Burada, periferik kan doğal öldürücü (PBNK), karaciğer dokularından NK hücreleri ve periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ler) veya kordon kanından (CB) türetilen kimerik antijen reseptörü (CAR)-NK hücrelerini genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, genişlemiş NK hücrelerinin optimize edilmiş saflığına ek olarak, 221-mIL-21 besleyici hücreler kullanılarak NK ve CAR-NK hücrelerinin genişlemesini göstermektedir.
Kimerik antijen reseptörü (CAR) modifiye immün hücre tedavisi, kanserler ve bulaşıcı hastalıklar için gelişmekte olan bir tedavi haline gelmiştir. NK bazlı immünoterapi, özellikle CAR-NK hücresi, hayatı tehdit eden ciddi toksisite olmaksızın en umut verici ‘kullanıma hazır’ gelişmelerden biridir. Bununla birlikte, başarılı bir CAR-NK tedavisi geliştirmenin darboğazı, üçüncü bir taraftan yeterli sayıda kapsamlı olmayan, uzun ömürlü, ‘kullanıma hazır’ CAR-NK hücresi elde etmektir. Burada, genetiği değiştirilmiş bir interlökin-21 (IL-21) membran formunu ifade eden bir Epstein-Barr virüsü (EBV) dönüştürülmüş B hücre hattı kullanarak yeni bir CAR-NK genişleme yöntemi geliştirdik. Bu protokolde, NK ve CAR-NK hücrelerini kordon kanı ve periferik kandan ve ayrıca katı organ dokularından genişletmek için adım adım prosedürler sağlanmaktadır. Bu çalışma, CAR-NK immünoterapisinin klinik gelişimini önemli ölçüde artıracaktır.
Doğal öldürücü (NK) hücreler, CD56’yı eksprese eden ve T hücre belirteci CD3 1,2’nin ekspresyonundan yoksun lenfositlerin önemli bir alt kümesidir. Konvansiyonel NK hücreleri, viral olarak enfekte olmuş hücrelerin ve kanserli hücrelerin immünsüveyöründen sorumlu doğuştan gelen immün hücreler olarak sınıflandırılır. T hücrelerinin aksine, NK hücreleri CD16 veya diğer aktive edici reseptörleri kullanarak enfekte veya malign hücreleri tanır ve antijen peptitleri ile majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I molekülleri 3,4 arasında bir kompleks oluşumunu gerektirmez. Relaps veya refrakter CD19 pozitif kanserleri (Hodgkin dışı lenfoma veya kronik lenfositik lösemi [CLL]) tedavi etmek için kimerik antijen reseptörü (CAR)-NK hücrelerini kullanan son klinik araştırmalar, CAR-NK hücrelerinin olağanüstü güvenlik avantajlarını göstermiştir5. Örneğin, CAR-NK hücre infüzyonu minimal veya ihmal edilebilir greft versus host hastalığı (GVHD), nörotoksisite, kardiyotoksisite ve sitokin salınım sendromu (CRS) 6,7,8,9,10 ile ilişkilidir. Bununla birlikte, insan NK hücrelerini genişletmeye yönelik geleneksel yöntemler, güçlü kardeş öldürücü öldürme ve telomer kıtlığı ile kapsamlı fenotipler göstermiştir, bu da evlat edinilmiş immünoterapi için yeterli sayıda fonksiyonel NK hücresi elde etmede büyük bir zorluk teşkil etmektedir11.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, birincil NK hücrelerini doğrudan fraksiyone edilmemiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ler) veya kordon kanından (CB) ışınlanmış ve genetiği değiştirilmiş bir 721.221 (bundan böyle 221) hücre hattı, MHC sınıf I moleküllerinin düşük ekspresyonuna sahip bir insan B-lenfoblastoid hücre hattı kullanarak genişletmek için bir yöntem geliştirilmiştir3. Önceki çalışmalar IL-21’in NK hücre genişlemesindeki önemini göstermiştir; Bu nedenle, 721.221 hücre hattının bir versiyonunu ifade eden genetiği değiştirilmiş membrana bağlı bir IL-21 (şu andan itibaren, 221-mIL-21) 11,12,13,14,15 geliştirilmiştir. Sonuçlar, 221-mIL-21 besleyici hücre genişletilmiş birincil NK hücrelerinin, yaklaşık 2-3 hafta boyunca kalıcı yüksek NK hücre saflığı ile ortalama >40.000 kata kadar genişlediğini göstermiştir. Bu protokolün uygulanmasıyla ilgili ek bilgiler Yang ve ark.16’da bulunabilir.
Bu protokol, PBNK, CBNK, doku kaynaklı NK ve CAR-NK hücrelerinin ex vivo olarak yeni genişlemesinin adım adım prosedürünü göstermeyi amaçlamaktadır.
Klinik çalışmalardaki mevcut CAR-NK ürünlerinin çoğu, Hodgkin dışı lenfoma hastası18’den izole edilmiş bir hücre hattı olan NK-92, NK-92MI, IL-2 bağımsız NK-92 hücre hattı19 ve büyük granüler lenfosit hastası20’den izole edilen NKL gibi NK hücre hatları17’yi kullanmaktadır, çünkü bu hücre hatları ‘kullanıma hazır’ ürünler için kolayca proliferatif olmaktadır. Bununla birlikte, bu hücre hatları, örneğin NK-92 hücreleri, infüzyondan önce ışınlama gerektirdiğinden, marjinal klinik etkinliklere ve in vivo genişlemeye sahiptir, böylece proliferasyonlarını ve sitotoksisitelerini in vivo21 sınırlarlar. Bu nedenlerden dolayı, periferik kan, CB, kemik iliği (BM), insan embriyonik kök hücreleri (HSC’ler), indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler) ve tümör dokuları21,22,23 dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan birincil NK hücrelerini genişletmek için çeşitli stratejiler araştırılmaktadır. Örneğin, NK hücreleri IL-15, IL-18 ve IL-21 dahil olmak üzere interlökinler kullanılarak ex vivo olarak genişletilebilir. K562 hücreleri gibi lenfoblastoid hücre hatları veya 721.221 hücreleri gibi Epstein-Barr Virüsü ile dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre hatları da NK hücre genişlemesiiçin kullanılır 16. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen stratejiler genellikle CAR-NK immünoterapisinin evlat edinilmiş bir transferi için yetersiz sayıda NK hücresi üretir22,24. Sorunun çözülmesine yardımcı olmak için, buradaki çalışma, genetiği değiştirilmiş bir EBV dönüştürülmüş hücre hattı, 221-mIL-21 besleyici hücreler kullanarak bir ex vivo NK hücre genişlemesi için bir protokol göstermektedir.
Bu protokolde gösterilen 221-mIL-21 besleyici hücreleri kullanan genişleme metodolojisi, HL-60 ve OCl-AML3 eksprese membran IL-21, K562 ve OX40ligand 22,24,25’i eksprese eden K652-mIL21 dahil olmak üzere diğer lösemi hücre hatlarından en az 10 ila 100 kat daha yüksek bir genişleme oranına sahip NK hücrelerini genişletmek için optimize edilmiştir. CAR ekspresyonu da yaklaşık 2 hafta ex vivo olarak değerlendirilir. Daha da önemlisi, 221-mIL-21 besleyici hücre genişletme stratejisi, NK hücrelerini PBMC’ler, CB ve karaciğer gibi katı organlar dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan ilk NK zenginleştirme adımı olmadan genişletmek için uygulanabilir. 221-mIL-21 besleyici sistemi, yukarıda belirtilen besleyici hücre hatları kadar donöre bağımlı olmasa da, donörlerden tamamen bağımsız değildir. Ortalama olarak, 221-mIL-21 genişleme sistemi, yüksek NK hücre sayısı ile NK hücre saflığının% 90’ını elde edebilir ve genişleme sonrası 14. günde T hücresi kontaminasyonunun yaklaşık% <5'ini elde edebilir. Bu nedenle, T hücresi kontaminasyon olasılığını ortadan kaldırmak için, ex vivo genişlemeden önce elde edilen numunelerden NK hücrelerini izole etmek veya ex vivo genişlemeden sonra T hücrelerini ortadan kaldırmak için bir CD3 + seçim sistemi kullanmak gerekir.
Bir NK hücre genişleme sisteminin kullanılmasındaki eleştirilerden biri, besleyici hücrelerin genişlemeden sonra veya önemli düzenleyici kaygılara sahip olabilecek bir transfüzyondan önce tamamen yok edilmemiş olabileceğidir; Bu nedenle, bir transfüzyondan önce besleyici hücrelerin tamamen yok edilmesi çok önemlidir. Bununla birlikte, ex vivo CBNKhücre genişlemesi 24,25 için K562-mIL21-4-1BBL besleyici hücrelerin kullanıldığı son CAR-NK klinik çalışmaları, ilgili herhangi bir komplikasyon göstermemiştir. Ayrıca, ön verilerimiz, genişleme ilerledikçe ışınlanmış 221-mIL-21 popülasyonunun kademeli olarak azaldığını göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). Ancak bu genişleme yönteminin klinik ortamda uygulanabilmesi için daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır. Toplu olarak, 221-mIL-21 genişleme sistemi, birincil CAR-NK hücrelerinin genişletilmesi zorluğunun çözülmesine yardımcı olur ve bu nedenle yakın gelecekte CAR-NK hücre bazlı immünoterapinin daha geniş kullanımına önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Liu laboratuvarı üyelerine (Dr. Hsiang-chi Tseng, Dr. Xuening Wang ve Dr. Chih-Hsiung Chen) el yazmaları hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. SFG vektörleri için Dr. Gianpietro Dotti’ye ve 721.221 hücreleri için Dr. Eric Long’a teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) ve Rutgers-Health Advance Funding (NIH REACH programı), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti ve R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) ve D. Liu Laboratuvarı için Rutgers Üniversitesi-New Jersey Tıp Fakültesi Başlangıç fonundan desteklenmiştir.
100 mm surface treated sterile tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | For transfection |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | For transfection |
6-well G-REX plate | Wilson Wolf | 80240M | For NK cell expansion |
AF647-conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 109-606-088 | For flow cytometry |
CAR construct in SFG vector | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
Collagenase IV | Sigma | C4-22-1G | For TILs isolation |
Cryopreserve media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 90% |
Cryopreserve media Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
Sigma | D2050 | 10% |
D-10 media Ingredient: DMEM |
VWR | 45000-304 | |
D-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
D-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
FastFlow & Low Binding Millipore Express PES Membrane | Millex | SLHPR33RB | For transduction |
Genejuice transfection reagent | VWR | 80611-356 | For transfection |
gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | For TILs isolation |
gentleMACS Octo | Miltenyi Biotec | Quote | For TILs isolation |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS – w/o calcium or magnesium) | ThermoFisher | 14170120 | For TILs isolation |
Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | For NK cell expansion |
Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | For NK cell expansion |
Irradiated 221-mIL21 feeder cells | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | Frozen in cryopreserve media | |
Lymphocyte Separation Media | Corning | 25-072-CV | For TILs isolation |
OPTI-MEM | ThermoFisher | 31895 | For transfection |
PE anti-human CD3 clone HIT3a | Biolegend | 300308 | For flow cytometry |
PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11 | BioLegend | 362509 | For flow cytometry |
Pegpam3 plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
Percoll | GE Healthcare | 17089101 | For TILs isolation |
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) | New York Blood Center | Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For transduction |
pRDF plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
R-10 media Ingredients: RPMI 1640 |
VWR | 45000-404 | |
R-10 media Ingredient: L-glutamine |
VWR | 45000-304 | 1% |
R-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
R-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
Retronectin | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | home-made | For transduction |
Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | For cell counting |
Untreated 24-well plate | Fisher Scientific | 13-690-071 | For transduction |