Mikro Yerçekiminde Diş ve Solunum Hücre ve Organlarının Yayılımı

Yerçekimi, bireysel hücrelerin biyolojisi ve organizmalar içindeki işlevleri de dahil olmak üzere Dünya'daki yaşamın tüm yönlerini etkiler. Hücreler mekanoreseptörler aracılığıyla yerçekimini algılar ve sitoiskelet mimarilerini yeniden yapılandırarak ve hücre bölünmesi ^1,2,3'ü değiştirerek yerçekimindeki değişikliklere yanıt verir. Mikro yerçekiminin diğer etkileri arasında sıvı dolu veziküllerdeki hidrostatik basınç, organellerin çökelmesi ve akış ve ısının yüzdürme güdümlü konveksiyonu^{4 bulunur}. Yerçekimi kaybının insan hücreleri ve organları üzerindeki etkisi üzerine yapılan çalışmalar başlangıçta uzay uçuşu görevleri sırasında astronotlar üzerindeki ağırlıksız ortamı simüle etmek için yapılmıştır⁵. Bununla birlikte, son yıllarda, NASA tarafından mikroyerçekimini simüle etmek için geliştirilen bu 3D biyoreaktör teknolojileri, aksi takdirde 2D kültür sistemlerine uygun olmayan hücre popülasyonlarının kültürü için yeni yaklaşımlar olarak giderek daha alakalı hale gelmektedir.

3D Biyoreaktörler, süspansiyondaki hücreleri büyüterek mikro yerçekimini simüle eder ve böylece sürekli bir "serbest düşüş" etkisi yaratır. Dönen biyoreaktörlerin diğer avantajları arasında organ kültürü sistemlerinde karşılaşılan havaya maruz kalma eksikliği, kayma stresi ve türbülansta azalma ve değişen besin kaynaklarına sürekli maruz kalma sayılabilir. Bir Döner Hücre Kültür Sistemi (RCCS) biyoreaktörü tarafından sağlanan bu dinamik koşullar, uzamsal birlikte lokalizasyonu ve tek hücrelerin agregalara üç boyutlu montajını^{desteklemektedir 6,7}.

Önceki çalışmalar, kemik rejenerasyonu⁸, diş mikrobu kültürü⁹ ve insan diş folikül hücrelerinin kültürü¹⁰ için döner bir biyoreaktörün avantajlarını göstermiştir. RCCS'nin EOE hücre proliferasyonunu ve ameloblastlara farklılaşmasını arttırdığını öne süren bir rapor da vardır¹¹. Bununla birlikte, farklılaşmış hücreler, uzamış morfolojileri veya polarize hücre şekilleri dikkate alınmadan, ameloblastin immünofloresansına ve / veya amelogenin ekspresyonuna dayanan ameloblastlar olarak kabul edildi¹¹ .

NASA tarafından geliştirilen döner duvar damarları (RWV) biyoreaktörüne ek olarak, hücrelerden 3D agregalar üretmek için diğer teknolojiler arasında manyetik levitasyon, rastgele konumlandırma makinesi (RPM) ve klinostat¹² bulunmaktadır. Manyetik levitasyon elde etmek için, manyetik nanopartiküllerle etiketlenmiş hücreler harici bir manyetik kuvvet kullanılarak havaya kaldırılır, bu da adiposit yapılarının biyofabrikasyonu için kullanılan iskelesiz 3D yapıların oluşumuna neden olur^13,14,15. Mikro yerçekimini simüle etmek için başka bir yaklaşım, klinostat¹⁶ adı verilen bir cihazın merkezindeki kümülatif yerçekimi vektörünün iptali ile sonuçlanan iki eksen hakkında eşzamanlı dönüşü kontrol ederek çok yönlü G kuvvetlerinin üretilmesidir. Kemik iliği kök hücreleri bir klinostatta kültürlendiğinde, osteoblast farklılaşmasının baskılanması yoluyla yeni kemik oluşumu inhibe edildi ve bu da mikrogravitenin farklılaştırıcı etkilerinden birini gösterdi¹⁶.

Ameloblastların sadık kültürünü kolaylaştırmak için in vitro sistemler, diş minesi doku mühendisliğine doğru büyük bir adım atacaktır¹⁷. Ne yazık ki, bu tarihe kadar, ameloblastların kültürü zorlu bir girişim olmuştur^18,19. Şimdiye kadar, fare ameloblast soy hücre hattı (ALC), sıçan diş epitel hücre hattı (HAT-7), fare LS8 hücre hattı²⁰, domuz PABSo-E hücre hattı 21 ve sıçan SF2-24 hücre hattı²² dahil olmak üzere beş farklı ameloblast benzeri^{hücre hattı} bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin çoğunluğu 2D kültüründe ayırt edici polarize hücre şeklini kaybetmiştir.

Bu çalışmada, mezenkimal progenitörlerle birlikte kültürlenmiş servikal döngü epitelinden ameloblast benzeri hücrelerin büyümesini kolaylaştırmak ve yerçekimine bağlı besin akışının azalması ve sitoiskelet değişiklikleri de dahil olmak üzere 2D kültür sistemlerinin zorluklarının üstesinden gelmek için bir Döner Hücre Kültürü Biyoreaktör Sistemine (RCCS) döndük. Ek olarak, RCCS, periodontal doku mühendisliği ile ilgili hücre / iskele etkileşimlerinin incelenmesi ve inflamatuar mediatörlerin akciğer alveoler dokuları üzerindeki etkilerinin in vitro olarak incelenmesi için yeni yollar sağlamıştır. Birlikte, bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, mikrogravite tabanlı döner kültür sistemlerinin farklılaşmış epitelinin yayılması ve hücre / iskele etkileşimleri ve enflamatuar koşullara doku yanıtı da dahil olmak üzere in vitro olarak yetiştirilen hücreler üzerindeki çevresel etkilerin değerlendirilmesi için faydalarını vurgulamaktadır.

Çalışmanın TAMU kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına uygun olmasını sağlamak için gerekli tüm kurumsal onay alınmıştır.

1. Biyoreaktör montajı ve sterilizasyonu

1. Plastik alet çevrimindeki bir otoklavda biyoreaktör için dört yüksek en-boy oranlı kabı (HARV), üretici tarafından önerildiği şekilde 121 ° C'de 20 dakika boyunca sterilize edin.
2. Sterilizasyondan sonra, biyoreaktörle birlikte verilen vidaları sıkarak kapları bir hücre kültürü davlumbazına monte edin ve ardından kaplar kullanıma hazır hale gelir.

2. Biyoreaktör ko-kültür deneyi için kullanılan iskeleler

1. Daha fazla büyüme için gerekli hücre bağlanmasına destek sağlamak için iskeleleri hücrelerle birlikte inkübe edin.
2. Ortak kültür çalışmaları için PGA bazlı iskeleler, hidroksiapatit iskeleleri, grafen levhalar, jelatin diskler ve kollajen bazlı iskeleler arasından seçim yapın.

3. Servikal Döngü (CL) diseksiyonu ve tek hücre hazırlığı

1. CO₂ doz aşımı ile solunum durmasını takiben dekapitasyon ile fareleri kurban edin.
   NOT: Tüm hayvan çalışmaları TAMU kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına uygundur.
2. Servikal döngüleri, daha önce yayınlanmış bir protokol^23'ün değiştirilmiş bir versiyonunu takiben 6 günlük doğum sonrası (DPN) farelerden disseke edin.
   NOT: Çalışmamızda servikal döngünün daha önce yayınlanmış protokolde gösterilmeyen distal kısmı dahil edilmiştir (Şekil 3).
   1. Disseke edilmiş dokuyu sindirimden önce soğuk steril PBS ile yıkayın, kollajenaz 37 ° C'de 30 dakika boyunca dispase ile yıkayın.
3. Çözeltiyi 70 μm steril hücre süzgecinden geçirin ve 10 dakika boyunca 800 x g'de daha fazla santrifüj yapın.
4. Süper natantı atın. Pelet santrifüjleyin ve 800 x g'da soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Süper natantı atın.
5. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve damar başına 1 X 10⁵ hücre ekleyin.

4. Diş pulpası hücre kültürü ve hücre hattı genişlemesi

1. Plaka diş pulpası hücreleri, 100 mm'lik bir doku kültürü plakasında, 4. geçitte 1 x 10⁵ konsantrasyonunda.
2. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik/antimikotik (P/S) ile desteklenmiş DMEM yüksek glukoz ortamından oluşan kültür için ortam hazırlayın.
3. Hücreler% 85-90 birleşime ulaştığında, ortamı aspire edin ve plakaları önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın.
4. PBS yıkamasından sonra, plakaya önceden ısıtılmış% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve diş pulpası hücresi içeren plakaları 37 ° C'de 3 dakika boyunca inkübe edin.
5. Mikroskop kullanarak görsel inceleme ile hücre ayrılmasını onaylayın.
6. Ortamları kültür plakasındaki hücrelerle birlikte toplayın ve 25 mL'lik bir pipetle 50 mL'lik steril konik tüpe aktarın.
7. Hücreleri 8 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücreleri taze ortamda yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak sayın.
8. Servikal döngü hücreleri ile ko-kültür için, biyoreaktördeki diş pulpası hücrelerini damar başına 1 x 10⁴ konsantrasyonda tohumlayın.

5. RCCS biyoreaktörü içindeki bir iskele üzerinde servikal döngü / diş pulpası hücrelerinin ortak kültürü

1. Hem hücre tiplerini, servikal döngüyü hem de diş pulpasını keratinosit SFM ortamını içeren kültür ortamına, takviyeli büyüme faktörleri, hücre dışı matriks proteinleri ve iskeleler ile ekleyin.
   NOT: Büyüme faktörleri 0.03 μg / mL kemik morfogenetik protein 2 (BMP 2), 0.03 μg / mL kemik morfogenetik protein 4 (BMP-4), 10 ng / mL insan rekombinant fibroblast büyüme faktörü (hFGF) ve 15 ng / mL epidermal büyüme faktörü (hEGF) konsantrasyonunda eklenirken, ECM bileşenleri 200 μg / mL Matrigel, 5 μg / mL laminin ve 5 μg / mL fibronektin içerir.
2. 1 mg LRAP (Lösin bakımından zengin amelogenin peptid) peptidi, domuz dişlerinden hazırlanan 1 mg liyofilize erken evre emaye matriksi²⁴, 5 μg/mL laminin ve 5 μg/mL fibronektin ile zenginleştirilmiş 500 μL kollajen jeli karışımına sahip kaplama iskeleleri.
   NOT: Bu, deneylerimiz için en iyi sonucu verdi.
3. İskele kaplamasını takiben, biyoreaktöre hem hücreleri hem de iskele ekleyin ve biyoreaktörü kap başına 10 mL ortam ile doldurun.
4. Ortam, hücre ve iskelelerin eklenmesinden sonra biyoreaktör kabının doldurma portu kapağını kapatın.
5. Steril valfleri deneyin başında şırınga portlarına takın ve deneyin sonuna kadar bir kapakla yerinde tutun.
6. Kap% 90 dolduğunda ve dolum portu kapakları kapatılıp sıkıldıktan sonra, steril vanaları açın.
7. Her medya değişikliği gerektiğinde iki steril şırınga (3 mL) kullanın. Bir şırıngayı taze ortamla doldurun, diğer şırınga boş bırakın.
8. Her iki şırınga valfini de açın ve kabarcıkları boş şırınga portuna doğru yavaşça manevra yapın.
9. Dolu şırıngadan taze ortam kaba dikkatlice enjekte edildikten sonra, kabarcıkları boş şırınga portundan çıkarın.
   NOT: Bu prosedür, tüm mikro kabarcıklar damarlardan çıkarılana kadar gerçekleştirilir.
10. Şırınga portlarını kapaklarla kapatın ve şırıngaları keskin bir atık kabına atın.
11. Her bir kabı rotatör tabanına takın ve rotatör tabanını %5 CO₂ ve 37 °C sıcaklığa sahip bir inkübatöre yerleştirin.
12. Gücü açın ve dönme hızını 10,1 rpm'ye ayarlayın.
    NOT: İskelelerin kap duvarına dokunmadan süspansiyonda olduğundan emin olmak için hızı ayarlayın.
13. Medya değişimi için, hücrelerin dibe çöktüğünden emin olmak için damarları dik konuma getirin. Şırınga portlarını açın ve steril şırıngaları portlara bağlayın.
14. Beslenme tükenmiş ortamın %75'ini aspire ederek ve diğer porttan taze ortam enjekte ederek aynı prosedürü uygulayın.

6. Akciğer organı hazırlığı ve biyoreaktör bazlı kültür

NOT: Akciğer organlarının hazırlanmasında E15 vahşi tip fare yavruları kullanılmıştır.

1. CO₂ boğulması ile hamile bir dişi fareyi ötenazi yaptıktan sonra akciğer dokusunu disseke edin.
   1. Servikal çıkık ile boğulmayı takiben ölüm doğrulandıktan sonra, göğüs boşluğunu açığa çıkarmak için bir neşter kullanın. Bundan sonra, yavruları uterustan çıkarın ve kafa kesme yoluyla ötenazi yapın.
2. Ötanizasyondan sonra, akciğerleri bulmak için bir neşterle açarak göğüs boşluğunu hazırlayın. Akciğer dokusunun küçük bölümlerini steril PBS ile yıkayın ve% 5 CO 2 ve 37 °C sıcaklık içeren bir inkübatörde organ kültürü ortamı ile₂ saat boyunca önceden sterilize edilmiş bir zar üzerine yerleştirin.
3. Akciğer dokuları bir 2D organ kültürü plakasındaki zara bağlandığında, numuneleri biyoreaktör kabına aktarın.
4. Medyayı kültüre hazırlayın.
   NOT: Kontrol DMEM yüksek glukoz ortamı% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 antibiyotik çözeltisi (P / S) (penisilin, 100 U / mL, streptomisin, 50 μg / mL) ve 100 μg / mL askorbik asit (AA) içerir ve enflamatuar durumların indüksiyonu için kontrol ortamı 5 ng / mL IL-6 proteini ile desteklenir.
5. Akciğer kültürü deneyini, yukarıda açıklandığı gibi biyoreaktörde her 48 saatte bir medya değişikliği ile 10 gün boyunca gerçekleştirin.

7. İnsan periodontal ligament (hPDL) hücre kültürü ile kaplanmış iskele

1. Kültür insan periodontal ligament hücreleri.
   NOT: Hücreler, daha önce yayınlanan protokole göre laboratuvarımızda izole edilir ve kültürlenir²⁵.
2. Kollajen iskele disklerini kontrol grubu için 30 μL PBS ve nöropeptit galanin (GAL) ile gece boyunca ^10-8 konsantrasyonda kaplayın.
3. Tohum insan PDL hücreleri kontrol ve GAL kaplı iskele üzerinde 2 saat boyunca 37 °C'de bir kültür plakasında ve hücre tohumlu iskeleleri yukarıda belirtildiği gibi bir biyoreaktör kabına aktarır.
4. Analiz için iskeleleri toplamadan önce biyoreaktörde 14 gün boyunca hücre tohumlu iskeleleri kültürleyin.

8. Biyoreaktör temizliği ve bakımı

1. İskeleler/hücreler biyoreaktörden toplandıktan sonra, şırınga portlarını gemiden çıkarın.
   NOT: Kapların etrafındaki vidalar çıkarılır ve kap sabunlu su ile nazikçe yıkanır.
2. Kapları temiz suyla durulayın ve vidaları bir kez daha sıkın.
3. Otoklavlamadan sonra kapları bir sonraki kullanıma kadar saklayın.

Biyoreaktörün iç odası, hücrelerin çoğalması ve farklılaşması, bir iskeleye bağlanması veya doku benzeri montajlar oluşturmak için toplanması için bir ortam sağlar. Her HARV damarı 10 mL'ye kadar ortam tutar ve her hücrenin hayatta kalmak için mükemmel bir şansa sahip olması için sürekli bir besin dolaşımını kolaylaştırır. Şekil 1A , şırınga portlarının, steril tek elden valflerin takılı olduğu kabın ön plakasına tutturulmasını göstermektedir. Bu vanalar kültür odasına kapıcı görevi görür. Orta değişim, taze ortam içeren steril bir şırınganın takılmasını kolaylaştırmak için durdurma musluğu valfinin açılmasını gerektirir. Biyoreaktör içindeki mikro yerçekimi ortamı, hücrelerin iskelelere önceden tohumlama gerektirmeden kap içindeki iskeleye yapışmasını sağlar. Biyoreaktöre yerleştirilen iskele (Şekil 1B ve 1C) sürekli olarak döner ve hücrelerin iskele yüzeylerine yapışmasına ve sitoiskelet ağları oluşturmasına izin verir. Damar plakasının altındaki oksijenatör membranı (Şekil 1B), hücre sağkalımını ve ömrünü artırmak için sürekli gaz değişimine izin verir.

Hücrelerle en uyumlu iskeleyi belirlemek için çeşitli iskeleler test edildi. Şekil 2A ve 2B'deki iskele, u grafen ve % PLG'den (polilaktik glikolit) oluşan bir grafen tabakasıdır. Bu elektriksel olarak iletken iskele, iskelet kası hücreleri gibi elektriksel stimülasyon gerektirebilecek hücreler için sıklıkla kullanılır26. Çalışmalarımızda, kollajen iskelesi, biyouyumluluk, doku büyümesinin teşviki ve hücresel farklılaşma açısından test edilen diğer tüm çalışmaları geride bırakmıştır. Bu kollajen bazlı iskelenin özel gözenekli yüzeyi (Şekil 2C ve 2D), hücrelerin ve besin maddelerinin iskele boyunca akmasına izin vererek hücre bağlanma ve hücre çoğalması alanını arttırır.

Servikal döngünün fare mandibulası ile ilişkili konumu Şekil 3A ve 3B'de gösterilmiştir. Fare kesici servikal döngü hücrelerini hazırlamak için, iskeletleştirilmiş bir fare mandibulası diseke edildi ve alt fare kesici dişinin en distal-en kısmı açığa çıkarıldı. Rezeke edilen servikal döngünün kesin konumu doğum sonrası 6 günlük fare kesici ucunda (Şekil 3B) belirtilirken, yetişkin iskeletli bir fare mandibulasındaki benzer bir bölge, oryantasyon amacıyla Şekil 3A'da referans olarak verilmiştir. İskeletize edilmiş yetişkin (Şekil 3A) ve 6 dpn taze hazırlanmış fare kesici dişindeki karşılık gelen servikal döngünün alanı iki kırık çizgi ile çerçevelenmiştir (Şekil 3A ve B). Hemi mandibulalarının dişlenmesi üç mandibuler azı dişi ve sürekli büyüyen bir kesici dişten oluşurken, servikal döngü hücre nişi, iç mine epiteli, dış mine epiteli, yıldız retikulumu ve stratum intermedium19 gibi mine oluşumunda rol oynayan karışık bir hücre popülasyonundan oluşur.

Şekil 4, servikal döngü hücrelerinin uzamış, polarize, ameloblast benzeri hücreler salgılayan emaye proteinine başarılı bir şekilde farklılaşmasına odaklanmaktadır. Veriler, ameloblast benzeri hücreler salgılayan uzun, polarize, emaye proteininin başarılı bir şekilde farklılaşmasının, servikal döngü hücrelerinin diş pulpası kök hücreleri gibi mezenkimal kök hücrelerle birlikte kültürlenmesini gerektirdiğini ortaya koymuştur. Kültürlenmiş hücrelere, protokolün 3. adımında açıklandığı gibi uyarlanmış bir mikro ortam sağlandı, bu da bir ucunda çekirdek ve diğer27'de uzun bir hücresel süreç olan polarize hücrelerin oluşumuna neden oldu, bu da ameloblastların tipik bir özelliğidir (Şekil 4A). Tek başına ve büyüme faktörleri ve/veya iskele kaplaması olmadan medyanın uygulanması, anahtar emaye proteinlerini salgılayan ancak uzamayan veya polarize olmayan servikal döngü hücreleri ile sonuçlandı (Şekil 4B).

Galanin kaplı ve kaplanmamış kollajen iskeleleri, bir biyoreaktörde on dört gün boyunca hPDL hücreli bir biyoreaktöre yerleştirildi. Hücreler 3D kültür sisteminde iki haftalık bir kültür periyodundan sağ kurtuldular ve galanin kaplı iskele grubu, kaplanmamış iskeleler içeren kontrol grubuna kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir proliferasyon oranı (Şekil 5B) gösterdi (Şekil 5A). Deney grubundaki hücreler ayrıca kontrole kıyasla bağ dokusu lifleri içeren hücre dışı matriksin önemli ölçüde daha yüksek bir seviyesini göstermiştir.

Biyoreaktör ortamı, 3D mikro yerçekimi ortamında akciğer segmentlerinin büyümesi için başarılı olduğunu kanıtladı (Şekil 6). Bu çalışma için, E15 farelerinden toplanan akciğer dokusu segmentleri (Şekil 6C), iki saat boyunca bir organ kültürü kabında bir nitroselüloz zarına yerleştirildi. Membrana ilk doku bağlanmasını takiben, akciğer dokusu / nitrosellüler membran kompoziti biyoreaktör damarına yerleştirildi ve 10 gün boyunca başarıyla kültürlendi (Şekil 6A). Enflamatuar durumların akciğer dokusu büyümesi üzerindeki etkilerini incelemek için, kültür ortamına IL-6'nın eklenmesi, in vivo görülenlere benzer şekilde alveoler morfolojide tipik inflamasyonla ilişkili değişikliklerle sonuçlanmıştır (Şekil 6B).

Şekil 1. Bir biyoreaktör kabının bileşenleri. Şekil 1, bir biyoreaktör kabının temel bileşenlerini ve bunların montaj öncesi aşamadaki konumlarını göstermektedir. (A) Reaktör odasının, şırınga portlarının ve iskelenin göreceli konumu. (B) Ön plakanın (şeffaf kapak) ve arka plakanın (oksijenatör membranı ile kaplı beyaz plaka) yarı açık pozisyonu. İskele, ön ve arka plaka arasında merkeze yerleştirilmiştir. Siyah renkli grafen iskelesi (C), bir iskelenin kabın içine nasıl yerleştirildiğini ve hücrelerin çoğalması, farklılaşması ve hücresel bir ağ oluşturması için bir destek olarak kullanıldığını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Bu çalışmada test edilen iskelelerin temsili illüstrasyonları. Biyoreaktör çalışmalarımız için beş iskele test edildi ve bunlardan iki örneği burada sunuldu. (A,B), ameloblast benzeri hücre büyümesi için test edilen grafen iskelesini temsil ederken, (C,D), biyoreaktör bazlı hücre kültürü çalışmalarımız için en başarılı kollajen iskelesini temsil eder. Kollajen iskelesinin (C,D) gözenekli yapısına ve grafen iskelesindeki (A,B) paralel yüzey kabartma dizisine dikkat edin. (A,C) dik perspektiften çekilmiş, (B,D) ise 45° açıyla görüntülenen makrograflardır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Servikal döngü hazırlığı. A'daki iskeletleştirilmiş yetişkin fare mandibulası, hücre nişini ameloblast benzeri hücre kültürü ve farklılaşması için hazırlamak için kullanılan servikal döngü bölgesini göstermektedir. Bu makrografik ayrıca, neredeyse tüm mandibuler uzunluğu kapsayan sürekli büyüyen kesici (inc), ilk mandibuler molar (m1) ile birlikte mandibulanın açısı, koronoit süreç ve mandibuler kondilin pozisyonu dahil olmak üzere anatomik belirteçlerin konumunu göstermektedir. Bu iskelet preparatı, (B)'de hazırlanan servikal döngü bölgesi için anatomik bir oryantasyon görevi görür. Referans noktaları arasında mandibuler kemik (mand), dental papilla dokusu (DP), mandibulanın açısı (Açı) ve ameloblast biyoreaktör çalışmalarımız için hücrelerin toplandığı servikal döngünün (CL) konumu bulunmaktadır. Kırık çizgi, iskeletleştirilmiş yetişkin mandibulada (A) ve 6 dpn taze diseke edilmiş mandibulada (B) servikal döngü diseksiyonu için hazırlanan federe mandibuler pencerenin anterior ve distal kısmını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. 3D ko-kültür yaklaşımı kullanılarak ameloblast benzeri hücrelerin üretilmesi. (A) Ameloblast benzeri hücrelerin, uygun bir mikro ortamda diş pulpası kök hücreleri ile birlikte kültürlenmiş servikal döngü hücrelerinden başarılı bir şekilde farklılaşması. Ortaya çıkan hücre popülasyonu, mine matriks proteinlerini salgılama yeteneğine sahip uzun, uzun, polarize hücrelerden oluşuyordu. Bu hücreler, bir ucunda bir çekirdeğe (nucl) ve diğer ucundaki gerçek ameloblastlarda (A) gözlendiği gibi Tomes Sürecine benzeyen bir hücresel sürece (proc) sahipti. (B) aynı zamanda ko-kültür koşullarına maruz kalan, ancak büyüme faktörleri veya farklılaşma ajanları içermeyen ortamlarla birlikte, tipik ameloblastları temsil etmeyen yuvarlak hücrelerle sonuçlanan bir kontrol grubu hücre popülasyonunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. Kaplamalı ve kaplamasız iskele yüzeyleri ile tek hücreli periodontal progenitör (pdl) popülasyonunun uzun süreli 3D kültürü. İskele kaplaması, galanin kaplı iskele (B) üzerinde kültürlenen hücrelerde hPDL hücre proliferasyon oranında, kaplanmamış bir iskeleye (A) maruz kalan kontrol grubu hücrelerine kıyasla bir artışa neden olmuştur. Deney grubundaki hücreler ayrıca kontrol grubuna kıyasla bağ dokusu lifleri içeren daha fazla hücre dışı matris salgıladılar (B'ye karşı A). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Bir biyoreaktörde akciğer dokusu kültürü. (A) Bir biyoreaktörde nitroselüloz membran üzerinde on gün boyunca kültürlenen E15 akciğer dokusu segmentleri. (B) E15 akciğer dokusu segmentleri (A)'ya benzer, ancak ortama IL-6 eklenerek enflamatuar koşullara maruz kalır (B). (C) H&E ile boyanmış yeni disseke edilmiş bir E15 akciğer dokusunun parafin bölümü. (A) ve (C) ile karşılaştırıldığında alveoler tip I ve tip II hücre morfolojilerindeki benzerliklere dikkat edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.