Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Sinoatriyal düğüm (SAN) fizyolojik olarak elektriksel dürtüyü başlatır ve bu nedenle kalbin birincil kalp pilidir. Atriyoventriküler düğüm (AVN), elektriksel impulsu atriyumdan ventriküllere iletir ve ayrıca yardımcı bir kalp pili¹ görevi görür. Genel olarak, elektriksel impulsların üretimi ve iletimi, SAN / AVN bölgelerindeki yerleşik makrofaj da dahil olmak üzere çeşitli faktörler² tarafından modüle edilebilen karmaşık bir süreçtir. Hulsmans ve ark. tarafından yapılan yeni bir çalışma, AVN'de zenginleştirilmiş ve sabit bir kalp atışı^3'ü tutmada kilit oyuncular olarak işlev gören belirli bir kardiyak yerleşik makrofajlar popülasyonunu göstermektedir. Makrofajların elektriksel olarak kardiyomiyositlere bağlandığını ve kuplajlı kardiyomiyositlerin elektriksel özelliklerini değiştirebileceğini bulmuşlardır. Yazarlar ayrıca, makrofajlarla iç içe geçen bu tür iletken hücrelerin, SAN gibi kardiyak iletim sisteminin diğer bileşenlerinde de bulunduğunu belirtmektedir.

Şu anda, yerleşik kardiyak makrofajların fenotipinin kardiyak bölgeler arasında farklılık gösterip göstermediği tam olarak bilinmemektedir. Bununla birlikte, doku mikroçevresinin doku makrofajlarının transkripsiyonunu ve proliferatif yenilenmesini etkileyebileceği gösterilmiştir⁴. Ayrıca, kardiyomiyosit fenotipinin bölgeler arasında farklı olduğu gösterildiğinden, makrofajların kardiyomiyositler üzerindeki fonksiyonel etkileri, makrofaj fenotipinin kendisi aynı olsa bile, bölgeye özgü olabilir. Bu nedenle, belirli kardiyak bölgeler üzerinde daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kararlı durumda, dokuda yerleşik makrofajların prenatal olarak kurulduğunu, kesin hematopoezden bağımsız olarak ortaya çıktığını ve yetişkinliğe kadar devam ettiğini göstermiştir⁵. Bununla birlikte, makrofaj tükenmesinden sonra veya kardiyak inflamasyon sırasında, Ly6c^hi monositleri kardiyak makrofaj popülasyonunun yenilenmesine katkıda bulunur⁶. Genetik soy izleme, parabiyoz, kader haritalama ve hücre izlemeyi içeren çalışmalar, organ ve dokularda çeşitli doku yerleşik makrofaj popülasyonlarının bir arada bulunduğunu ve ayrıca ontojeni 7,8,9 ile potansiyel olarak ilişkili makrofaj alt kümelerinin farklı hücresel davranışlarını göstermiştir.

Yerleşik kardiyak makrofajların karakterizasyonu, manyetik aktif hücre sıralama (MACS) ve floresan aktif hücre sıralama kullanımından yararlanmıştır. Bu yöntemler, spesifik hücre popülasyonlarını, hücre yüzey belirteçleriyle etiketleyerek çoklu doku fraksiyonlarından izole etmek için özellikle yararlıdır. Bu sadece izole edilmiş bağışıklık hücresi tipinin daha yüksek saflığına yol açmakla kalmaz, aynı zamanda fenotipik analize de izin verir. Burada, manyetik boncuk kaplı hücreleri içeren bir protokol ve ardından SAN ve AVN bölgesinden özel olarak izole edilen kardiyak yerleşik makrofajların zenginleştirilmesi için floresan aktif hücre ayıklama ile birlikte sunulmaktadır.

İletim sistemindeki kardiyak yerleşik makrofajların özelliklerini ve kardiyak iletim ve aritmiyogenez fonksiyonlarını araştırmak için, SAN ve AVN'nin kesin lokalizasyonu ve diseksiyonu kritik öneme sahiptir. SAN ve AVN'nin mikrodiseksiyonu için, bölge tanımlaması için anatomik işaretler kullanılır¹⁰. Kısacası SAN, superior vena kava ile sağ atriyumun birleştiği noktada yer almaktadır. AVN, triküspid kapağın septal broşürü ve arkadan Todaro^11'in tendonu ile ön sınırlanan Koch üçgeni içinde yer almaktadır. Ayrıca farelerde SAN ve AVN'nin histoloji ve immünofloresan boyama ile doğrulanan doğru bir mikrodiseksiyon prosedürünü de sağlıyoruz.

İzole edilmiş yerleşik makrofajlar, RNA dizilimi gibi daha ileri deneyler için kullanılabilir veya çeşitli in vitro deneylere izin vererek iki haftadan fazla bir süre boyunca geri kazanılabilir ve yetiştirilebilir. Bu nedenle, protokolümüz immüno-ritmolog için oldukça değerli bir prosedürü tanımlamaktadır. Tablo 1, ihtiyaç duyulan tüm çözümlerin bileşimini gösterir, Şekil 1 , SAN ve AVN için mikrodiseksiyon işaretlerini gösterir. Şekil 3 , SAN ve AVN'nin histolojik boyanmasını göstermektedir (Masson'un trikrom ve immünofloresan boyaması). Şekil 4 , floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile kardiyak yerleşik makrofajları izole etmek için adım adım bir geçit stratejisi göstermektedir.

Hayvan bakımı ve tüm deneysel prosedürler, Münih Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve fareler üzerinde yapılan tüm prosedürler Bavyera, Münih, Almanya Hükümeti tarafından onaylanmıştır. C57BL6/J fareler ticari olarak elde edildi.

1. Hazırlıklar

1. Hücre sıralama arabelleğini hazırlayın (Tablo 1) ve 4 °C'de saklayın.
   NOT: Tüm deneysel prosedür boyunca, hücre sıralama tamponu her zaman buz üzerinde olmalıdır.
2. Sindirim tamponunu hazırlayın (Tablo 1) sindirimden kısa bir süre önce, kollajenazın aktivitesi oda sıcaklığında sadece birkaç saat tespit edilebildiğinden.
3. Diseksiyon çanağı^10'un hazırlanması için daha önce yayınlanmış protokole bakınız. Kısacası, 100 mm çapında bir Petri kabına 30 mL agaroz jeli (% 3-4) ekleyin ve oda sıcaklığında soğutun.

2. Hayvan kurban ve kalp eksizyonu

1. Fareyi bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı ve %5 izofluran/%95 oksijen ile yıkanmış bir kuluçka odasına yerleştirerek izofluran ile uyuşturun.
2. Analjezi için fentanil enjeksiyonundan sonra, göğüs kafesini açın ve 5-10 mL buz gibi soğuk 1x PBS'yi doğrudan sol ventriküle (LV) enjekte ederek kalbi perfüze edin. Farelerin kalbini çıkarın ve diseksiyon kabına koyun. Deneysel detaylar daha önce¹⁰ ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

3. SAN ve AVN'nin mikrodiseksiyonu

1. Kalbi izole ettikten sonra, diseksiyon mikroskobu altında buz gibi soğuk 1x PBS ile diseksiyon kabında aşağıdaki mikrodiseksiyon prosedürlerini uygulayın.
2. Kardiyak anatomik yer işaretlerini kullanın, yani aort, pulmoner arter, koroner sinüs, sol / sağ ventrikül, vb. kalbin solunu/sağını (sol: LV; sağ: RV) ve anterior/posteriorunu (anterior: aort; posterior: koroner sinüs) belirlemek. Oryantasyon belirlendikten sonra, kalbin etrafında, tabağın dibinde önü olacak şekilde çevirin (posteriorda bulunan büyük damarları ortaya çıkarmak için).
3. SAN'ın mikrodiseksiyonu
   NOT: SAN'ın mikrodiseksiyonu daha önce tarif edilmiştir¹⁰. İşlem aşağıda kısaca açıklanmıştır.
   1. Sağ atriyal ekleri (RAA) ve superior vena kava (SVC) ve inferior vena kava'ya (IVC) bitişik dokuyu böcek pimleri kullanarak mikrodiseksiyon kabı üzerine sabitleyerek inter-kaval bölgeyi açığa çıkarın.
   2. Kavaller arası bölgeyi ayırmak ve SAN örneğini elde etmek için kalbi krista terminalise (BT) paralel olarak interatriyal septum boyunca kesin (Şekil 1A, Şekil 2A). Numuneyi buz üzerinde boş bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe koyun.
4. AVN'nin mikrodiseksiyonu
   1. SAN örneğinin toplanmasından sonra, RAA ve sağ atriyumun (RA) parçalarının zaten kesilmiş olduğundan emin olun, sadece interatriyal septum (IAS) ve interventriküler septum (IVS) bırakılır.
   2. Kalbin kalan kısımlarını, IAS'nin sağ atriyal tarafını yukarı bakacak şekilde yapmak için böcek pimleri kullanarak IAS ve IVS'ye bitişik dokudan geçirin.
   3. Koch üçgeni için endokardiyal yüzeydeki sağ atriyuma bakın. Ön tarafta, triküspid kapağın (TV) septal broşürünün menteşe çizgisi ve arkadan Todaro tendonu ile sınırlanacaktır. Koroner sinüsün deliği tabanda gözlenir. (Şekil 1B, Şekil 2B).
   4. AVN'yi içeren Koch üçgenini kesin ve doğrudan buz üzerinde boş bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne koyun.

4. Sindirim

1. Sindirim tamponunu (Tablo 1) kullanımdan kısa bir süre önce hazırlayın.
2. SAN ve AVN dokusunu neşterlerle iyice doğrayın.
   NOT: Dokuyu iyice kıymak, sindirim verimliliğini artıracak ve sıralama için iyi hücre süspansiyonu elde etmeye yardımcı olacaktır. SAN ve AVN numuneleri oldukça küçük olduğundan, numune kaybını azaltmak için dokunun doğrudan 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün içine kıyılması önerilir.
3. Numune başına 500 μL sindirim tamponu ekleyin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün duvarından tüm kıyılmış dokuları yıkayın. Nazik pipetleme numunenin sindirilmesine yardımcı olur.
4. Tüpü bir vorteks makinesinde homojenize edin (ayarlar: 37 °C, 1 saat için 750 rpm).
5. Sindirimden sonra, doku süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek taze bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Sindirimi durdurmak için hücre süzgecini ilave 5 mL hücre sıralama tamponu ile durulayın.
6. 15 mL tüpü 350 x g'de 4 ° C'de 7 dakika boyunca santrifüj yapın. Ardından pipeti kullanarak süpernatantı tamamen çıkarın. Hücre peletini 90 μL hücre sıralama tamponu ile yeniden askıya alın.
   NOT: Manyetik ayırmadan önce, ilginç hücre popülasyonlarının manyetik zenginleştirilmesinin optimum performansı için tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere, gerekirse hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu birkaç kez hafifçe pipetleyin veya 30 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.

5. CD45'in manyetik zenginleştirilmesi ve numune boyama

NOT: Kardiyak makrofajları yüksek ayıklama etkinliği ile izole etmek için, lenfositler de dahil olmak üzere istenmeyen hücrelerin dışlanması, üreticinin protokolüne göre CD45 mikroboncukları ile gerçekleştirildi. Sıralama paneline dayanarak, kardiyak yerleşik makrofajlar CD45 yüksek CD11b yüksek CD64^yüksek Ly6C düşük/int F4^/80^yüksekolarak tanımlandı.

1. 15 mL santrifüj tüpündeki hücre süspansiyonuna 10⁷ toplam hücre başına 10 μL CD45 mikroboncuk ekleyin. Numuneleri iyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı, her tüpün toplam 10^7'den fazla hücre içermediğinden emin olmak için kısaca yapılmalıdır. Daha yüksek hücre numaralarıyla çalışırken, manyetik boncukların hacminin büyütülmesi gerekir.
2. Hücre sıralama tamponunda aşağıdaki antikorları seyrelterek antikor karışımını hazırlayın (her antikor için 1:100 seyreltme): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI daha sonra canlı/ölü ayrımcılığı için boyamaya eklenecektir.
3. 15 dakikalık manyetik boncuk inkübasyonundan sonra, 15 mL tüpteki hücre süspansiyonuna doğrudan 100 μL antikor karışımı ekleyin (daha sonra tüm antikorların nihai konsantrasyonu 1:200'dür) ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
4. 20 dakikalık antikor inkübasyonundan sonra, 10⁷ hücre başına 1-2 mL hücre sıralama tamponu ekleyerek hücre süspansiyonunu yıkayın ve 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı pipetle tutarak tamamen çıkarın.
5. 500 μL hücre sıralama arabelleğinde 10^{adede kadar 8} hücreyi yeniden askıya alın.
   NOT: Manyetik ayırma için maksimum hücre sayısı, üreticinin protokolüne göre belirlenmelidir.
6. Manyetik ayırma setini hazırlayın.
   1. Manyetik kolonu uygun bir manyetik ayırıcıya takın ve manyetik sütunun altına bir toplama tüpü yerleştirin.
   2. Manyetik sütunları hücre sıralama tamponuyla durulayarak hazırlayın: sütunun üstüne 500 μL hücre sıralama arabelleği ekleyin ve arabelleğin geçmesine izin verin.
7. Hücre sıralama arabelleği geçerken hücre süspansiyonunu hemen sütuna uygulayın.
   NOT: Kolonda hava kabarcıkları oluşmasını önleyin. Üreticinin protokolüne göre, kolon doldurma süresi depolama koşullarından değişebilse de, ayırmanın kalitesi üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
8. Kolonu 3 x 500 μL hücre sıralama tamponuyla yıkayın. Adım 5.7 ve adım 5.8'deki akış, başka bir deneye gerek yoksa atılabilen etiketsiz hücreler içerir.
   NOT: Sütun deposu neredeyse boşaldığında hücre sıralama arabelleğini hemen ekleyin.
9. Kolonu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
10. Sütuna 1 mL hücre sıralama arabelleği ekleyin. Kolon ile birlikte verilen pistonu sıkıca uygulayarak kolonu hemen yıkayın. Akış, manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri içerir.
11. DAPI çözeltisini, toplanan manyetik olarak etiketlenmiş tüm hücre süspansiyonlarına, hücre sıralayıcısında çalıştırmadan kısa bir süre önce ekleyin. DAPI'nin son konsantrasyonunu 0,3-0,5 μg/mL'ye ayarlayın.
12. FACS analizi gerçekleştirin.

6. Tazminat için örnekler

1. Antikorları ışıktan korumak için sırasıyla "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" ve "DAPI" olarak etiketlenmiş 6 kahverengi 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. "Lekesiz" olarak etiketlenmiş bir adet daha 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
   NOT: Bu, hücre süspansiyonunun mikroboncuklar ve antikorlarla inkübe edilmesiyle aynı anda yapılabilir. Lekesiz örnek, korunmuş kalp dokusundan rastgele toplanan ve ayrıca adım 4'e göre tedavi edilen kardiyomiyosit dokusu olabilir.
2. Her bir floresan konjuge antikoru, buna göre işaretlenmiş 1.5 mL kahverengi mikrosantrifüj tüplerinde hücre sıralama tamponu ile 1:50'ye seyreltin.
3. Bir damla kompanzasyon boncuk çözeltisi ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
4. Her 1,5 mL kahverengi mikrosantrifüj tüpüne 2 mL hücre ayırma tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı tamamen atın ve 300 μL hücre sıralama tamponu ile pelet içeren boncuk içeren resuda alın ve bunları da buna göre işaretlenmiş hücre sıralayıcı tüplerine aktarın.

7. Hücre sıralayıcısı ve geçit stratejisi üzerinde çalışmak

1. Önce lekesiz numune ve kompanzasyon tüplerini uygulayın ve hem pozitif hem de negatif tepeyi eksenin uygun konumuna hizalamak için her kanalın voltajlarını ayarlayın. Ücret ayarlarını kaydedin ve aşağıdaki örneklere uygulayın.
2. Örnekleri hücre sıralayıcısına uygulayın. Geçit stratejisini Şekil 4'te açıklandığı gibi ayarlayın. Kardiyak yerleşimli makrofajlar CD45 yüksek CD11b yüksek CD64 yüksek Ly6C^düşük/int F4/80^yüksekolarak tanımlanır. DAPI, hücre canlılığı belirteci olarak kullanılır.
3. İlgilenilen hücre popülasyonunun grafiklerde düzgün bir şekilde gösterildiğini onaylamak için akış sitometrisi grafiklerini kontrol edin. Değilse, her kanalın voltajını her grafiğin merkez görünümüne ayarlayın.
4. Voltaj ayarları tatmin ediciyse, sıralama prosedürünü başlatın. Sıralanmış hücre popülasyonunu, 100 μg / mL streptomisin ve 100 U / mL penisilin ile desteklenen% 10 fetal sığır serumu içeren DMEM'den oluşan kültür ortamına toplayın.

8. Yerleşik makrofajlar kültürü

1. Sıralanmış makrofajları topladıktan sonra, hücreleri derhal 35 mm doku kültürü kaplarına veya 24 kuyucuk plakasına aktarın veya sonraki deneyler için doğrudan kullanın.
2. Makrofajları kültüre ayırmak için, hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO₂ inkübatöründe inkübe edin.
3. Kültür ortamını her 48-72 saatte bir değiştirin. Yüzen ölü hücreler orta değişimle kolayca çıkarılabilir. Sonraki deneyler için kültür kabının dibine tutturulmuş canlı makrofajlar kullanın.

Kardiyak yerleşik makrofajların özellikle SAN ve AVN bölgesinden izolasyonu için pratik bir prosedür tanımladık. Doğru diseksiyonu doğrulamak için, Masson Trikrom boyama ve immünofloresan HCN4-boyama yapılır (Şekil 3)12. Bu protokolle, bütün bir kalpten yaklaşık 60.000 makrofaj toplayabiliriz. Şekil 4, kardiyak makrofajları sıralamak için geçit stratejisini göstermektedir. Canlı yerleşimli kardiyak makrofajlar CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C- olarak tanımlandı. Şekil 5'te CD45, F4/80 ve CD11b yüzey antijenleri ile tanımlanan yeni sıralanmış kardiyak makrofajlar görülmektedir. Sıralanan hücreler florofor-PE kanalı altında gözlendiğinde CD45 (CD45+) için pozitifti (Şekil 5B). Florofor-APC-Cy7 kanalı altında gözlendiğinde sıralanmış hücrelerin aynı görünümü CD11b+ fenotipini göstermiştir (Şekil 5C). Florofor-PE-Cy7 kanalı altında gözlendiğinde sıralanmış hücrelerin aynı görünümü F4/80+ fenotipini göstermiştir (Şekil 5D). Şekil 5E, sıralanmış hücreler için floresan mikroskop ile elde edilen birleştirilmiş görüntüdür. Bu üçlü pozitif hücreler kardiyak yerleşimci makrofajlar olarak tanımlandı. Şekil 6, 6 güne kadar orta düzeyde kültürlenmiş izole kardiyak makrofajları göstermektedir. Beyaz oklar makrofajları, siyah oklar yüzen yuvarlak şekilli ölü hücreleri gösterir.

Resim 1: Diseksiyon mikroskobu altında SAN ve AVN'nin anatomisi. (A) Diseksiyon mikroskobu altında SAN'ın anatomisi. SAN'ın konumu, kavaller arası bölge içindeki kırmızı kesikli çizgi (siyah kesikli çizgiler) ile gösterilir. (B) Dezenfeksiyon mikroskobu altında AVN'nin anatomisi. Bu rakam daha önce yayınlanmış10. maddeden değiştirilmiştir. AVN (kırmızı kesikli daire), membranöz septumun dibine yakın Koch üçgeninin (beyaz kesikli üçgen) tepesinde bulunur. Koch üçgeni, Todaro tendonu (TT, yeşil kesikli çizgi), triküspid kapak (TV, mavi kesikli çizgi) ve koroner sinüsün deliğinden (CS, sarı kesikli çizgi) oluşur. SVC, superior vena cava; IVC, inferior vena kava; IAS, interatriyal septum; RA, sağ atriyum; RAA, sağ atriyal apendiks; RV, sağ ventrikül; BT, Crista terminalleri; IVS, interventriküler septum; OF, oval fossa. PA, pulmoner arter; RV, sağ ventrikül; LV, sol ventrikül. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: SAN ve AVN lokalizasyonunun şematik gösterimi. (A) SAN lokalizasyonunun şematik gösterimi. SAN, BT'nin yanı sıra kavaller arası bölgede kırmızı kesikli bir daire ile gösterilir (siyah kesikli çizgi). (B) AVN lokalizasyonunun şematik gösterimi. AVN, TV ve CS. SVC, superior vena cava'nın deliğinden oluşan Koch üçgeni (gri kesikli üçgen) içindeki kırmızı kesikli bir daire ile gösterilir; IVC, inferior vena kava; IAS, interatriyal septum; RA, sağ atriyum; RAA, sağ atriyal apendiks; BT, Crista terminalleri; IVS, interventriküler septum; OF, oval fossa; IVS, interventriküler septum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: SAN ve AVN'nin histolojik boya ile tanımlanması. SAN (A,B) ve AVN (C,D)'nin tanımlanması. SAN (A) ve AVN'de (C) HCN4 pozitif iletim sistemi hücrelerinin immünofloresan boyanması ve Masson'un SAN (B) ve AVN'nin (D) trikrom boyaması. Kırmızı oklar sinüs düğümü arterini (SNA, B), siyah ok ve siyah kesikli çizgi kompakt AVN'yi, mavi ok merkezi fibröz gövdeyi (CFB) gösterir. BT, crista terminalleri; CFB, merkezi fibröz gövde; CN, kompakt AVN; RA, sağ atriyum; RV, sağ ventrikül; IAS, interatriyal septum; IVS, interventriküler septum; TV, triküspid valf; MV, mitral kapak. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Yerleşik kardiyak makrofajların hücre sıralaması için geçit stratejisi. Mononükleer hücreler tanımlanır, FSC-W ve FSC-A tarafından çiftler dışlanır ve ölü hücreler DAPI (A-D) tarafından dışlanır. Canlı hücreler CD45 + lökositler (E) üzerinde kapılanır ve daha sonra CD11b + miyeloid hücreler (F) üzerinde kapılanır. Kardiyak makrofajlar hem F4/80 hem de CD64 (G) ekspresyonu ile tanımlandı ve son olarak Ly6C ekspresyonu (H) ile tabakalaştırıldı. Canlı yerleşimli kardiyak makrofajlar CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C- olarak tanımlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yeni sıralanmış kardiyak makrofajlar ve immünofloresan boyama. (A) Yeni sıralanmış kardiyak makrofajlar. CD45 (B), CD11b (C) veya F4/80 (D) gibi spesifik yüzey antijenlerinin immünofloresan boyanması. Geçit stratejisine göre, kardiyak makrofajlar üçlü pozitif hücreler (E) olarak tanımlanır. Ölçek çubuğu 50 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Sıralanmış makrofajların kültürü. Kültür ortamında sıralanmış makrofajların kültürü sırasıyla 48 saat (A, B), 96 saat (C,D) ve 6 gün (E,F) boyunca. Zaman noktası başına iki ayrı kültür yemeği gösterilir (çanak 1: A, C, E; çanak 2: B, D, F). Beyaz oklar, iğ benzeri şekle ve tipik çıkıntılara sahip canlı makrofajları gösterir3. Siyah oklar yüzen yuvarlak şekilli ölü hücreleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Gerekli çözeltilerin bileşimi.

Bu makaleyle ilgili herhangi bir potansiyel çıkar çatışması bildirilmemiştir.