Bakteriyel veziküller patogenezde önemli roller oynar ve umut verici biyoteknolojik uygulamalara sahiptir. Veziküllerin heterojenliği analiz ve kullanımı zorlaştırır; bu nedenle, değişen boyutlarda vesikleleri ayırmak için basit, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Burada, Aggregatibacter actinomycetemcomitanstarafından üretilen heterojen vezikülleri ayırmak için boyut dışlama kromatografisinin kullanımını gösteriyoruz.
Gram-negatif bakterilerin hücre duvarı, ince bir peptidoglikan tabakası ile ayrılmış bir iç (sitoplazmik) ve dış zardan (OM) oluşur. Büyüme boyunca, dış zar küresel dış membran vezikülleri (OMV’ ler) oluşturmak için bleb yapabilir. Bu OMV’ler, konak hücrelere kargo teslimatı ve bakteri hücreleriyle iletişim dahil olmak üzere çok sayıda hücresel işlevde yer almaktadır. Son zamanlarda, aşı ve ilaç dağıtım aracı olarak kullanımları da dahil olmak üzere OMV’lerin terapötik potansiyeli araştırılmaya başlandı. OMV’ler OM’den türetilmiş olsa da, OMV’nin lipit ve protein yükünün genellikle OM’den önemli ölçüde farklı olduğu uzun zamandır takdir edilmektedir. Daha yakın zamanda, bakterilerin birden fazla OMV türünü serbest bırakabileceğine dair kanıtlar keşfedilmiştir ve boyutun konak hücreler tarafından alım mekanizmasını etkileyebileceğine dair kanıtlar mevcuttur. Bununla birlikte, bu alandaki çalışmalar heterojen boyutlu OMV’lerin verimli bir şekilde ayrılmasındaki zorluklarla sınırlıdır. Yoğunluk gradyan santrifüjleme (DGC) geleneksel olarak bu amaç için kullanılmıştır; ancak, bu teknik zaman alıcıdır ve ölçeklendirmek zordur. Öte yandan, boyut dışlama kromatografisi (SEC), daha az hantaldır ve OMV’lerin terapötik kullanımı için gelecekteki gerekli ölçek büyütmeye kendini ödünç verir. Burada, heterojen boyutlu veziküllerin tekrarlanabilir bir şekilde ayrılmasını sağlayan bir SEC yaklaşımını açıklıyoruz, bir test çalışması olarak kullanarak, Aggregatibacter aktinosetemcomitanstarafından üretilen OMV’ler Çapı 150 nm’den 350 nm’den daha büyük. Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile doğrulanan “büyük” (350 nm) OMV’ler ve “küçük” (<150 nm) OMV'lerin ayrıştırılmasını gösteriyoruz. Kullanım kolaylığı, tekrarlanabilirliği (kullanıcıdan kullanıcıya dahil) ve ölçek büyütme olasılığı nedeniyle heterojen boyutlu veziküllerin ayrılması için DGC tabanlı teknikler üzerinde SEC tabanlı teknikler öneriyoruz.
Gram negatif bakteriler, dış zarlarından elde edilen veziklikleri, dış zar vezikliklerini (OMV’ ler) büyüme boyunca serbest bırakır. Bu OMV’ler, DNA / RNA, proteinler, lipitler ve peptidoglikanlar1,2dahil olmak üzere bir dizi önemli biyomolekül taşıyarak hem bakteriler ve konak hem de bakteri hücreleri arasında hücreden hücreye iletişimde önemli roller oynar. Özellikle, OMV’lerin bakteriyel patogenezdeki rolü, bazı virülans faktörleri ve toksinler3, 4 , 5 , 6 , 7,8,9,10,11’dekizenginleşmeleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.
OMV’lerin, ana bakterilere ve büyüme aşamasına bağlı olarak 20 ila 450 nm arasında değiştiği bildirilmiştir, çeşitli bakteri türleri heterojen boyutlu OMV’leri serbest bırakır8, 12,13,14, ayrıca protein bileşimlerinde ve konak hücre giriş mekanizmalarında farklılık gösterir12. H. pylori, çapı 20 ila 450 nm arasında değişen OMV’leri serbest bıraktı ve daha küçük OMV’ler daha büyük OMV’lerden daha homojen bir protein bileşimi içeriyordu. Daha da önemlisi, OMV’lerin iki popülasyonunun konak hücreler tarafından farklı mekanizmalar aracılığıyla içselleştirildiği gözlenmiştir12. Buna ek olarak, Aggregatibacter actinomycetemcomitans’ın büyük (>350 nm) OMV’lerden oluşan bir popülasyonla birlikte küçük (<150 nm) OMV'lerden oluşan bir popülasyon saldığını ve OMV'lerin önemli miktarda salgılanan protein toksini içerdiğini gösterdik, lökotoxin (LtxA)15. OMV heterojenitesinin hücresel süreçlerdeki rolü açıkça önemli olmakla birlikte, farklı vezikül popülasyonlarının ayrılması ve analizinde teknik zorluklar bu çalışmaları sınırlamıştır.
Bakteriyel patogenezdeki önemine ek olarak, OMV’ler aşı ve ilaç dağıtım araçları 16 , 17,18,19,20dahil olmak üzere bir dizi biyoteknolojik uygulamada kullanılmak üzere önerilmiştir. Bu tür yaklaşımlarda çevirisel kullanımları için vesicles’in temiz ve monodisperse bir şekilde hazırlanması gerekir. Bu nedenle, etkili ve verimli ayırma yöntemleri gereklidir.
En yaygın olarak, yoğunluk gradyan santrifüjleme (DGC), heterojen boyutlu vezikül popülasyonlarını flagellae ve salgılanan proteinler de dahil olmak üzere hücresel döküntülerden ayırmak için kullanılır21; yöntem ayrıca heterojen boyutlu OMV alt nüfuslarını ayırmak için bir yaklaşım olarak bildirilmiştir12,13,14. Ancak, DGC zaman alıcı, verimsiz ve kullanıcıdan kullanıcıya son derece değişken22’dir ve bu nedenle ölçek büyütme için ideal değildir. Buna karşılık, boyut dışlama kromatografisi (SEC), OMV’leri 21 ,23,24arındırmak için ölçeklenebilir, verimli ve tutarlı bir yaklaşımı temsil eder. Jel filtrasyon ortamı ile dolu uzun (50 cm), yerçekimi akışı, SEC sütununun OMV’lerin alt nüfuslarını verimli bir şekilde arındırmak ve ayırmak için yeterli olduğunu bulduk. Özellikle, bu yaklaşımı A. actinomycetemcomitans OMV’leri “büyük” ve “küçük” alt nüfuslara ayırmak ve protein ve DNA kontaminasyonlarını gidermek için kullandık. Saflaştırma 4 saatten daha kısa bir sürede tamamlandı ve OMV alt nüfuslarının tamamen ayrılması ve enkazın kaldırılması gerçekleştirildi.
Burada, bakteriyel OMV alt nüfuslarının basit, hızlı ve tekrarlanabilir ayrımı için bir protokol sağladık. Teknik nispeten düz olsa da, sütunda verimli ayırmanın gerçekleşmesini sağlamak için son derece dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken bazı adımlar vardır. İlk olarak, hava kabarcıklarını önlemek için jelin sütuna dikkatlice ve yavaşça yüklenmesi esastır. Kolonu yüklemeden önce jeli oda sıcaklığında birkaç saat bırakmanın jelin dengelenmesine izin verdiğini ve ko…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (1554417) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (DE027769) tarafından finanse edildi.
1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |