Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae’de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1’in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1’in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
ABC taşıyıcılarının başarılı biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu büyük ölçüde heterolog ekspresyon sisteminin seçimine bağlıdır. Son yirmi yılda, birçok önemli mantar zarı proteinini incelemek için kullanılan bir maya zarı proteini ekspresyon platformu geliştirdik. Ekspresyon konağı Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ yedi büyük endojen ABC taşıyıcılarında silinir ve genomik PDR5 lokusunda tek kopya olarak bıçaklanmış heterolog membran protein genlerinin konsitütif aşırı ekspresyonunu sağlayan fonksiyon kazancı mutasyonu ile pdr1-3 transkripsiyon faktörünü içerir. Çok yönlü plazmid vektörlerin oluşturulması ve tek adımlı klonlama stratejilerinin optimizasyonu, heterolog ABC taşıyıcılarının hızlı ve doğru klonlanmasını, mutajenizini ve ekspresyonunu sağlar. Burada, yeni bir proteaz-bölünebilir mGFPHis çift etiketinin geliştirilmesini ve kullanımını anlatıyoruz (yani, monomerik maya geliştirilmiş yeşil floresan protein yEGFP3 altı-histidin benzeşim saflaştırma etiketine kaynaşmış) etiketin ilgi proteini ile olası müdahalesini önlemek ve O etiketinin nikel benzeşim reçinelerine bağlama verimliliğini artırmak için tasarlanmıştır. mGFPHis’in membran proteini ORF’ye (açık okuma çerçevesi) füzyonu, poliakrilamid jellerin incelenmesi ve mGFPHis etiketini koruyan bozulma ürünlerinin tespiti ile proteinin kolayca ölçülmesini sağlar. Bu özelliğin membran proteini çözünürlüğü için deterjan taramayı nasıl kolaylaştırdığını gösteriyoruz. S. cerevisiae ADΔΔ’de aşırı ifade edilen C-terminal etiketli Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1’in küçük ölçekli plazma membran preparatlarının verimli, hızlı ve güvenilir izolasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu küçük ölçekli plazma membran izolasyon protokolü, tek bir iş günü içinde yüksek kaliteli plazma membranları üretir. Plazma membran preparatları Cdr1 ve Cdr1 mutant varyantlarının enzim aktivitelerini belirlemek için kullanılabilir.
İntegral membran proteinlerinin doğal lipit ortamlarından çıkarılması, yapılarını ve işlevlerini önemli ölçüde etkileyebilir1,2,3,4. Biyolojik membranların karmaşık lipit bileşimi5, kritik öneme sahip protein-lipit etkileşimlerinin gerçekleşebilmesini sağlar6. Lipitler membran proteinlerinin yapısal bütünlüğünü korur, böylece membran bölmesi hedeflerinde(ler) 7,8‘de doğru çalışmasını sağlar. Bu nedenle, membran proteini saflaştırmasında kritik bir ilk adım, proteinin yapısını ve/veya işlevini etkilemeden doğal ortamından çıkarılmasıdır.
Çoğu hidrofobik doğası ile ilgili olan membran proteinlerinin yapısını ve X-ışını kristalografisi veya kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) 9 , 10,11,12içingerekli miktarlarda düzgün katlanmış ve fonksiyonel membran proteinlerini ifade etmenin zorluklarının karakterizesinde birçok engel vardır. Üç tür membran protein ekspresyon sistemi vardır: homolog9, heterolog13,14,15ve in vitro ekspresyon sistemleri16,17. Birçok ifade sisteminin genellikle düşük ifade seviyeleri veya yasaklayıcı maliyetleri, membran proteinleri üretmek için tercih edilen seçenek olarak sadece birkaç ana bilgisayar bırakır. Bakteri konakçısı, Escherichia coli, S. cerevisiae ve Pichia pastoris mayalarıve Sf9 böcek hücreleri veya memeli hücre hatları18gibi daha yüksek ökaryotlar içerir. Tüm membran protein ekspresyon teknolojilerinin avantajları ve dezavantajları vardır; bununla birlikte, S. cerevisiae belki de membran protein üretimi için uygun en iyi çalışılan ökaryotik model organizmadır. Genetik mühendisliği, ilaç keşfi, sentetik biyoloji ve ökaryotik membran proteinlerinin ekspresyasyonu14 , 19,20,21’dekiuygulamalarla çok yönlüdür.
Bu çalışmada, büyük C. albicans multidrug efflux pompaCdr1’i aşırı ifade etmek ve incelemek için S. cerevisiae ADΔ14 ve ADΔΔ 22 tercih edilen konaklar ( Şekil1A)ile patentli bir S. cerevisiae membran protein ekspresyon teknolojisi21 kullanılmıştır. Her iki S. cerevisiae suşu da AD1-8utürevleridir –23, URA3 veya HIS1 genomik loci’deki istenmeyen entegrasyon yoluyla ortaya çıkan yanlış pozitif urasil veya histidin prototroph dönüştürücülerini ortadan kaldırmak için silinen ura3 (ADΔ) veya hem ura3 hem de onun1 (ADΔΔ) genlerine sahiptir. Şekil 1A’dabelirtilen 7 büyük multidrug efflux pompa23’ünsilinmesi, ADΔΔ’yi çoğu ksenobiyotiklere karşı mükemmel derecede hassas hale getirir. Fonksiyon kazancı mutant transkripsiyon faktörü Pdr1-3, Cdr1 (Şekil 1A’dakikırmızı sekizgenler) gibi heterolog membran proteinlerinin konsitülatif aşırı ekspresyonuna neden olur. heterolog-ORF içeren dönüşüm kasetinin (Şekil 1A) genomik PDR5 lokusunda (Şekil 1A’damavi dikdörtgen) iki homolog rekombinasyon olayı ile entegrasyonu. C-terminal mGFPHis etiketli proteinlerin uygun plazma membran lokalizasyonu konfokal mikroskopi (Şekil 1A) ile doğrulanabilir ve O etiketi etiketli proteinin nikel benzeşim saflaştırılması için kullanılabilir. Bazı mantar ABC taşıyıcılarının (örneğin, Candida krusei ABC1)pABC3 türevi plazmidlere klonlamaları, ancak hücre toksisitesi nedeniyle Escherichia coli’de yayılamadıkları için mümkün değildi. Bu,14,24 membran proteinlerinin N veya C-terminuslarında çeşitli benzeşim, epitop veya muhabir etiketleriyle etiketlenmiş tek adımlı klonlamanın doğrudan S. cerevisiae ADΔΔ’ye(Şekil 1C)geliştirilmesine neden oldu. S. cerevisiae Çeşitli CDR1 mutantlarını aşırı ifade eden ADΔΔ suşları, 25 bp(Şekil 1C)ile çakışan beş adede kadar ayrı PCR parçası kullanılarak da verimli bir şekilde oluşturulabilir. Bu protokolü kullanarak, birçok ilgi çekici ORF çok kısa bir süre içinde düşük maliyetle ve yüksek verimlilikle klonlanabilir, ifade edilebilir ve karakterize edilebilir. Dönüşüm verimliliği, her ek PCR parçasıyla yalnızca ~2 kat azaltır.
İstenirse, ifade düzeyleri, genellikle yüksek, kesin ifade düzeylerinin% 0,1-% 50’si arasında herhangi bir yere kadar ifade düzeylerini tahmin edilebilir şekilde ayarlamak için astar tasarımı tarafından kolayca manipüle edilebilir25. Optimize edilmiş, çok fonksiyonlu, pABC314 türev klonlama vektörü, pABC3-XLmGFPHis26 (Şekil 1B) bir HRV-3C proteaz bölünme bölgesi (X; LEVLFQ| GP), sık kullanılan tütün etch virüsünden (TEV) daha iyi performans gösteren bir proteaz27. L beş amino asit (GSGGS) bağlayıcıdır, mGFP bir monomerik mutanttır (A206K)28,maya geliştirilmiş yeşil floresan protein varyantı yEGFP330’un29 versiyonudur ve His üç amino asit bağlayıcıdır (GGS) ve ardından altı-histidin (HHHHHH) nikel benzeşim proteini saflaştırma etiketidir.
Bu ifade teknolojisi ilaç keşfinde ve membran proteinlerinin incelenmesinde başarıyla kullanılmıştır. Mantar azol ilaç hedefi olan S. cerevisiae Erg1131için ilk yapı bu teknoloji kullanılarak çözüldü. Ayrıca C. albicans Cdr132 , 33,34’ün ayrıntılı karakterizasyonunu ve gelecekteki yüksek çözünürlüklü yapıları doğrulamak için sistein çapraz bağlama çalışmalarına uygun sistein eksikliği olan bir Cdr1 molekülü35’in oluşturulmasını sağladı. Büyük insan mantar patojenlerinden diğer birçok ABC taşıyıcısı (yani, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei ve Fusarium solani tür kompleksi) de bu ifade platformu24, 36,37,38,39kullanılarak ayrıntılı olarak incelenmiştir. Bu, yeni floresan efflux pompa substratı Nil kırmızısı 40 ve spesifik 41 ve geniş spektrumlu 14 ,33,42 , 43 ,44 efflux pompa inhibitörlerini keşfetmek için yüksek verimli ekranlarda kullanılanefflux pompalarını aşırı ifade eden bir S. cerevisiae suşları panelinin üretilmesini sağlamıştır. Bu sistemin kullanımı ayrıca clorgyline’ın türünün ilk geniş spektrumlu mantar çokdrug efflux pompa inhibitörü42olarak keşfedilmesini sağladı.
Membran proteinlerinin tam çözünmesi ve endojen lipitlerden yoksun homojen bir membran protein-misel preparatının oluşturulması, yüksek deterjan konsantrasyonları gerektirir45. Ancak ne yazık ki, bu genellikle membran proteini 5 ,8,45,46‘yıda devre dışı bırakmaktadır. Deterjan monomerlerinin özellikleri ve çözeltideki toplamaları, hidrofobik kuyruğun fiziksel özelliklerinden, alkil zincirinin uzunluğundan ve dallanmasından, aromatik bir çekirdeğin veya floroalkil yan zincirin varlığından veya polioksiyetil ünitelerin sayısından etkilenir. Bu nedenle deterjan taraması, membran proteini çözünmesi ve saflaştırılması için en uygun deterjanı belirlemek için önemli bir ilk adımdır.
C. albicans ciddi, hayatı tehdit eden invaziv enfeksiyonlara neden olabilen immün sistemi baskılanmış bireylerin önemli bir insan mantar patojenidir47ve azol antifungal ilaçlara dirençli hale gelebilir48,49. C. albicans multidrug direncinin ana mekanizmalarından biri Cdr150plazma membranında bulunan ABCG alt familyasının tip II ATP bağlayıcı kaseti (ABC) taşıyıcı51’dir. Tam boyutlu mantar ABCG taşıyıcıları (iki nükleotid bağlama etki alanı [NBD] ve iki transmembran etki alanından [TMD]) daha yaygın olarak pleiotropik ilaç direnci (PDR) taşıyıcıları olarak bilinir ve benzersiz ters etki alanı topolojisi [NBD-TMD]2ile karakterize edilir. PDR taşıyıcıları sadece52, 53ve mantar54 bitkilerinde bulunur. Önemlerine rağmen, PDR taşıyıcıları için hiçbir yapı yoktur, ancak insan yarı boyutlu ABCG taşıyıcıları için yapılar son zamanlarda cdr133için ilk belirsiz modelin oluşturulmasına yardımcı olan çözülmüştür. Bununla birlikte, son deneysel kanıtlarımız, bu modelin muhtemelen kusurlu olduğunu göstermektedir, çünkü mantar PDR taşıyıcıları karakteristik asimetrik NBD’lere sahiptir ve bu da muhtemelen benzersiz bir taşıma mekanizmasıyla sonuçlanır. Bu nedenle, Cdr1’in yüksek çözünürlüklü bir yapısı, hem efflux aracılı ilaç direncinin üstesinden gelmeye yardımcı olabilecek yeni efflux pompa inhibitörlerinin rasyonel tasarımı hem de bu önemli ABC taşıyıcı ailesinin etki mekanizması hakkında içgörüler sağlamak için gereklidir.
Bu çalışmanın amacı, Cdr1 için yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek amacıyla, genetiği değiştirilmiş S. cerevisiae ekspresyon konağında Cdr1’in ekspresyasyonu, çözünürlüğü ve saflaştırılması için güvenilir protokoller geliştirmekti. Bu sürecin bir parçası olarak, proteaz-bölünebilir mGFPHis çift etiket (Şekil 1B) etiketi Cdr1’in C-terminusundan ayıran 16 kalıntılı bir bağlayıcı ile tasarlanmıştır, bu da ekli 6x Benzeşim etiketinin nikel benzeşim reçinesine bağlanmasını iyileştirdi ve cdr1 ifade seviyelerinin canlı hücrelerde ve tüm saflaştırma işlemi sırasında izlenmesini sağladı. Cdr1’in biyokimyasal karakterizasyonu için kullanılabilecek, yaklaşık% 10 C. albicans Cdr1 (SDS-PAGE’den sonra Coomassie boyama ile tahmin edildiği gibi) içeren küçük ölçekli maya plazma membran protein preparatları için tekrarlanabilir bir protokol de geliştirilmiştir.
Membran proteinlerinin yapısal analizindeki son ilerlemeye rağmen, Cdr1 veya başka bir PDR taşıyıcısı için 3D yapı mevcut değildir. Bu nedenle, Cdr1 yapısı ve biyokimyasal özellikleri hakkında bilgi edinmek önemlidir, çünkü bu sadece efflux aracılı ilaç direncinin üstesinden gelmek için yeni ilaçların rasyonel tasarımı hakkında değil, aynı zamanda ABC proteinlerinin önemli bir alt familyasının işlev mekanizmasına da içgörü sağlayacaktır.
Membran protein…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Yeni Zelanda Marsden Fonu’ndan (Grant UOO1305) ve Chulalongkorn Üniversitesi, Bangkok, Tayland Tıp Fakültesi’nden (M. Niimi) bir blok hibeyi minnetle kabul ediyorlar. Otago Üniversitesi’ne G. Madani’ye doktora bursu sağladığı için teşekkür etmek istiyorlar. Yazarlar ayrıca Profesör Stefan Raunser ve meslektaşları Dr. Amir Apelbaum ve Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam’a, G. Madani’nin Max Planck Moleküler Fizyoloji Enstitüsü’nde (MPIMP), Dortmund, Almanya’da 6 aylık ziyaretinde destekleri ve gözetimleri için şükranlarını sunmak istiyor. Yazarlar ayrıca Alman Akademik Değişim Servisi’ne (DAAD) G. Madani’ye MPIMP’yi ziyaret etmesi için bir araştırma hibesi (57381332) sağladığı için teşekkür ediyor.
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) | Merck | 77-86-1 | |
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG310S | LMNG |
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside | Anatrace | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG322S | DMNG |
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-α-M |
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) | Bio-Rad | 1610148 | |
Acetic acid (glacial) | Merck | 64-19-7 | |
Agar | Formedium | 009002-18-0 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
Ammonium persulphate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
ATP disodium salt | sigma-Aldrich | A-6419 | |
Bromophenol blue | SERVA Electrophoresis GmbH | 34725-61-6 | |
CHAPS | Anatrace | C316S | |
CHAPSO | Anatrace | C317S | |
CSM | Formedium | DCS0019 | |
CSM minus uracil | Formedium | DCS0161 | |
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C327S | CYMAL-7 |
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C321S | CYMAL-1 |
Digitonin | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roche Diagnostics | 10197785103 | |
DMSO | Merck | 67-68-5 | |
Ethanol | Merck | 459836 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | Applied Biosystems | 78205 | A blend of exonuclease and phosphatase |
Glucose | Formedium | 50-99-7 | |
Glycerol | Merck | 56-81-5 | |
Glycine | Merck | G8898 | |
HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003172510 | |
KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | Use for reliable colony PCR |
lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
Magnesium chloride hexa-hydrate | sigma-Aldrich | M2393 | |
MES | Formedium | 145224-94-8 | |
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide | Anatrace | H110S | HEGA-10 |
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide | Anatrace | M320S | MEGA-10 |
n-Decyl-phosphocholine | Anatrace | F304S | Fos-choline-10 |
n-Decyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D322S | DM |
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ312S | Anzergent 3-12 |
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide | Anatrace | D360S | LDAO |
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside | Anatrace | D310HA | α-DDM |
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310S | β-DDM |
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | N330S | NM |
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ318S | Anzergent 3-18 |
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
n-Octyl-phosphocholine | Anatrace | F300S | Fos-choline-8 |
n-Octyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | O311S | OG |
n-Tetradecyl-phosphocholine | Anatrace | F312S | Fos-choline-14 |
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T315S | TDM |
n-Tridecyl-phosphocholine | Anatrace | F310S | Fos-choline-13 |
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T323S | – |
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | U300S | UM (UDM) |
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | TRITON X-100 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
Peptone | Formedium | 3049-73-7 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase | New England Biolabs | M0535S | High-fidelity DNA polymerase |
polyethylene glycol (PEG 3350) | Sigma-Aldrich | 25322-68-3 | |
polyoxyethylenesorbitan monooleate | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P8394 | |
Protein Assay Kit | Bio-Rad | 5000122 | RC DC Protein Assay Kit II |
QC Colloidal Coomassie Stain | Bio-Rad | 1610803 | |
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) | Abcam | AB116028 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
Sodium L-ascorbate BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350S | DDS |
Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
Yeast extract | Formedium | 008013-01-2 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
Equipment (type) | |||
Centrifuge (Eppendorf 5804) | Eppendorf | ||
Centrifuge (Beckman Ultra) | Beckman | ||
Centrifuge (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) | Bio-Rad | ||
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) | Bio-Rad | ||
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) | BioTek Instruments | ||
PCR thermal cycler (C1000 Touch) | Bio-Rad | ||
Power supply (PowerPac) | Bio-Rad | ||
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | Bio-Rad | ||
Shaking incubator (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | GE17-5172-01 | |
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd |