Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.
Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi (UFFCS), lazer cımbızına dayanan tek moleküllü bir tekniktir ve yük altındaki hem geleneksel hem de konvansiyonel olmayan miyosinlerin kemomekaniğinin benzeri görülmemiş bir zaman çözünürlüğü ile araştırılmasını sağlar. Özellikle, aktin-miyozin bağ oluşumundan hemen sonra sabit kuvvet altında miyozin motorlarının araştırılması olasılığı, kuvvet geri bildiriminin yüksek oranı (200 kHz) ile birlikte, UFFCS’nin miyozin çalışma inmesi gibi hızlı dinamiklerin yük bağımlılığını incelemek için değerli bir araç olduğunu göstermiştir. Ayrıca, UFFCS, prosesif ve prosesif olmayan miyosin-aktin etkileşimlerinin uygulanan kuvvetin yoğunluğu ve yönünden nasıl etkilendiğinin incelenmesini sağlar.
Bu protokolü izleyerek, prosesif miyosin-5 motorlarında ve çeşitli geleneksel olmayan miyosinlerde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri yapmak mümkün olacaktır. Bazı ayarlamalarla, protokol kinesinler ve dineinler gibi diğer proses motor sınıflarının incelenmesine de kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlamaya, kalibrasyon prosedürlerine, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları içerir.
Son yıllarda optik cımbız, eşzamanlı manipülasyon ve konformasyonel değişikliklerin ve enzimatik kinetiğin ölçülmesinin çarpıcı olasılığı nedeniyle, tek molekül düzeyinde protein etkileşimlerinin mekanokimyasını aydınlatmak için değerli bir araç olmuştur 1,2. Özellikle, hücredeki moleküler motorlar tarafından uygulananlar aralığındaki kuvvetleri uygulama ve ölçme yeteneği, nanometre altı konformasyonel değişiklikleri ölçme kapasitesiyle birlikte, optik cımbızları, motor proteinlerinin kemomekanik özelliklerini ve mekanik düzenlemelerini çözmek için benzersiz bir tek moleküllü araç haline getirmiştir.
Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi (UFFCS), üç boncuklu bir geometride yük altındaki moleküler motorların hızlı kinetiğini incelemek için geliştirilmiş, optik cımbızlara dayanan tek moleküllü bir kuvvet-spektroskopi tekniğidir (Şekil 1a)3,4. UFFCS, motor proteine kuvvet uygulama gecikmesini optik cımbızların fiziksel sınırına, yani sistemin mekanik gevşeme süresine indirir, böylece bir miyozin çalışmasının başlamasından sonra kuvvetin hızla uygulanmasına izin verir (birkaç on mikrosaniye)3. Bu yetenek, hızlı iskelet 3 ve kardiyak5 kas miyozinindeki erken mekanik olayları araştırmak için güç çarpmasının yük bağımlılığını, zayıf ve güçlü bağlanma durumlarını ve ayrıca biyokimyasal (Pi) ve mekanik (powerstroke) olayların sırasını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır.
Üç boncuklu geometri genellikle işlemsel olmayan motorları incelemek için kullanılır, kuvvet kelepçeli tek bir boncuk geometrisi, miyozin Va6 gibi işlemsel geleneksel olmayan miyosinleri araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, işlemsel miyosinler için de üç boncuklu bir UFFCS testini tercih etmenin birkaç nedeni vardır. İlk olarak, aktin-miyozin bağlanmasından hemen sonra yükün hızlı bir şekilde uygulanması, işlemsel olmayan motorlarda olduğu gibi kuvvet gelişimindeki erken olayların ölçülmesine izin verir. Ek olarak, prosesir motorlar söz konusu olduğunda, motorun çalışma uzunluklarının ve çalışma sürelerinin, ilerlemeleri boyunca sabit kuvvet altında doğru bir şekilde ölçülmesini de sağlar (Şekil 1b). Ayrıca, kuvvet geri bildiriminin yüksek oranı nedeniyle, sistem miyozin çalışma stroku gibi pozisyondaki hızlı değişiklikler sırasında kuvveti sabit tutabilir, böylece motor basamağı sırasında sabit bir yükü garanti eder. Sistemin yüksek zamansal çözünürlüğü, sub-ms etkileşimlerinin tespit edilmesine izin verir ve miyozinin aktin’e zayıf bağlanmasını araştırma olasılığını açar. Son olarak, tahlil geometrisi, kuvvetin ihmal edilebilir enine ve dikey bileşenleri ile aktin filamenti boyunca uygulandığını garanti eder. Bu nokta, dikey kuvvet bileşeninin, motorun kinetik 7,8’inin yüke bağımlılığını önemli ölçüde etkilediği gösterildiğinden, özellikle önemlidir. Bu tekniği kullanarak, prosesif miyosin-5B’ye bir dizi yardımcı ve dirençli yük uygulayabilir ve çok çeşitli kuvvetler için prosesinin yük bağımlılığını doğrudan ölçebiliriz4.
Şekil 1a’da gösterildiği gibi, bu sistemde çift optik cımbızın (“dambıl”) odağında sıkışmış iki polistiren boncuk arasında tek bir aktin filament asılıdır. Dengesiz bir net kuvvet F = F1-F 2, filamente hızlı bir geri besleme sistemi aracılığıyla empoze edilir, bu da filamentin net kuvvetin ters yönde tersine çevrildiği kullanıcı tanımlı bir ters çevirme noktasına ulaşana kadar bir yönde sabit hızda hareket etmesini sağlar. Motor protein filament ile etkileşime girmediğinde, dambıl, üzerine tek bir motor proteininin tutturulduğu kaide boncuğuna yayılan üçgen dalga şeklinde (Şekil 1b, alt panel) ileri geri hareket etmekte serbesttir. Etkileşim kurulduktan sonra, dambıl tarafından taşınan kuvvet çok hızlı bir şekilde motor proteinine aktarılır ve motor, miyozin aktinden ayrılana kadar, etkileşim sırasında geri besleme sistemi tarafından uygulanan kuvvet yoğunluğu ve yönü altında adım atarak filamenti yerinden oynatmaya başlar. Sıkışmış aktin filamentinin polaritesine bağlı olarak motorun kademelendirilmesiyle üretilen yer değiştirme, uygulanan kuvvetin yönüne göre yük ya yardımcı olabilir, yani motor deplasmanının aynı yönünde itilebilir (Şekil 1b üst panelde itme) veya dirençli, yani motor deplasmanına göre ters yönde çekme (Şekil 1b’de çekme) olabilir. üst panel), motor işlenebilirliğinin kemomekanik regülasyonunu, uygulanan yükün hem yoğunluğu hem de yönlülüğü ile incelemeyi mümkün kılar.
Sonraki bölümlerde, ultra hızlı bir kuvvet-kelepçe spektroskopisi kurulumu ile farklı yükler altında aktin-miyosin-5B etkileşimlerini ölçmek için tüm adımlar, 1) optik kurulumun kurulumu, optik tuzakların hizalanması ve kalibrasyon prosedürleri, 2) tüm bileşenlerin hazırlıkları ve numune odasındaki montajları, 3) ölçüm prosedürü, 4) çalışma uzunluğu, adım boyutu ve motor proteinin hızı gibi önemli fiziksel parametreleri çıkarmak için temsili veri ve veri analizi.
Üç boncuklu tahlil gibi tek moleküllü teknikler teknik olarak zorlu ve düşük verim olmasına rağmen, UFFCS, verilerin yüksek sinyal-gürültü oranı sayesinde moleküler etkileşimlerin tespitini geliştirir. UFFCS, motor proteinlerinin yüke bağımlılığının incelenmesine izin verir, motorun filamente bağlanması üzerine kuvvetin çok hızlı bir şekilde uygulanmasının temel avantajlarıyla, kuvvet üretimindeki erken ve çok hızlı olayları ve kontrollü kuvvet altındaki zayıf bağlanma durumlar…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin Laserlab-Europe 871124 Hibe Anlaşması kapsamındaki Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı (FIRB “Futuro in Ricerca” 2013 Hibe No. RBFR13V4M2) ve Ente Cassa di Risparmio di Firenze tarafından desteklenmiştir. A.V. Kashchuk, Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C tarafından desteklenmiştir.
Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
Acetone | Sigma | 32201 | |
Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
ATP | Sigma | A7699 | |
Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
BSA | Sigma | B4287 | |
Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
Glucose | Sigma | G7528 | |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
MgCl2 | Fluka | 63020 | |
Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
MOPS | Sigma | M1254 | |
Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
Streptavidin protein | Sigma | 189730 |