Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.
DNA hasar yanıtının (DDR) incelenmesi, kanser tedavisi için DDR hedefli ilaçların kullanımı nedeniyle daha önemli hale gelen karmaşık ve temel bir alandır. Bu hedefler, çeşitli DNA onarım biçimlerini başlatan poli (ADP-riboz) polimerazlarıdır (PARP’lar). Parp inhibitörleri (PARPi) kullanarak bu enzimlerin inhibe edilmesi, meme kanseri tip 1 (BRCA1), BRCA2 veya BRCA2 (PALB2) ortağı ve lokalizatöründeki mutasyonlar nedeniyle homolog rekombinasyon (HR) eksikliği olan hücrelerde terapötik bir güvenlik açığı sağlayarak sentetik öldürücülüğe ulaşır.
PARPi ile tedavi edilen hücreler DNA çift iplikçik kopuları (DSB’ ler) biriktirir. Bu kırılmalar DNA uç rezeksiyon makineleri tarafından işlenerek tek iplikli (ss) DNA oluşumuna ve daha sonra DNA onarımına yol açmaktadır. BRCA1 eksikliği olan bir bağlamda, 53BP1 ve DYNLL1 gibi DNA rezeksiyon inhibitörlerindeki mutasyonlar yoluyla DNA rezeksiyonunu canlandırmak PARPi direncine neden olur. Bu nedenle, selülodaki DNA rezeksiyonunun izlenebilmesi, DNA onarım yollarının daha net anlaşılması ve PARPi direncinin üstesinden gelmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. İmmünoresans (IF) tabanlı teknikler, DNA hasarından sonra küresel DNA rezeksiyonunun izlenmesini sağlar. Bu strateji 5-bromo-2′-deoksiyuridin (BrdU) ile uzun nabız genomik DNA etiketleme gerektirir. DNA hasarı ve DNA sonu rezeksiyonu sonrasında, ortaya çıkan tek iplikli DNA, özellikle yerel koşullar altında bir anti-BrdU antikoru tarafından tespit edilir. Ayrıca, DNA rezeksiyonu, hücre döngüsünün çeşitli aşamalarını ayırt etmek için hücre döngüsü belirteçleri kullanılarak da incelenebilir. S/G2 fazındaki hücreler İk içinde uç rezeksiyonunun incelenmesine izin verirken, G1 hücreleri homolog olmayan uç birleştirmeyi (NHEJ) incelemek için kullanılabilir. Bu IF yöntemi için hücre döngüsü ayrımcılığı ile birleştirilmiş ayrıntılı bir protokol bu makalede açıklanmıştır.
DNA onarım faktörlerinin modülasyonu, özellikle DNA DSB onarım eksikliği olan tümör ortamlarında kanser tedavisi için sürekli gelişen bir yöntemdir. Spesifik onarım faktörlerinin inhibisyonu, kanser hücrelerini DNA’ya zarar veren ajanlara duyarlı hale getirmek için kullanılan ustaca stratejilerden biridir. Onlarca yıllık araştırma, DNA onarım genlerinin çeşitli mutasyonlarının terapötik strateji seçimleri için biyobelirteç olarak tanımlanmasına yol açtı1. Sonuç olarak, DNA onarım alanı, kişiselleştirilmiş tıp kavramını güçlendirerek çok çeşitli tedaviler sağlamak için ilaç geliştirme merkezi haline gelmiştir.
DSB’ler iki ana yol tarafından onarılır: NHEJ ve HR2. NHEJ yolu hataya eğilimlidir, iki DNA ucunu çok az veya hiç DNA son işleme ile hızlı bir şekilde bağlar ve protein kinaz (DNA-PKcs), Ku70/80 kompleksi, 53BP1 ve RIF1 proteinlerini içerir3. Buna karşılık, İk BRCA14 tarafından başlatılan sadık bir mekanizmadır. İk onarımında önemli bir adım, 3′-OH uçlu tek iplikli (ss) DNA’ya yol açan kırık uçların bozulması olan DNA sonu rezeksiyon işlemidir. BRCA1, 5′ ila 3′ DNA rezeksiyonunda yer alan rezektosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1’i oluşturan aşağı akış proteinlerinin işe alımını kolaylaştırır5.
İlk son rezeksiyon, MRE11’in endonücleaz aktivitesi ile gerçekleştirilir ve DNA2 ve EXO1 çekirdekleri tarafından daha fazla işlenmesine izin verir. Oluşturulan ssDNA çıkıntıları, daha fazla işlemden korumak için Çoğaltma ProteinI A (RPA) tarafından hızlı bir şekilde kaplanır. Daha sonra BRCA2, PALB2 ve BRCA1, RPA’nın yer değiştirmesine ve homolojiye yönelik onarım mekanizması için gerekli rad51 nükleofilamentinin montajına aracılık etmek için devreye girer. Genomik bütünlüğün en iyi şekilde sürdürülmesi için NHEJ ve İk kullanımı arasında ince bir denge gereklidir. Yol seçimi hücre döngüsü aşamasına bağlıdır. İk tercihen DNA rezeksiyonun en üst seviyede olduğu S-G2 aşamalarında kullanılır ve uygun onarımı sağlamak için kardeş kromatlar mevcuttur.
Poli (ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP-1), DSB’ye alınan en erken proteinlerden biridir. Hem rezeksiyon aktivitesini hem de NHEJ5,6’da yer alan aşağı akış efektörlerinin montajını düzenler. PARP-1, çoğaltma sırasında DNA tek iplikli kesme onarımı için de gereklidir7,8. DNA onarımındaki önemli rolü nedeniyle KANSER TEDAVILerİ OLARAK PARP inhibitörleri (PARPi) kullanılmaktadır. Birkaç hr eksikliği kanserde, PARPi tedavisi, İk eksikliği olan hücrelerin alternatif bir yol ile biriken hasarı onarma yetersizliği nedeniyle sentetik ölümcül bir yanıta yol açar9,10. Şu anda dört FDA onaylı PARPi vardır: Olaparib, Rucaparib, Niriparib ve Talazoparib (BMN 673 olarak da adlandırılır), çeşitli meme ve yumurtalık kanseri tedavileri için kullanılmaktadır11. Bununla birlikte, PARPi direnci yaygındır ve İk yeterliliğinin geri alınarak potansiyel bir neden ortaya çıkar12. Işınlama disregülasyonu varlığında PARP-1’in kaybı veya inhibisyonu, rezekozom makinelerini kontrol eder ve daha uzun ssDNA yollarının birikmesine yol 13. Bu nedenle, in vivo DNA rezeksiyonunun derinlemesine incelenmesi, DNA onarım yollarının daha net anlaşılması ve daha sonra kanseri tedavi etmek ve PARPi direncini yenmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
DNA rezeksiyon olaylarını tespit etmek için çeşitli yöntemler 5. Bu yöntemlerden biri, stres kaynaklı DSB’den sonra resekte edilen DNA’nın anti-RPA antikoru kullanılarak dolaylı olarak lekelenmesine ve görselleştirilmesine izin eden klasik IF tabanlı tekniktir. Genomik DNA’nın 5-bromo-2′-deoksiyridin (BrdU) ile etiketlenmesi ve sadece ssDNA’nın tespitinin alınması DNA rezeksiyon olaylarının doğrudan ölçümüdür. DNA replikasyonu gibi birden fazla hücresel işlemde yer alan RPA’nın izlenmesini atlatmaz. Burada açıklanan yöntemde, tek bir hücre döngüsü için BrdU ile kuluçkaya yatırılan hücreler, BrdU’nun çoğaltıcı hücresel DNA’nın bir ipliğine dahil edilmesine izin verir. Rezeksiyondan sonra IF boyama, BrdU’nun sadece ssDNA formunda tespit edilmesine izin vererek, bir anti-BrdU antikoru kullanılarak gerçekleştirilir. Bu antikor sadece maruz kalan BrdU nükleotitlerine erişebilir ve çift iplikli DNA’ya entegre olanları tespit etmez. Floresan mikroskopi kullanılarak, resected DNA dakik BrdU/ssDNA odakları şeklinde görselleştirilebilir. Bu odakların nükleer yoğunluğu, DNA hasarından sonra rezeksiyonu ölçmek için bir okuma olarak kullanılabilir. Bu makalede, çoğu memeli hücre hattına uygulanabilen bu yöntemin süreçleri adım adım açıklanmaktadır. Bu yöntem, kavram kanıtı olarak selüloda DNA ucu rezeksiyonunu izlemenin basit bir yolu olarak geniş bir yardımcı olmalıdır.
Bu makalede, selülodaki DNA rezeksiyonundaki varyasyonları ölçmek için IF boyamadan yararlanan bir yöntem açıklanmaktadır. DNA rezeksiyonu üzerindeki etkiyi gözlemlemek için mevcut standart RPA boyamasıdır; ancak bu, DNA replikasyondan etkilenebilecek dolaylı bir yöntemdir. Daha önce, BrdU pozitif ve BrdU negatif hücrelerde ortaya çıkan yoğunlukları sınıflandırmak için başka bir BrdU kuruluş tabanlı DNA rezeksiyonU tekniği tanımlanmıştır. Bu yöntem, hr geçirmeyen hücrelerin a…
The authors have nothing to disclose.
Marie-Christine Caron’a olağanüstü teknik tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri J.Y.M (CIHR FDN-388879) tarafından finanse edilen fonlarla desteklenmektedir. J.-Y.M. DNA Onarımı ve Kanser Terapötikleri’nde Tier 1 Kanada Araştırma Başkanı’nın sahibidir. J.O’S bir FRQS doktora öğrencisi ve S.Y.M frqs doktora sonrası öğrencisidir.
Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
HeLa | ATCC | CCL-2 | |
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
Needle | |||
PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
Tweezers |