256 * 256 mm², çevirme açısı = 80 °, FOV = 30 * 30 mm², tarama süresi = 16 dk 23 sn 40 ms.
2. Hayvanı MRI tarama masasına sabitlayın, taramayı konumlandırarak beyin pozisyonunu kalibre edin ve pozisyonu onayladıktan sonra T₂WI ve MRA sıralı tarama gerçekleştirin.
3. Tespit sırasında hayvan anestezi makinesi üzerinden sürekli anestezi kullanın. Daha sonra, aşırı pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ile SD sıçanları ötenazi.
4. Görüntü alma ve işlem sonrası: Görüntü verilerini topladıktan sonra, SSS'deki diş fişinin durumunu daha net gözlemlemek için, sıçan beyninin T₂WI görüntüsünü görüntülemek için sahte renk geliştirme yöntemini kullanın.

Dikiş yöntemi ile SD-sıçan SSS-tromboz modelini kurmak için dikiş önceden hazırlanmalıdır (Şekil 1A) ve deney için gerekli ekipman (Şekil 1B) hazırlanmalıdır. Operasyonun hassas doğası nedeniyle, modelin hazırlanmasının bir diseksiyon mikroskobu altında tamamlanması gerekir. Ana adımlar Şekil 2'de gösterilmiştir. Modelin kan akışı gözleminin belirli ayrıntılarının açıklamasını kolaylaştırmak için Şekil 3B, kan akışı gözlem alanını, kemik penceresini ve fiş noktasını işaretler ve ayrıca SSS'ye takılan diş fişinin durumunu gösterir (Şekil 3C). Modelin hazırlanması tamamlandıktan sonra, SD sıçanların beyin yüzeyindeki kan akışını tespit etmek için lazer benekli kan akışı görüntüleme kullanılır (Şekil 4A, B). Şekil 4C, SSS ve köprü damarlarındaki (BV) kan akışının orta serebral arter (MCA) ve kılcal damarlardaki (CAP) kan akışının önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Daha sonra, küçük hayvan MRI'ı SSS'deki diş fişinin durumunu yatay konumdan (Şekil 5A), sagittal konum (Şekil 5B) ve koronal pozisyon (Şekil 5C)tespit etmek için kullanılır. Görüntüler, SSS'nin embolizasyonunu onaylayan diş fişinin yerinde olduğunu göstermektedir.

Şekil 1. İplik embolisi ve deneysel koşulların resmi. (A) Kendi kendine yapılan iplik embolisi görüntüsü (a: iplik embolisi kafası, b: iplik- emboli gövdesi). Ölçek çubuğu = 5 mm. (B) Bu deney için gerekli ana ekipman. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. SD-sıçan SSS-tromboz modelinin ana adımları. (A) Başarılı anesteziyi doğrulamak için SD sıçanının arka uzuvlarının ayak ayaklarını tops ile sıkıştırın. (B) SD sıçanı stereotaksik bir cihaza sabitleyin ve başın üstündeki yüzeyi sterilize edin. (C) Cildi kesin. (D) Üst fasya ve periosteumu soyun ve kafatasını tamamen ortaya çıkarın. (E) Kan damarları net bir şekilde görünene kadar gözlem alanını ve kemik penceresinin kafatasını delin ve parlatın. (F) SSS'nin yırtılmasını önlemek için kemik penceresindeki kemik parçalarını dikkatlice önleyin. (G) Uygun bir diş fişi seçin. (H) Fiş noktasını delmek ve diş fişini hızlı bir şekilde takmak için şırınga iğnesi kullanın. (I) Diş fişi ile SSS arasındaki açıyı ayarlayın. (J) Dikişi yavaşça takın. (K) uç sinüs birleştiği arka kenara ulaşana kadar. (L) Kafa derisini dikin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. SD sıçanların gözlemi ve çalışması. (A) SSS'nin yerini kolaylaştırmak için SD sıçanlarının üst kafatasının anatomik işaretleri gösterildi (a: bregma, b: posterior bregma). (B) Kırmızı yuvarlak-dikdörtgen alan kan akışı gözlem alanı, mavi yuvarlak-dikdörtgen alan ise kemik penceresidir. Kırmızı dairesel alan fiş noktasıdır ve ok üstün sagittal sinüse işaret eder. (C) SSS'ye fiş noktasından takılan fişin durumu (mavi ok). Beyaz ok fişin gövdesini, kırmızı ok ise iş parçacığı kafasını işaret eder. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. İplik embolisi takılması öncesi ve sonrası kan akışının karşılaştırılması. Embolizasyondan önce ve(B)önce SD sıçanlarınınserebral kan akışının lazer benekli kan akışı görüntülemesi. Sağdaki maviden kırmızıya sütun, küçükten küçüğe kan akışı değerlerinin aralığını temsil eder. (A) içinde, seçilen yatırım getirisi işaretlenir (a: SSS, b: BV, c: MCA, d: CAP). (C) Bağıl serebral kan akışının (CBF) çubuk grafiği gösterilmiştir. Varyans tek yönlü analizi, SSS ve BV'de kan akışının önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu (# P <0.001 ile MCA ve CAP; * P <0.001 vs. MCA ve CAP). Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. MRI doğrulama sonuçları. Küçük hayvan MRG'si, SSS'deki diş fişinin (siyah okla gösterilen) durumunu yatay (A), sagittal (B) ve koronal (C) konumlarından gösterir. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: CVST hayvan modellerinin dezavantajları.

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.