Özet

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Published: July 01, 2021
doi:

Özet

Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.

Abstract

Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi (UFFCS), lazer cımbızına dayanan tek moleküllü bir tekniktir ve yük altındaki hem geleneksel hem de konvansiyonel olmayan miyosinlerin kemomekaniğinin benzeri görülmemiş bir zaman çözünürlüğü ile araştırılmasını sağlar. Özellikle, aktin-miyozin bağ oluşumundan hemen sonra sabit kuvvet altında miyozin motorlarının araştırılması olasılığı, kuvvet geri bildiriminin yüksek oranı (200 kHz) ile birlikte, UFFCS’nin miyozin çalışma inmesi gibi hızlı dinamiklerin yük bağımlılığını incelemek için değerli bir araç olduğunu göstermiştir. Ayrıca, UFFCS, prosesif ve prosesif olmayan miyosin-aktin etkileşimlerinin uygulanan kuvvetin yoğunluğu ve yönünden nasıl etkilendiğinin incelenmesini sağlar.

Bu protokolü izleyerek, prosesif miyosin-5 motorlarında ve çeşitli geleneksel olmayan miyosinlerde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri yapmak mümkün olacaktır. Bazı ayarlamalarla, protokol kinesinler ve dineinler gibi diğer proses motor sınıflarının incelenmesine de kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlamaya, kalibrasyon prosedürlerine, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları içerir.

Introduction

Son yıllarda optik cımbız, eşzamanlı manipülasyon ve konformasyonel değişikliklerin ve enzimatik kinetiğin ölçülmesinin çarpıcı olasılığı nedeniyle, tek molekül düzeyinde protein etkileşimlerinin mekanokimyasını aydınlatmak için değerli bir araç olmuştur 1,2. Özellikle, hücredeki moleküler motorlar tarafından uygulananlar aralığındaki kuvvetleri uygulama ve ölçme yeteneği, nanometre altı konformasyonel değişiklikleri ölçme kapasitesiyle birlikte, optik cımbızları, motor proteinlerinin kemomekanik özelliklerini ve mekanik düzenlemelerini çözmek için benzersiz bir tek moleküllü araç haline getirmiştir.

Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi (UFFCS), üç boncuklu bir geometride yük altındaki moleküler motorların hızlı kinetiğini incelemek için geliştirilmiş, optik cımbızlara dayanan tek moleküllü bir kuvvet-spektroskopi tekniğidir (Şekil 1a)3,4. UFFCS, motor proteine kuvvet uygulama gecikmesini optik cımbızların fiziksel sınırına, yani sistemin mekanik gevşeme süresine indirir, böylece bir miyozin çalışmasının başlamasından sonra kuvvetin hızla uygulanmasına izin verir (birkaç on mikrosaniye)3. Bu yetenek, hızlı iskelet 3 ve kardiyak5 kas miyozinindeki erken mekanik olayları araştırmak için güç çarpmasının yük bağımlılığını, zayıf ve güçlü bağlanma durumlarını ve ayrıca biyokimyasal (Pi) ve mekanik (powerstroke) olayların sırasını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır.

Üç boncuklu geometri genellikle işlemsel olmayan motorları incelemek için kullanılır, kuvvet kelepçeli tek bir boncuk geometrisi, miyozin Va6 gibi işlemsel geleneksel olmayan miyosinleri araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, işlemsel miyosinler için de üç boncuklu bir UFFCS testini tercih etmenin birkaç nedeni vardır. İlk olarak, aktin-miyozin bağlanmasından hemen sonra yükün hızlı bir şekilde uygulanması, işlemsel olmayan motorlarda olduğu gibi kuvvet gelişimindeki erken olayların ölçülmesine izin verir. Ek olarak, prosesir motorlar söz konusu olduğunda, motorun çalışma uzunluklarının ve çalışma sürelerinin, ilerlemeleri boyunca sabit kuvvet altında doğru bir şekilde ölçülmesini de sağlar (Şekil 1b). Ayrıca, kuvvet geri bildiriminin yüksek oranı nedeniyle, sistem miyozin çalışma stroku gibi pozisyondaki hızlı değişiklikler sırasında kuvveti sabit tutabilir, böylece motor basamağı sırasında sabit bir yükü garanti eder. Sistemin yüksek zamansal çözünürlüğü, sub-ms etkileşimlerinin tespit edilmesine izin verir ve miyozinin aktin’e zayıf bağlanmasını araştırma olasılığını açar. Son olarak, tahlil geometrisi, kuvvetin ihmal edilebilir enine ve dikey bileşenleri ile aktin filamenti boyunca uygulandığını garanti eder. Bu nokta, dikey kuvvet bileşeninin, motorun kinetik 7,8’inin yüke bağımlılığını önemli ölçüde etkilediği gösterildiğinden, özellikle önemlidir. Bu tekniği kullanarak, prosesif miyosin-5B’ye bir dizi yardımcı ve dirençli yük uygulayabilir ve çok çeşitli kuvvetler için prosesinin yük bağımlılığını doğrudan ölçebiliriz4.

Şekil 1a’da gösterildiği gibi, bu sistemde çift optik cımbızın (“dambıl”) odağında sıkışmış iki polistiren boncuk arasında tek bir aktin filament asılıdır. Dengesiz bir net kuvvet F = F1-F 2, filamente hızlı bir geri besleme sistemi aracılığıyla empoze edilir, bu da filamentin net kuvvetin ters yönde tersine çevrildiği kullanıcı tanımlı bir ters çevirme noktasına ulaşana kadar bir yönde sabit hızda hareket etmesini sağlar. Motor protein filament ile etkileşime girmediğinde, dambıl, üzerine tek bir motor proteininin tutturulduğu kaide boncuğuna yayılan üçgen dalga şeklinde (Şekil 1b, alt panel) ileri geri hareket etmekte serbesttir. Etkileşim kurulduktan sonra, dambıl tarafından taşınan kuvvet çok hızlı bir şekilde motor proteinine aktarılır ve motor, miyozin aktinden ayrılana kadar, etkileşim sırasında geri besleme sistemi tarafından uygulanan kuvvet yoğunluğu ve yönü altında adım atarak filamenti yerinden oynatmaya başlar. Sıkışmış aktin filamentinin polaritesine bağlı olarak motorun kademelendirilmesiyle üretilen yer değiştirme, uygulanan kuvvetin yönüne göre yük ya yardımcı olabilir, yani motor deplasmanının aynı yönünde itilebilir (Şekil 1b üst panelde itme) veya dirençli, yani motor deplasmanına göre ters yönde çekme (Şekil 1b’de çekme) olabilir. üst panel), motor işlenebilirliğinin kemomekanik regülasyonunu, uygulanan yükün hem yoğunluğu hem de yönlülüğü ile incelemeyi mümkün kılar.

Sonraki bölümlerde, ultra hızlı bir kuvvet-kelepçe spektroskopisi kurulumu ile farklı yükler altında aktin-miyosin-5B etkileşimlerini ölçmek için tüm adımlar, 1) optik kurulumun kurulumu, optik tuzakların hizalanması ve kalibrasyon prosedürleri, 2) tüm bileşenlerin hazırlıkları ve numune odasındaki montajları, 3) ölçüm prosedürü, 4) çalışma uzunluğu, adım boyutu ve motor proteinin hızı gibi önemli fiziksel parametreleri çıkarmak için temsili veri ve veri analizi.

Protocol

1. Optik kurulum NOT: Deney düzeneği, nanometre işaretleme kararlılığına sahip çift optik cımbızdan ve %1 lazer yoğunluğu dalgalanmalarına < oluşur. Bu koşullar altında, dambılın nanometre seviyesindeki stabilitesi, tipik tuzak sertliği (0.1 pN / nm) ve gerginlik (1 pN – birkaç on pN) altında garanti edilir. Şekil 2 , optik kurulumun ayrıntılı bir şemasını göstermektedir. Optik cımbız tasarım ve yapımı 9,10,11.<sup class…

Representative Results

Temsili veriler, Şekil 4’te gösterildiği gibi zaman içindeki pozisyon kayıtlarından oluşur. Konum kaydında iki tür yer değiştirme görülebilir. İlk olarak, miyozin motoru aktin filamenti ile etkileşime girmediğinde, sıkışmış boncuklar, çözücünün viskoz sürükleme kuvvetine karşı sabit bir hızda hareket eder ve operatör tarafından üçgen bir dalga3’te ayarlanan salınım aralığında salınan doğrusal bir yer değiştirmeyi gösterir (…

Discussion

Üç boncuklu tahlil gibi tek moleküllü teknikler teknik olarak zorlu ve düşük verim olmasına rağmen, UFFCS, verilerin yüksek sinyal-gürültü oranı sayesinde moleküler etkileşimlerin tespitini geliştirir. UFFCS, motor proteinlerinin yüke bağımlılığının incelenmesine izin verir, motorun filamente bağlanması üzerine kuvvetin çok hızlı bir şekilde uygulanmasının temel avantajlarıyla, kuvvet üretimindeki erken ve çok hızlı olayları ve kontrollü kuvvet altındaki zayıf bağlanma durumlar…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin Laserlab-Europe 871124 Hibe Anlaşması kapsamındaki Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı (FIRB “Futuro in Ricerca” 2013 Hibe No. RBFR13V4M2) ve Ente Cassa di Risparmio di Firenze tarafından desteklenmiştir. A.V. Kashchuk, Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C tarafından desteklenmiştir.

Materials

 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

Referanslar

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
  2. Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
  3. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
  4. Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  5. Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
  6. Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
  7. Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
  8. Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin’s load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
  9. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
  10. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
  11. Capitanio, M. . Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
  13. Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
  14. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
  15. Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
  16. Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
  17. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  18. Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

View Video