Şu anda uygulandığı gibi, insan olmayan primatlarda optogenetik, viral vektörlerin beyne enjekte edilmesini gerektirir. Optimal bir enjeksiyon yöntemi güvenilir olmalı ve birçok uygulama için, postmortem histolojide kolayca ve açık bir şekilde tanımlanan keyfi derinlikteki bireysel bölgeleri hedefleyebilmelidir. Bu özelliklere sahip bir enjeksiyon yöntemi sunulmaktadır.
Optogenetik teknikler sinirbilim araştırmalarında devrim yarattı ve nörolojik gen terapisi için de aynısını yapmaya hazır. Bununla birlikte, optogenetiğin klinik kullanımı, insanlara nörolojik benzerlikleri nedeniyle, ideal olarak insan olmayan primatlarda (NHP’ler) hayvan modellerinde güvenlik ve etkinliğin gösterilmesini gerektirir. Nörobilim ve tıp için potansiyel olarak yararlı olan aday vektörlerin sayısı çok fazladır ve bu vektörleri test etmek için henüz yüksek verimli bir araç mevcut değildir. Bu nedenle, viral vektörlerin NHP beynine çoklu mekansal ve hacimsel olarak doğru enjeksiyonlarını yapmak için tekniklere ihtiyaç vardır, bu da postmortem histoloji ile açık bir şekilde tanımlanabilir. Burada açıklanan böyle bir yöntemdir. Enjeksiyon kanülleri, birleştirilmiş politetrafloroetilen ve paslanmaz çelik borulardan yapılmıştır. Bu kanüller otoklavlanabilir, tek kullanımlıktır ve düşük minimum yükleme hacimlerine sahiptir, bu da onları pahalı, yüksek konsantrasyonlu viral vektör çözeltilerinin enjeksiyonu için ideal kılar. Hareketsiz, kırmızı boyalı bir mineral yağ, ölü alanı doldurur ve vektör çözeltisi ile görünür bir menisküs oluşturarak enjeksiyon hızlarının ve hacimlerinin anlık ve doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar. Yağ, kanülün arkasına yüklenir ve vektörle birlikte enjeksiyon riskini azaltır. Kanüller 10 dakikada yüklenebilir ve enjeksiyonlar 20 dakikada yapılabilir. Bu prosedür uyanık veya anestezi uygulanmış hayvanlara enjeksiyonlar için çok uygundur. Yüksek kaliteli viral vektörler sunmak için kullanıldığında, bu prosedür optogenetik proteinlerin sağlam ekspresyonunu üretebilir ve NHP’lerde nöral aktivite ve davranışın optik kontrolüne izin verebilir.
İnsan olmayan primatlarda (NHP’ler) optogenetik tipik olarak viral vektörün doğrudan beyne enjekte edilmesini içerir. Bu uygulama için çok uygun olan bir vektör sınıfı, adeno ile ilişkili virüse (AAV) dayanmaktadır. Bu vektörler, tek sarmallı bir DNA genomunu çevreleyen bir protein kapsidinden oluşur ve bu da bir promotör, bir opsin geni ve isteğe bağlı olarak diğer protein kodlayıcı ve gen düzenleyici elementlerden oluşur. Moleküler klonlamadaki ilerlemeler, yeni vektörlerin geliştirilmesi için bu bileşenlerin manipülasyonunu ve kombinasyonunu kolaylaştırmıştır. Sonuç olarak, NHP optogenetiği için potansiyel olarak yararlı olan AAV vektörlerinin toplanması büyüktür ve hızla büyümektedir.
Şu anda, NHP optogenetiği için bir AAV vektörünün yararı, in vivo test etmeyi gerektirmektedir. Bu gerçek, ilerlemenin önünde önemli bir engeldir. Hayvanlar idareli kullanılmalıdır ve tek bir hayvanda birden fazla vektörün test edilmesi, enjeksiyon bölgelerinin nöral mimariye göre makul bir şekilde konumlandırılmasını ve viral yayılmaya göre iyi ayrılmasını gerektirir. Doğru histolojik değerlendirme, enjeksiyonların mekansal ve hacimsel olarak doğru olmasını gerektirir. Daha önce farmakolojik ajanların fokal olarak verilmesi için kullanılan bir enjeksiyon tekniği 1,2,3,4, bu tür enjeksiyonları yapmak için uyarlanmış ve basitleştirilmiştir. Bu enjeksiyon tekniği ucuzdur, tek kullanımlık, sterilize edilebilir bileşenler kullanır, anestezi uygulanmış veya uyanık davranan maymunlarda kullanılabilir ve herhangi bir derinlikteki çeşitli beyin bölgelerini hedeflemek için kullanılabilir. Aşağıdaki protokol, tek kullanımlık bileşenlerin üretilmesi ve NHP beyninde enjeksiyon yapılması için adım adım prosedürleri açıklamaktadır. Tekniğin avantajları ve dezavantajları tartışılmaktadır.
NHP optogenetiğindeki ilerlemeler, doğru, güvenilir intrakraniyal enjeksiyon yöntemlerine ihtiyaç duymuştur. Bu raporda açıklanan yöntemin avantajları, ucuz olması, sterilize edilebilir ve tek kullanımlık bileşenler kullanması ve herhangi bir derinlikteki çeşitli beyin alanlarını hedefleme yeteneğine sahip olmasıdır. Ayrıca, hava valfinin kontrol edilebildiği hız sayesinde enjeksiyon hızının ve hacminin kontrol edilmesini sağlar. Hava basıncı, bir tıkanıklığı gidermek için geçici olarak arttırılabilir ve daha sonra sürekli basınç tarafından üretilecek daha sonra aşırı enjeksiyondan kaçınmak için hızlı bir şekilde azaltılabilir. Tek kullanımlık bileşenler, enjeksiyon bölgeleri arasında çapraz kontaminasyon riskini azaltır.
Bu enjeksiyon protokolündeki kritik adımlar, yüksek kaliteli kanüller inşa etmeyi, kabarcıkları sokmadan yüklemeyi ve birbirine çok yakın olmayan enjeksiyon bölgelerini seçmeyi içerir. 1 cm ≥ enjeksiyonlar genellikle örtüşmeyen bölgeleri dönüştürür, ancak bu sezgisel yöntem viral serotip, titre, promotör, hacim, hedef ve tespit yöntemine bağlıdır. Doğrudan bağlı olmayan enjeksiyon bölgelerinin seçilmesi, aksonlar boyunca opsin kaçakçılığının ve bazı AAV serotiplerinin retrograd transdüksiyon eğiliminin yarattığı potansiyel karışıklıkları önler.
Yöntem, anestezi altındayken ve stereotaksik bir çerçevede (Şekil 3) veya uyarı ve kafa sabitken (Şekil 4) NHP’leri enjekte etmek için kullanılabilir. Birincisi, enjeksiyonların stereotaksik koordinatlarda hedeflenmesine izin verme avantajına sahiptir ve akut bir durotomi yoluyla kanül penetrasyonunun görsel olarak doğrulanmasına izin verir (uyanık bir maymunda dura’yı kesmek, kronik bir kraniyotomi yoluyla, enfeksiyon riskini artırır). İkinci yaklaşım, hayatta kalma ameliyatlarının sayısını ve dolayısıyla hayvana olan stresi azaltma, davranış sırasında elektrofizyolojik kayıtlarla uyumlu olma ve enjeksiyon sonrası deneyler için optik fiberler eklemek için kullanılan aynı koordinat çerçevesini ve enstrümantasyonunu kullanma avantajlarına sahiptir. Uyanık maymunlarda enjeksiyon tekniği, yapay dura13,14,15 yoluyla enjeksiyon yapılarak daha da geliştirilebilir. Bu, enjeksiyon bölgelerinin ve başarılı transdüksiyonu gösteren doku floresansının doğrudan görselleştirilmesinin ek avantajlarını sağlayacaktır.
Son zamanlarda, AAV vektörlerini büyük NHP kortikal bölgelerine eşit olarak iletmek için çok kanallı bir enjeksiyon cihazı geliştirilmiştir16. Benzer sonuçlar konveksiyonla güçlendirilmiş teslimat17,18 kullanılarak elde edilebilir. Bu yöntemler, önemli bir hedef olan ancak yöntemimizin ulaşmayı amaçladığı mekansal hassasiyetten farklı olan iletim yayılımını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır.
Başka bir alternatif yöntem, AAV vektörlerini, bir ucunda keskin bir uca eğimli ve diğer 5,6’da bir Hamilton şırıngasına tutturulmuş borosilikat borudan enjekte etmektir. Bu yöntemin, bu makalede açıklanan yöntemle birçok ortak noktası vardır. Viral vektör bir boru uzunluğunda tutulur, virüsün arkasındaki borudaki boşluk boyalı yağ ile doldurulur ve vektörün akışı yağ vektörü menisküsün hareketi ile izlenir. Bu alternatif teknik daha az ekipman ve hazırlık gerektirir, ancak eğimli uçtan borosilikat boruya negatif basınçla yağ çekilmesini ve vektörün daha sonra aynı yoldan yüklenmesini gerektirir. Bu kaçınılmaz olarak beyne verilen yağ izleriyle sonuçlanır. Ek olarak, deneyimlerimize göre, borosilikat boru, eğimli olduğunda bile duraya nüfuz etmek için ~ 350 μm çapa sahip olmalıdır ve bu nedenle bu makalede açıklanan daha ince metal kanülden daha büyük mekanik hasara neden olur (Şekil 2D). 30 G boru kullanılmıştır, çünkü kritik burkulma yükü 1-10 cm uzunluğa rağmen dura penetrasyonuna aracılık edecek kadar yüksektir, çünkü PTFE borusuna sıkıca oturur ve nadiren tıkanır. 33 G boru tıkanır ve daha kolay bükülür ve PTFE boru ile eşleşmesi daha zordur. 36 G boru, NHP dura mater’e nüfuz etmek için yeterince sert değildir.
Başka bir alternatif enjeksiyon tekniği, hava pompasının çıkışını vektör yüklü, çekilmiş cam pipet19’un arkasına bağlamaktır. Vektör, pompadan gelen doğrudan, aralıklı hava basıncı ile pipet ucundan zorlanır ve yağ ihtiyacını ortadan kaldırır. Yukarıda açıklanan tek tüp yöntemine benzer şekilde, menisküs ve kanül ucu arasında herhangi bir maddi bağlantı bulunmaması, sızıntı riskini azaltır. Bununla birlikte, cam pipetlerin keskin konik ve hassas uçları, NHP dura’ya nüfuz etmelerini veya derin yapıları hedeflemelerini önler.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma WaNPRC / ITHS P51OD010425 (JTT), Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) EY023277 (YK için R01), EY030441 (GH için R01), MH114126 (RF1’den JTT’ye, Boaz Levi, Ed Lein’e), MH120095 (JTT ve GH için UG3), EY028902 (RS için R01) tarafından desteklenmiş ve NIH hibeleri OD010425 (WaNPRC için P51) ve Washington Üniversitesi Telif Hakkı Araştırma Fonu A148416 tarafından mümkün kılınmıştır. Yazarlar, histoloji için Yasmine El-Shamayleh ve Victoria Omstead’e, viral vektör klonlaması için Refugio Martinez’e ve NHP beyin dokusu işleme konusunda yardım için John Mich’e teşekkür etmek istiyor.
Equipment: Stereotaxic set | |||
Item | |||
Allen keys | BONDHUS | 10936 | STERRAD |
Cannula holder | KOPF | 1770 | STERRAD |
Carrier (manipulator) | KOPF | 1404 | STERRAD |
Carrier platform | KOPF | 1430 | NA |
Carrier stand | KOPF | 1449 | STERRAD |
Eye, ear, mouth bars | KOPF | 1430 | NA |
Stereotaxic base | KOPF | 1210 | NA |
Equipment: Cannula | |||
Item | |||
1 mL Luer-lock syringes | BD | 309628 | NA (sterilized package) |
Cannulas* | (homemade – see below) | NA | steam (autoclave) |
Colored oil** | (homemade – see below) | NA | NA |
Elevator (for tube rack) | Cole-Parmer | UX-08057-10 | STERRAD |
Filter tip | Genesee Scientific | 23-404 | NA (sterilized package) |
Fluorescent microbeads | Lumafluor | R170 | NA |
P20 pipetman | Gilson | FA10003M | NA |
PCR tubes | Olympus Plastics | 22-161 | STERRAD |
Stopcock | Cole-Parmer | 3060004 | STERRAD |
Tube rack | homemade | NA | STERRAD |
Vector solution | (homemade) | NA | NA |
Equipment: Electric air pump set | |||
Item | |||
Electric air pump | World Precision Instruments | PV830 | NA |
Foot pedal | World Precision Instruments | 3260 | NA |
Tube cover | EZ Drape | A400-1000 | NA (sterilized package) |
Equipment: General surgery tools | |||
Item | |||
Beaker | MEDLINE | azlon | STERRAD |
Burrs | STRYKER | 277-10-235 | STERRAD |
Double pronged tissue pick | Fine Science Tools | 18067-11 | STERRAD |
Drapes | MEDLINE | DYNJP3004 | NA (sterilized package) |
Dressing forceps | Miltex | 6-118 | STERRAD |
Drill | STRYKER | Q9R-5400 | NA |
Drill bits | STRYKER | 277-82-87 | STERRAD |
Gauze | MEDLINE | NON26334 | NA (sterilized package) |
Hemostatic mosquito forceps | Miltex | 7-2, 7-4 | STERRAD |
Light handles | SKYTRON | Stellar XL | STERRAD |
Needle hodler | Miltex | 8-2 | STERRAD |
Periosteal elevator | Miltex | 18-1968 | STERRAD |
Rongeurs | Miltex | 17-4800 | STERRAD |
Saline | BAXTER | 2F7122 | STERRAD |
Scalpel | Bard-Parker | 372610 | STERRAD |
Scissors | Miltex | 5-12, 5-114 | STERRAD |
Senn retractors | Miltex | 28065 | STERRAD |
Sterile gloves | MEDLINE | Triumph Micro | NA (sterilized package) |
Suction | medela | 200-4869 | NA |
Suction tip | MEDLINE | DYNDFR12S | NA (sterilized package) |
Suction tube | COVIDEN | 8888301614 | NA (sterilized package) |
Surgical gowns | MEDLINE | DYNJP2002S | NA (sterilized package) |
Surgical pens & ruler | MEDLINE | DYNJSM03 | NA (sterilized package) |
Suture | COVIDEN | SL-635 | NA (sterilized package) |
Tissue forceps | Miltex | 6-114 | STERRAD |
Towel clamps | Miltex | 7-504 | STERRAD |
Wood swabs | MEDLINE | MDS202095 | NA (sterilized package) |
Equipment: *cannulas | |||
Item | |||
Hypodermic needle | EXELINT INTERNATIONAL | 26437 | NA (sterilized package) |
Stainless steel tube | K-TUBE | K30R | NA |
PTFE tube | ZEUS | 216200 | NA |
Equipment: **colored oil | |||
Item | |||
Liquid Candle Dye Concentrate | PremiumCraft | Red/Pink | NA |
Mineral oil | Vi-Jon | S0883 | NA |
STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma |