Bu protokol, proteotoksik antimikrobiyal ile tedaviden sonra Escherichia coli’den agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılmasını ve görselleştirilmesini açıklar. Bu prosedürün ardından, farklı bakteri suşlarında ve/veya tedaviler arasında in vivo protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir.
Canlı organizmaların çevresel ve hücresel streslere maruz kalması genellikle protein homeostazında bozulmalara neden olur ve protein toplanmasına neden olabilir. Bakteri hücrelerinde protein agregalarının birikmesi, hücresel fenotipik davranışta büyüme oranlarında azalma, stres direnci ve virülans da dahil olmak üzere önemli değişikliklere yol açabilir. Bu stresör aracılı fenotiplerin incelenmesi için çeşitli deneysel prosedürler mevcuttur. Bu makalede, gümüş ruthenium içeren bir antimikrobiyal ile tedavi edildikten sonra farklı Escherichia coli suşlarından agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılması ve görselleştirilmesi için optimize edilmiş bir test açıklanmaktadır. Bu bileşiğin reaktif oksijen türleri ürettiği ve yaygın protein toplamasına neden olduğu bilinmektedir.
Yöntem, protein agregalarının ve çözünür proteinlerin işlenmiş ve işlenmemiş hücrelerden santrifüj bazlı ayrıştırılmasını, sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve Coomassie boyama ile daha sonra ayırma ve görselleştirme ile birleştirir. Bu yaklaşım basit, hızlıdır ve farklı E. coli suşlarında protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir. Metodoloji, diğer proteotoksik antimikrobiyallerin çok çeşitli bakterilerde in vivo protein toplama üzerindeki etkisini araştırma imkanı da dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalara sahiptir. Ayrıca, protokol proteotoksik maddelere karşı direncin artmasına katkıda bulunan genleri tanımlamak için kullanılabilir. Jel bantlar, özellikle toplanmaya eğilimli proteinlerin daha sonra tanımlanması için kullanılabilir.
Bakteriler kaçınılmaz olarak düşük pH da dahil olmak üzere sayısız çevresel strese maruz kalır (örneğin,memelimidesinde) 1,2, reaktif oksijen ve klor türleri (ROS/RCS) (örneğin, fagositlerde oksidatif patlama sırasında)3,4,5,yüksek sıcaklıklar (örneğin, kaplıcalarda veya ısı şoku sırasında)6,7ve birkaç güçlü antimikrobiyal (örneğin, bu protokolde kullanılan AGXX)8. Proteinler bu stresörlerden herhangi birine karşı özellikle savunmasızdır ve maruz kalma, proteinin toplanmasına neden olabilir. Tüm organizmalar protein yanlış katlama ile başa çıkmalarını sağlayan koruyucu sistemler kullanmaktadır9. Bununla birlikte, şiddetli stres protein kalite kontrol makinelerini bunaltabilir ve proteinlerin ikincil ve/veya üçüncül yapısını bozabilir ve sonuçta proteinleri devre dışı bırakabilir. Sonuç olarak, protein agregaları bakteri üreme ve hayatta kalma, stres direnci ve virülans için gerekli kritik hücresel fonksiyonları ciddi şekilde bozabilir10. Bu nedenle, protein toplama ve bakterilerdeki sonuçlarına odaklanan araştırmalar, bulaşıcı hastalık kontrolü üzerindeki potansiyel etkisi nedeniyle ilgili bir konudur.
Isı kaynaklı protein açma ve toplama genellikle geridönüşümlüdür 7. Buna karşılık, oksidatif stres gibi diğer proteotoksik gerilmeler, spesifik amino asit yan zincirlerinin oksidasyonu yoluyla geri dönüşü olmayan protein değişikliklerine neden olabilir ve bu da proteinin yanlış/ yanlış katlanmasına ve sonunda protein toplama4. Çözünmeyen protein agregalarının stres kaynaklı oluşumu, moleküler refakatçiler ve maya ve bakterilerdeki koruyucu işlevleri bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir11,12,13. Çözünmeyen protein agregalarının izolasyonu ve analizi için çeşitli biyokimyasal teknikler kullanan çeşitli protokoller yayınlanmıştır14,15,16,17. Mevcut protokoller esas olarak ısı şoku ve/veya moleküler refakatçilerin tanımlanması üzerine bakteriyel protein toplamayı incelemek için kullanılmıştır. Bu protokoller kesinlikle sahaya ilerlemekle birlikte, deneysel prosedürlerde bazı büyük rahatsızlıklar vardır, çünkü (i) hücre bozucuların, Fransız basınının ve/veya sonication14 , 15,17veya (iii) zaman alıcı tekrarlanan kullanımı da dahil olmak üzere 10 L 14,17, (ii) karmaşık fiziksel bozulma süreçlerine kadar büyük bir bakteri kültürü hacmi gerektirirler. yıkama ve kuluçka adımları15,16,17.
Bu makale, önceki yaklaşımların sınırlamalarını ele almayı amaçlayan ve proteotoksik antimikrobiyal yüzey kaplaması ile tedaviden sonra iki farklı Escherichia coli suşunda oluşan protein agregalarının miktarının analiz edilmesine izin veren değiştirilmiş bir protokolü açıklar. Kaplama, askorbik asit ile şartlandırılmış metal-gümüş (Ag) ve ruthenium (Ru) oluşur ve antimikrobiyal aktivitesi reaktif oksijen türlerinin üretilmesi ile elde edilir8,18. Burada, antimikrobiyal bileşik ile tedaviden sonra bakteri kültürünün hazırlanmasının ayrıntılı bir açıklaması ve antimikrobiyal konsantrasyonun artmasına karşı belirgin duyarlılık profillerine sahip iki E. coli suşunun maruz kalması üzerine protein toplama durumunun karşılaştırılması yer alıyor. Açıklanan yöntem ucuz, hızlı ve tekrarlanabilir ve diğer proteotoksik bileşiklerin varlığında protein toplamayı incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, protokol, belirli gen silmelerinin çeşitli farklı bakterilerde protein toplama üzerindeki etkisini analiz etmek için değiştirilebilir.
Bu protokol, farklı E. coli suşlarının proteotoksik bir antimikrobiyal ile tedavisinden sonra protein agrega oluşumunun analizi için optimize edilmiş bir metodolojiyi açıklar. Protokol, tedavi edilen ve işlenmemiş E. coli hücrelerinden çözünmeyen ve çözünür protein fraksiyonlarının aynı anda çıkarılmasını sağlar. 14 , 15 , 16,20hücrelerinden protein agrega ya…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Illinois State University School of Biological Sciences başlangıç fonları, Illinois State University New Faculty Initiative Grant ve NIAID hibesi R15AI164585 (J.-U.’ya) tarafından desteklendi. D.). G.M.A., Illinois State Üniversitesi Lisans Araştırma Destek Programı (G.M.A.’ya) tarafından desteklendi. K. P. H., Alman Akademik Değişim Servisi (DAAD) tarafından sağlanan rise bursu ile desteklendi. Yazarlar, AGXX tozunu sağladıkları için Largentech Vertriebs GmbH’den Dr. Uwe Landau ve Dr. Carsten Meyer’e teşekkür ediyor. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4ve Şekil 5 Biorender ile oluşturulmuştır.
Chemicals/Reagents | |||
Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
Material/Equipment | |||
Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |