Özet

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

Published: April 28, 2021
doi:

Özet

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

Abstract

DNA hasar yanıtının (DDR) incelenmesi, kanser tedavisi için DDR hedefli ilaçların kullanımı nedeniyle daha önemli hale gelen karmaşık ve temel bir alandır. Bu hedefler, çeşitli DNA onarım biçimlerini başlatan poli (ADP-riboz) polimerazlarıdır (PARP’lar). Parp inhibitörleri (PARPi) kullanarak bu enzimlerin inhibe edilmesi, meme kanseri tip 1 (BRCA1), BRCA2 veya BRCA2 (PALB2) ortağı ve lokalizatöründeki mutasyonlar nedeniyle homolog rekombinasyon (HR) eksikliği olan hücrelerde terapötik bir güvenlik açığı sağlayarak sentetik öldürücülüğe ulaşır.

PARPi ile tedavi edilen hücreler DNA çift iplikçik kopuları (DSB’ ler) biriktirir. Bu kırılmalar DNA uç rezeksiyon makineleri tarafından işlenerek tek iplikli (ss) DNA oluşumuna ve daha sonra DNA onarımına yol açmaktadır. BRCA1 eksikliği olan bir bağlamda, 53BP1 ve DYNLL1 gibi DNA rezeksiyon inhibitörlerindeki mutasyonlar yoluyla DNA rezeksiyonunu canlandırmak PARPi direncine neden olur. Bu nedenle, selülodaki DNA rezeksiyonunun izlenebilmesi, DNA onarım yollarının daha net anlaşılması ve PARPi direncinin üstesinden gelmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. İmmünoresans (IF) tabanlı teknikler, DNA hasarından sonra küresel DNA rezeksiyonunun izlenmesini sağlar. Bu strateji 5-bromo-2′-deoksiyuridin (BrdU) ile uzun nabız genomik DNA etiketleme gerektirir. DNA hasarı ve DNA sonu rezeksiyonu sonrasında, ortaya çıkan tek iplikli DNA, özellikle yerel koşullar altında bir anti-BrdU antikoru tarafından tespit edilir. Ayrıca, DNA rezeksiyonu, hücre döngüsünün çeşitli aşamalarını ayırt etmek için hücre döngüsü belirteçleri kullanılarak da incelenebilir. S/G2 fazındaki hücreler İk içinde uç rezeksiyonunun incelenmesine izin verirken, G1 hücreleri homolog olmayan uç birleştirmeyi (NHEJ) incelemek için kullanılabilir. Bu IF yöntemi için hücre döngüsü ayrımcılığı ile birleştirilmiş ayrıntılı bir protokol bu makalede açıklanmıştır.

Introduction

DNA onarım faktörlerinin modülasyonu, özellikle DNA DSB onarım eksikliği olan tümör ortamlarında kanser tedavisi için sürekli gelişen bir yöntemdir. Spesifik onarım faktörlerinin inhibisyonu, kanser hücrelerini DNA’ya zarar veren ajanlara duyarlı hale getirmek için kullanılan ustaca stratejilerden biridir. Onlarca yıllık araştırma, DNA onarım genlerinin çeşitli mutasyonlarının terapötik strateji seçimleri için biyobelirteç olarak tanımlanmasına yol açtı1. Sonuç olarak, DNA onarım alanı, kişiselleştirilmiş tıp kavramını güçlendirerek çok çeşitli tedaviler sağlamak için ilaç geliştirme merkezi haline gelmiştir.

DSB’ler iki ana yol tarafından onarılır: NHEJ ve HR2. NHEJ yolu hataya eğilimlidir, iki DNA ucunu çok az veya hiç DNA son işleme ile hızlı bir şekilde bağlar ve protein kinaz (DNA-PKcs), Ku70/80 kompleksi, 53BP1 ve RIF1 proteinlerini içerir3. Buna karşılık, İk BRCA14 tarafından başlatılan sadık bir mekanizmadır. İk onarımında önemli bir adım, 3′-OH uçlu tek iplikli (ss) DNA’ya yol açan kırık uçların bozulması olan DNA sonu rezeksiyon işlemidir. BRCA1, 5′ ila 3′ DNA rezeksiyonunda yer alan rezektosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1’i oluşturan aşağı akış proteinlerinin işe alımını kolaylaştırır5.

İlk son rezeksiyon, MRE11’in endonücleaz aktivitesi ile gerçekleştirilir ve DNA2 ve EXO1 çekirdekleri tarafından daha fazla işlenmesine izin verir. Oluşturulan ssDNA çıkıntıları, daha fazla işlemden korumak için Çoğaltma ProteinI A (RPA) tarafından hızlı bir şekilde kaplanır. Daha sonra BRCA2, PALB2 ve BRCA1, RPA’nın yer değiştirmesine ve homolojiye yönelik onarım mekanizması için gerekli rad51 nükleofilamentinin montajına aracılık etmek için devreye girer. Genomik bütünlüğün en iyi şekilde sürdürülmesi için NHEJ ve İk kullanımı arasında ince bir denge gereklidir. Yol seçimi hücre döngüsü aşamasına bağlıdır. İk tercihen DNA rezeksiyonun en üst seviyede olduğu S-G2 aşamalarında kullanılır ve uygun onarımı sağlamak için kardeş kromatlar mevcuttur.

Poli (ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP-1), DSB’ye alınan en erken proteinlerden biridir. Hem rezeksiyon aktivitesini hem de NHEJ5,6’da yer alan aşağı akış efektörlerinin montajını düzenler. PARP-1, çoğaltma sırasında DNA tek iplikli kesme onarımı için de gereklidir7,8. DNA onarımındaki önemli rolü nedeniyle KANSER TEDAVILerİ OLARAK PARP inhibitörleri (PARPi) kullanılmaktadır. Birkaç hr eksikliği kanserde, PARPi tedavisi, İk eksikliği olan hücrelerin alternatif bir yol ile biriken hasarı onarma yetersizliği nedeniyle sentetik ölümcül bir yanıta yol açar9,10. Şu anda dört FDA onaylı PARPi vardır: Olaparib, Rucaparib, Niriparib ve Talazoparib (BMN 673 olarak da adlandırılır), çeşitli meme ve yumurtalık kanseri tedavileri için kullanılmaktadır11. Bununla birlikte, PARPi direnci yaygındır ve İk yeterliliğinin geri alınarak potansiyel bir neden ortaya çıkar12. Işınlama disregülasyonu varlığında PARP-1’in kaybı veya inhibisyonu, rezekozom makinelerini kontrol eder ve daha uzun ssDNA yollarının birikmesine yol 13. Bu nedenle, in vivo DNA rezeksiyonunun derinlemesine incelenmesi, DNA onarım yollarının daha net anlaşılması ve daha sonra kanseri tedavi etmek ve PARPi direncini yenmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.

DNA rezeksiyon olaylarını tespit etmek için çeşitli yöntemler 5. Bu yöntemlerden biri, stres kaynaklı DSB’den sonra resekte edilen DNA’nın anti-RPA antikoru kullanılarak dolaylı olarak lekelenmesine ve görselleştirilmesine izin eden klasik IF tabanlı tekniktir. Genomik DNA’nın 5-bromo-2′-deoksiyridin (BrdU) ile etiketlenmesi ve sadece ssDNA’nın tespitinin alınması DNA rezeksiyon olaylarının doğrudan ölçümüdür. DNA replikasyonu gibi birden fazla hücresel işlemde yer alan RPA’nın izlenmesini atlatmaz. Burada açıklanan yöntemde, tek bir hücre döngüsü için BrdU ile kuluçkaya yatırılan hücreler, BrdU’nun çoğaltıcı hücresel DNA’nın bir ipliğine dahil edilmesine izin verir. Rezeksiyondan sonra IF boyama, BrdU’nun sadece ssDNA formunda tespit edilmesine izin vererek, bir anti-BrdU antikoru kullanılarak gerçekleştirilir. Bu antikor sadece maruz kalan BrdU nükleotitlerine erişebilir ve çift iplikli DNA’ya entegre olanları tespit etmez. Floresan mikroskopi kullanılarak, resected DNA dakik BrdU/ssDNA odakları şeklinde görselleştirilebilir. Bu odakların nükleer yoğunluğu, DNA hasarından sonra rezeksiyonu ölçmek için bir okuma olarak kullanılabilir. Bu makalede, çoğu memeli hücre hattına uygulanabilen bu yöntemin süreçleri adım adım açıklanmaktadır. Bu yöntem, kavram kanıtı olarak selüloda DNA ucu rezeksiyonunu izlemenin basit bir yolu olarak geniş bir yardımcı olmalıdır.

Protocol

1. Hücre kültürü, tedavileri ve kapak hazırlığı NOT: Işıtratlamanın yanı sıra tüm hücre kaplamaları, transeksiyonlar ve tedaviler steril bir hücre kültürü başlığı altında gerçekleşmelidir. 1. Gün 6 kuyulu bir plakaya, gerektiği kadar çok koşul için her kuyuya tek bir kapak kılıfı yerleştirin. Plaka ~150,000 HeLa hücreleri transfection veya ilaç tedavisi için, istenildiği gibi.NOT: Transfecting ise, kaplama anında ters transfeksiyon…

Representative Results

Bu protokolde Bromodeoxyuridine (BrdU) bazlı test, HeLa hücrelerinin ışınlama kaynaklı hasara rezeksiyon yanıtını nicel olarak ölçmek için kullanılmıştır. Oluşturulan ssDNA izleri immünofluoresans lekelemeden sonra farklı odaklar olarak görselleştirilir (Şekil 1A). Tanımlanan odaklar daha sonra ölçüldü ve çekirdekteki BrdU lekelemenin toplam entegre yoğunluğu olarak ifade edildi (Şekil 1B, Ek Şekil S1, Ek Şekil S2</strong…

Discussion

Bu makalede, selülodaki DNA rezeksiyonundaki varyasyonları ölçmek için IF boyamadan yararlanan bir yöntem açıklanmaktadır. DNA rezeksiyonu üzerindeki etkiyi gözlemlemek için mevcut standart RPA boyamasıdır; ancak bu, DNA replikasyondan etkilenebilecek dolaylı bir yöntemdir. Daha önce, BrdU pozitif ve BrdU negatif hücrelerde ortaya çıkan yoğunlukları sınıflandırmak için başka bir BrdU kuruluş tabanlı DNA rezeksiyonU tekniği tanımlanmıştır. Bu yöntem, hr geçirmeyen hücrelerin a…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Marie-Christine Caron’a olağanüstü teknik tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri J.Y.M (CIHR FDN-388879) tarafından finanse edilen fonlarla desteklenmektedir. J.-Y.M. DNA Onarımı ve Kanser Terapötikleri’nde Tier 1 Kanada Araştırma Başkanı’nın sahibidir. J.O’S bir FRQS doktora öğrencisi ve S.Y.M frqs doktora sonrası öğrencisidir.

Materials

Alexa 568 goat anti-rabbit Molecular probes A11011 1:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Molecular probes A11001 1:800
Anti PARP1 (F1-23) Homemade 1:2500
Anti PCNA (SY12-07) Novus NBP2-67390 1:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A) Abcam Ab7291 1:100000
anti-BrdU GE Healthcare RPN202 1:1000
Benchtop X-ray Irradiator Cell Rad
BMN673 MedChem Express HY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU) Sigma B5002
BSA Sigma A7906
Cell profiler Broad Institute V 3.19 https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft Fisher scientific 13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen Life Technology D1306
DMEM high glucose Fisher scientific 10063542
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Fetal Bovine serum Gibco 12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 Fisher scientific 12 541B
Fluorescent microscope Leica DMI6000B 63x immersion objective
HeLa ATCC CCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V VWR 51030408 37% CO2
MgCl2 BioShop Canada MAG520.500
NaCl BioShop Canada SOD002.10
Needle
PBS 1x Wisent Bio Products 311-010-CS
PFA 16% Cedarlane Labs 15710-S(EM)
PIPES Sigma-Aldrich P6757-100G
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen Life Technology P-36930
RNAiMAX Invitrogen 13778-075
siPARPi Dharmacon AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA control Dharmacon UUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium Deoxycholcate Sigma-Aldrich D6750-100G
Sucrose BioShop Canada SUC507.5
Tris-base BioShop Canada TRS001.5
Trition X-100 Millipore Sigma T8787-250ML
Tween20 Fisher scientific BP337500
Tweezers

Referanslar

  1. Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D’Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  4. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  5. Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
  6. Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
  7. Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
  8. Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
  9. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  10. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  11. Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
  12. Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
  13. Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
  14. Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
  15. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  16. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  17. Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
  18. Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
O’Sullivan, J., Mersaoui, S. Y., Poirier, G., Masson, J. Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging. J. Vis. Exp. (170), e62553, doi:10.3791/62553 (2021).

View Video