Bu protokol, farelerin retinal düz montajlarının hazırlanması ve immünofloresan boyanması ve analizi için ayrıntılı bir yöntemi açıklamaktadır. Floresein fundus anjiyografinin (FFA) fare yavruları ve görüntü işleme için kullanımı da ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Oksijene bağlı retinopati (OIR), prematüre retinopatisi (ROP), proliferatif diyabetik retinopati (PDR) ve retinal ven tıkanıklığı (RVO) dahil olmak üzere iskemik retina hastalıklarında anormal damar büyümesini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Çoğu OIR çalışması retinal neovaskülarizasyonu belirli zaman noktalarında gözlemler; Bununla birlikte, OIR ile ilişkili damar hastalıklarını anlamak için gerekli olan bir zaman seyri boyunca canlı farelerde dinamik damar büyümesi yeterince çalışılmamıştır. Burada, OIR fare modelinin indüksiyonu için adım adım bir protokol açıklıyoruz, potansiyel tuzakları vurguluyoruz ve immünofloresan boyama kullanarak vazo-obliterasyon (VO) ve neovaskülarizasyon (NV) alanlarını hızlı bir şekilde ölçmek için geliştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Daha da önemlisi, OIR fare modelinde floresein fundus anjiyografi (FFA) yaparak P15’ten P25’e canlı farelerde damar büyümesini izledik. FFA’nın OIR fare modeline uygulanması, damar yeniden büyümesi sırasında yeniden şekillendirme sürecini gözlemlememizi sağlar.
Yeni patolojik damarların mevcut retinal damarlardan kaynaklandığı bir durum olarak tanımlanan retinal neovaskülarizasyon (RNV), genellikle retinanın iç yüzeyi boyunca uzanır ve vitreusa (veya bazı koşullar altında subretinal boşluğa) doğru büyür1. Prematüre retinopatisi (ROP), retinal ven tıkanıklığı (RVO) ve proliferatif diyabetik retinopati (PDR)2 dahil olmak üzere birçok iskemik retinopatinin ayırt edici özelliği ve ortak özelliğidir.
Çok sayıda klinik ve deneysel gözlem iskeminin retinal neovaskülarizasyonun ana nedeni olduğunu göstermiştir 3,4. ROP’ta, yenidoğanlar hayatta kalma oranlarını arttırmak için kapalı inkübatörlerde yüksek seviyeli oksijene maruz kalırlar ve bu da vasküler büyümenin durması için önemli bir itici güçtür. Tedavi yapıldıktan sonra, yenidoğanların retinaları nispeten hipoksik bir dönemyaşar 5. RVO’da santral veya dal retinal venlerin tıkanmasında başka durumlar da görülmekte ve PDR2’de mikroanjiyopatinin neden olduğu retinal kılcal damarların hasarı da gözlenmektedir. Hipoksi, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) gibi anjiyojenik faktörlerin, hipoksiye bağlı faktör-1α (HIF-1α) sinyal yolu aracılığıyla ekspresyonunu arttırır ve bu da vasküler endotel hücrelerini hipoksik alana büyümeye ve yeni damarlar oluşturmaya yönlendirir 6,7.
ROP, preterm bebeklerde bir tür vasküler proliferatif retinopatidir ve retina hipoksisi, retinal neovaskülarizasyon ve fibröz hiperplazi10,11,12 ile karakterize çocukluk çağı körlüğünün önde gelen bir nedeni 8,9’dur. 1950’lerde araştırmacılar, yüksek oksijen konsantrasyonunun prematüre bebeklerin solunum semptomlarını önemli ölçüde iyileştirebileceğini bulmuşlardır13,14. Sonuç olarak, oksijen tedavisi o zamanlar prematüre bebeklerde giderek daha fazla kullanılmaya başlandı15. Bununla birlikte, preterm bebeklerde oksijen tedavisinin yaygın kullanımı ile eş zamanlı olarak, ROP insidansı yıldan yıla artmıştır. O zamandan beri, araştırmacılar oksijeni ROP’a bağladılar ve ROP ve RNV16’nın patogenezini anlamak için çeşitli hayvan modellerini araştırdılar.
İnsanlarda, retinal vaskülatür gelişiminin çoğu doğumdan önce tamamlanırken, kemirgenlerde retinal vaskülatür doğumdan sonra gelişir ve retinal vaskülatürdeki anjiyogenezi incelemek için erişilebilir bir model sistemi sağlar2. Araştırmanın sürekli ilerlemesiyle birlikte, oksijene bağlı retinopati (OIR) modelleri, iskemiye bağlı patolojik anjiyogenezi taklit etmek için önemli modeller haline gelmiştir. OIR modelinin çalışmasında belirli bir hayvan türü yoktur ve model, yavru kedi17, sıçan18, fare19, beagle köpek yavrusu 20 ve zebra balığı21 dahil olmak üzere çeşitli hayvan türlerinde geliştirilmiştir. Tüm modeller, erken retinal gelişim sırasında hiperoksiye maruz kaldıkları ve daha sonra normoksik ortama geri döndükleri aynı mekanizmayı paylaşırlar. Smith ve ark., fare yavrularını 5 gün boyunca P7’den hiperoksiye maruz bırakmanın, merkezi retinada aşırı bir damar regresyonu formuna neden olduğunu ve onları P12’deki oda havasına geri getirmenin, yavaş yavaş vitreus gövdesine doğru büyüyen neovasküler tutamları tetiklediğini gözlemlemiştir19. Bu, Smith modeli olarak da adlandırılan standartlaştırılmış bir OIR fare modeliydi. Connor ve ark. protokolü daha da optimize etti ve 2009 yılında VO (vazo-obliterasyon) ve NV (neovaskülarizasyon) alanını ölçmek için evrensel olarak uygulanabilir bir yöntem sağladı ve bu da model22’nin kabulünü ve kullanımını artırdı. OIR fare modeli, küçük boyutu, hızlı üremesi, net genetik arka planı, iyi tekrarlanabilirliği ve yüksek başarı oranı nedeniyle şu anda hala en yaygın kullanılan modeldir.
Farelerde, retinal vaskülarizasyon doğumdan sonra damarların optik sinir kafasından iç retinaya ora serrata’ya doğru büyümesiyle başlar. Normal retinal gelişim sırasında, ilk retinal damarlar doğum sırasında optik sinir başından filizlenir ve doğum sonrası 7 (P7) 23 civarında çevreye ulaşan genişleyen bir ağ (primer pleksus) oluşturur. Daha sonra damarlar derin bir tabaka oluşturmak, retinaya nüfuz etmek ve insan24’te olduğu gibi iç nükleer tabakanın (INL) etrafında laminer bir ağ oluşturmak için retinaya doğru büyümeye başlar. Üçüncü doğum sonrası haftanın (P21) sonunda, daha derin pleksus gelişimi neredeyse tamamlanır. OIR fare modeli için, hiperoksiye maruz kalma sırasında merkezi bölgedeki çok sayıda olgunlaşmamış vasküler ağın hızlı dejenerasyonu nedeniyle vasküler tıkanıklık her zaman merkezi retinada görülür. Bu nedenle, patolojik neovaskülarizasyonun büyümesi, perfüzyon dışı alanın ve vasküler alanın sınırı olan orta periferik retinada da meydana gelir. Bununla birlikte, insan retina damarları neredeyse doğumdan önce oluşmuştur. Prematüre bebeklere gelince, periferik retina hiperoksiye maruz kaldığında tamamen vaskülarize değildir25,26. Bu nedenle vasküler oklüzyon ve neovaskülarizasyon esas olarak periferik retinada görülür27,28. Bu farklılıklara rağmen, fare OIR modeli, iskemiye bağlı neovaskülarizasyon sırasında ortaya çıkan patolojik olayları yakından özetlemektedir.
OIR modelinin indüksiyonu iki faza ayrılabilir29: faz 1’de (hiperoksi faz), retinal vasküler gelişim, VEGF’deki düşüş ve endotel hücrelerinin apoptozu 24,30’un bir sonucu olarak kan damarlarının tıkanması ve gerilemesi ile durdurulur veya geciktirilir; faz 2’de (hipoksi faz), retinal oksijen kaynağı, nöral gelişim ve homeostaz19,31 için gerekli olan oda hava koşulları29 altında yetersiz kalacaktır. Bu iskemik durum genellikle düzenlenmemiş, anormal neovaskülarizasyon ile sonuçlanır.
Şu anda, yaygın olarak kullanılan modelleme yöntemi alternatif olarak yüksek / düşük oksijene maruz kalmaktadır: Anneler ve yavruları P7’de 5 gün boyunca% 75 oksijene maruz kalmaktadır, ardından P17, OIR fare modeli indüksiyonunun son noktası olankarşılaştırılabilir sonuçlar 22’yi gösterene kadar oda havasında 5 gün beklemektedir. (Şekil 1). ROP’u simüle etmenin yanı sıra, bu iskemi aracılı patolojik neovaskülarizasyon, diğer iskemik retina hastalıklarını incelemek için de kullanılabilir. Bu modelin ana ölçümleri, immünofloresan boyama veya FITC-dekstran perfüzyonu ile retinal düz montajlardan analiz edilen VO ve NV alanının ölçülmesini içerir. Her fare, ölümcül operasyon nedeniyle sadece bir kez incelenebilir. Günümüzde, vasküler regresyon ve patolojik anjiyogenez sürecinde retinal vaskülatürün dinamik değişikliklerini sürekli olarak gözlemlemek için birkaç yöntem vardır32. Bu yazıda, OIR model indüksiyonunun ayrıntılı bir protokolünü, retinal düz montajların analizini ve fareler üzerinde floresein fundus anjiyografi (FFA) iş akışını sunuyoruz ve bu da OIR fare modelinin iki aşamasında vasküler dinamik değişikliklerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Farelerin OIR’ye duyarlılığı birçok faktörden etkilenir. Farklı genetik geçmişe ve suşlara sahip yavrular karşılaştırılamaz. BALB / c albino farelerde, damarlar VO bölgesine hızla yeniden büyür ve önemli ölçüde azalmış neovasküler tutamlar38 ile araştırmaya bazı zorluklar getirir. C57BL/6 farelerde, BALB/cJ fare suşu39,40 ile karşılaştırıldığında fotoreseptör hasarı artmıştır. Aynı şey farklı t…
The authors have nothing to disclose.
Laboratuvarımızdan ve Zhongshan Oftalmik Merkezi Oftalmik Hayvan Laboratuvarından tüm üyelere teknik yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca deneysel destek için Prof. Chunqiao Liu’ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (NSFC: 81670872; Pekin, Çin), Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (Hibe No.2019A1515011347) ve Zhongshan Oftalmik Merkezi’ndeki Devlet Anahtar Oftalmoloji Laboratuvarı’ndan Yüksek Düzey hastane inşaatı projesi (Hibe No. 303020103; Guangzhou, Guangdong Eyaleti, Çin).
1 mL sterile syringe | Solarbio | YA0550 | For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection |
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | For preparation of retinal flat mounts |
2 ml Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-200-C | For preparation of retinal flat mounts |
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3548 | For preparation of retinal flat mounts |
Adhesive microscope slides | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | For image analysis | |
Carbon dioxide gas | Various | For sacrifice | |
Cover slide | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | For preparation of retinal flat mounts |
DAPI staining solution | Abcam | ab228549 | For labeling nucleus on retinal flat mounts |
Dissecting microscope | Olmpus | SZ61 | For preparation of retinal flat mounts |
Fluorescein sodium | Sigma-Aldrich | F6377 | For in vivo imaging |
Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | For preparation of retinal flat mounts |
Hydroxypropyl Methylcellulose | Maya | 89161 | For in vivo imaging |
Isolectin B4 594 antibody | Invitrogen | I21413 | For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts |
Mice C57/BL6J | GemPharmatech of Jiangsu Province | For OIR model induction | |
Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | For preparation of retinal flat mounts |
No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | For preparation of retinal flat mounts |
Normal donkey serum | Abcam | ab7475 | For preparation of retinal flat mounts |
O2 sensor | Various | For monitoring the level of O2 | |
OxyCycler | Biospherix | A84XOV | For OIR model induction |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | For tissue fixation |
Pentobarbital sodium | Various | For anesthesia | |
Soda lime | Various | For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber | |
SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | For in vivo imaging |
SPSS Statistics 22.0 | IBM | For statistical analysis | |
Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | For preparation of retinal flat mounts |
Tissue culture dish (Low attachment) | Corning | 3261-20EA | For preparation of retinal flat mounts |
Transfer pipettes | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | For preparation of retinal flat mounts |
Tropicamide | Various | For in vivo imaging | |
ZEN Imaging Software | ZEISS | For image acquisition and export |