Protokol, yetişkin ve yavru koyun oositlerinin vitrifikasyonu için standart bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Tüp bebek medyasının hazırlanmasından ısınma sonrası kültüre kadar tüm adımları içerir. Oositler, minimum temel hacmi sağlamak için Cryotop kullanılarak MII aşamasında vitrifiye edilir.
Hayvancılıkta, bir mezbahadan kolayca elde edilebilen çok sayıda yumurtalık ve oosit sayesinde in vitro embriyo üretim sistemleri geliştirilebilir ve sürdürülebilir. Yetişkin yumurtalıklar her zaman birkaç antral folikül taşırken, pubertal öncesi donörlerde, yumurtalıkların antral foliküllerin en yüksek sayılarını taşıdığı 4 haftalıkken maksimum sayıda oosit mevcuttur. Bu nedenle, 4 haftalık kuzular, prepubertal oositlerin gelişimsel yeterliliği yetişkin meslektaşlarına kıyasla daha düşük olsa bile iyi donör olarak kabul edilir.
Temel araştırmalar ve ticari uygulamalar, hem yetişkin hem de prepubertal donörlerden elde edilen vitrifiye oositlerin başarıyla kriyoprezer tasarrufu olasılığı ile artırılacaktır. Prepubertal donörlerden toplanan oositlerin vitrifikasyonu da üretim aralığının kısaltılmasına ve böylece üreme programlarındaki genetik kazancın artırılmasına olanak sağlayacaktır. Bununla birlikte, kriyoprezervasyondan sonra gelişimsel potansiyelin kaybı, memeli oositleri muhtemelen kriyoprezervasyonu en zor hücre türlerinden biri haline getirir. Mevcut kriyoprezervasyon teknikleri arasında vitrifikasyon hayvan ve insan oositlerine yaygın olarak uygulanmaktadır. Teknikteki son gelişmelere rağmen, yüksek konsantrasyonlarda kriyoprotektif ajanların yanı sıra ürpertici yaralanma ve ozmotik strese maruz kalmak hala birkaç yapısal ve moleküler değişikliğe neden olmakta ve memeli oositlerin gelişim potansiyelini azaltmaktadır. Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce olgunlaşmış in vitro koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kuluçka dönemine kadar tüm prosedürleri içerir. MII aşamasında vitrifiye edilen oositler ısınmadan sonra gerçekten döllenebilir, ancak kriyoprezervasyon prosedürleri nedeniyle hasarı geri yüklemek ve gelişim potansiyellerini artırmak için döllenmeden önce ekstra zamana ihtiyaçları vardır. Bu nedenle, ısınma sonrası kültür koşulları ve zamanlama, özellikle oositler genç donörlerden toplandığında, oosit gelişim potansiyelinin restorasyonu için çok önemli adımlardır.
Dişi gametlerin uzun süreli depolanmasının, genetik seçim programlarıyla evcil hayvan yetiştiriciliğinin iyileştirilmesi, ex-situ yaban hayatı türlerinin korunması programı ile biyoçeşitliliğin korunmasına katkıda bulunması ve in vitro embriyo üretimi veya nükleer transplantasyon programlarına dahil edilecek depolanmış oositlerin mevcudiyeti sayesinde in vitro biyoteknoloji araştırma ve uygulamalarının artırılması gibi çok çeşitli uygulamalar sunabilir1,2,3. Juvenil oosit vitrifikasyonu da üreme programlarında üretim aralığını kısaltarak genetik kazancı artıracaktır4. Oositlerin ultra hızlı soğutulması ve ısıtılması ile vitrifikasyon şu anda hayvancılık oositleri kriyoprezervasyonu için standart bir yaklaşım olarak kabul edilir5. Ruminantlarda, vitrifikasyondan önce, oositler genellikle in vitro olarak olgunlaştırılır, a sittoir türevi yumurtalıklardan elde edilen foliküllerden alındıktan sonra2. Yetişkin ve özellikle prepubertal yumurtalıklar4,6, gerçekten kriyoprezerserved için neredeyse sınırsız sayıda oosit sağlayabilir.
Sığırlarda, oosit vitrifikasyonu ve ısınmadan sonra, son on yılda birkaç laboratuvar tarafından yaygın olarak bildirilen % 10′> blastosist verimi3. Bununla birlikte, küçük ruminantlarda oosit vitrifikasyonu hem genç hem de yetişkin oositler için hala nispeten yeni kabul edilir ve koyun oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntem kurulmaya devam eder2,5. Son gelişmelere rağmen, vitrifiye edilmiş ve ısıtılmış oosit gerçekten de gelişim potansiyellerini sınırlayan çeşitli fonksiyonel ve yapısal değişiklikler sunar7,8,9. Bu nedenle, çok az makale% 10 veya daha fazla vitrifiye / ısıtılmış koyun oositleri2blastosist gelişimini bildirmiştir. Yukarıda belirtilen değişiklikleri azaltmak için çeşitli yaklaşımlar araştırılmıştır: vitrifikasyon ve çözülme çözeltilerinin bileşimini optimize etmek10,11; farklı kriyo cihazlarının kullanımı ile deneme8,12,13; ve in vitro olgunlaşma (IVM)4, 14,15ve/veya ısınmadan sonraki iyileşme süresi sırasında özel tedaviler uygulamak6.
Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce in vitro olarak olgunlaşan koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kültür dönemine kadar tüm prosedürleri içerir.
Evcil hayvanlarda oosit kriyoprezervasyonu sadece dişi genetik kaynakların uzun süreli korunmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda embriyonik biyoteknolojilerin gelişimini de ilerletebilir. Bu nedenle, oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntemin geliştirilmesi hem hayvancılık hem de araştırma sektörüne avantaj sağlayacaktır. Bu protokolde, yetişkin koyun oosit vitrifikasyonu için eksiksiz bir yöntem sunulmaktadır ve juvenil oosit için etkili bir vitrifikasyon sisteminin geliştirilmesi için …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar bu çalışma için özel bir fon almadılar. Profesör Maria Grazia Cappai ve Dr. Valeria Pasciu, video seslendirmesi ve video yapımı sırasında laboratuvarı kurmaları için minnettar bir şekilde kabul edilmektedir.
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |