Bu protokol, mikrogravitedeki ameloblast benzeri hücrelerin kültürü ve 3D büyümesi için, uzun ve polarize şekillerini ve emayeye özgü protein ekspresyonunu korumak için bir yöntem sunar. Periodontal mühendislik yapıları kültürü ve mikro yerçekiminde akciğer organları için kültür koşulları da tanımlanmıştır.
Yerçekimi, insan hücresi fonksiyonunun, proliferasyonun, sitoiskelet mimarisinin ve oryantasyonunun temel belirleyicilerinden biridir. Döner biyoreaktör sistemleri (RCCS’ler), uzayda meydana gelen yerçekimi kaybını taklit eder ve bunun yerine kültürlenmiş hücrelerin veya dokuların sürekli rotasyonu yoluyla bir mikro yerçekimi ortamı sağlar. Bu RCCS’ler, kesintisiz bir besin kaynağı, büyüme ve transkripsiyon faktörleri ve oksijen sağlar ve hareketsiz 2D (iki boyutlu) hücre veya organ kültürü kaplarındaki yerçekimi kuvvetlerinin bazı eksikliklerini giderir. Bu çalışmada RCCS’leri servikal loop hücreleri ve dental pulpa hücrelerini ameloblast haline getirmek, periodontal progenitör/iskele etkileşimlerini karakterize etmek ve inflamasyonun akciğer alveolleri üzerindeki etkisini belirlemek için birlikte kültürlemek için kullandık. RCCS ortamları, ameloblast benzeri hücrelerin büyümesini kolaylaştırdı, iskele kaplamalarına yanıt olarak periodontal progenitör proliferasyonunu teşvik etti ve enflamatuar değişikliklerin kültürlü akciğer alveolleri üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine izin verdi. Bu makale, çevresel koşulları, materyalleri ve yol boyunca adımları özetlemekte ve kritik yönleri ve deneysel ayrıntıları vurgulamaktadır. Sonuç olarak, RCCS’ler, in vitro hücrelerin kültürüne ve 3D (üç boyutlu) büyümesine hakim olmak ve klasik 2D kültür ortamlarına uygun olmayan hücresel sistemlerin veya etkileşimlerin incelenmesine izin vermek için yenilikçi araçlardır.
Yerçekimi, bireysel hücrelerin biyolojisi ve organizmalar içindeki işlevleri de dahil olmak üzere Dünya’daki yaşamın tüm yönlerini etkiler. Hücreler mekanoreseptörler aracılığıyla yerçekimini algılar ve sitoiskelet mimarilerini yeniden yapılandırarak ve hücre bölünmesi 1,2,3’ü değiştirerek yerçekimindeki değişikliklere yanıt verir. Mikro yerçekiminin diğer etkileri arasında sıvı dolu veziküllerdeki hidrostatik basınç, organellerin çökelmesi ve akış ve ısının yüzdürme güdümlü konveksiyonu4 bulunur. Yerçekimi kaybının insan hücreleri ve organları üzerindeki etkisi üzerine yapılan çalışmalar başlangıçta uzay uçuşu görevleri sırasında astronotlar üzerindeki ağırlıksız ortamı simüle etmek için yapılmıştır5. Bununla birlikte, son yıllarda, NASA tarafından mikroyerçekimini simüle etmek için geliştirilen bu 3D biyoreaktör teknolojileri, aksi takdirde 2D kültür sistemlerine uygun olmayan hücre popülasyonlarının kültürü için yeni yaklaşımlar olarak giderek daha alakalı hale gelmektedir.
3D Biyoreaktörler, süspansiyondaki hücreleri büyüterek mikro yerçekimini simüle eder ve böylece sürekli bir “serbest düşüş” etkisi yaratır. Dönen biyoreaktörlerin diğer avantajları arasında organ kültürü sistemlerinde karşılaşılan havaya maruz kalma eksikliği, kayma stresi ve türbülansta azalma ve değişen besin kaynaklarına sürekli maruz kalma sayılabilir. Bir Döner Hücre Kültür Sistemi (RCCS) biyoreaktörü tarafından sağlanan bu dinamik koşullar, uzamsal birlikte lokalizasyonu ve tek hücrelerin agregalara üç boyutlu montajınıdesteklemektedir 6,7.
Önceki çalışmalar, kemik rejenerasyonu8, diş mikrobu kültürü9 ve insan diş folikül hücrelerinin kültürü10 için döner bir biyoreaktörün avantajlarını göstermiştir. RCCS’nin EOE hücre proliferasyonunu ve ameloblastlara farklılaşmasını arttırdığını öne süren bir rapor da vardır11. Bununla birlikte, farklılaşmış hücreler, uzamış morfolojileri veya polarize hücre şekilleri dikkate alınmadan, ameloblastin immünofloresansına ve / veya amelogenin ekspresyonuna dayanan ameloblastlar olarak kabul edildi11 .
NASA tarafından geliştirilen döner duvar damarları (RWV) biyoreaktörüne ek olarak, hücrelerden 3D agregalar üretmek için diğer teknolojiler arasında manyetik levitasyon, rastgele konumlandırma makinesi (RPM) ve klinostat12 bulunmaktadır. Manyetik levitasyon elde etmek için, manyetik nanopartiküllerle etiketlenmiş hücreler harici bir manyetik kuvvet kullanılarak havaya kaldırılır, bu da adiposit yapılarının biyofabrikasyonu için kullanılan iskelesiz 3D yapıların oluşumuna neden olur13,14,15. Mikro yerçekimini simüle etmek için başka bir yaklaşım, klinostat16 adı verilen bir cihazın merkezindeki kümülatif yerçekimi vektörünün iptali ile sonuçlanan iki eksen hakkında eşzamanlı dönüşü kontrol ederek çok yönlü G kuvvetlerinin üretilmesidir. Kemik iliği kök hücreleri bir klinostatta kültürlendiğinde, osteoblast farklılaşmasının baskılanması yoluyla yeni kemik oluşumu inhibe edildi ve bu da mikrogravitenin farklılaştırıcı etkilerinden birini gösterdi16.
Ameloblastların sadık kültürünü kolaylaştırmak için in vitro sistemler, diş minesi doku mühendisliğine doğru büyük bir adım atacaktır17. Ne yazık ki, bu tarihe kadar, ameloblastların kültürü zorlu bir girişim olmuştur18,19. Şimdiye kadar, fare ameloblast soy hücre hattı (ALC), sıçan diş epitel hücre hattı (HAT-7), fare LS8 hücre hattı20, domuz PABSo-E hücre hattı 21 ve sıçan SF2-24 hücre hattı22 dahil olmak üzere beş farklı ameloblast benzerihücre hattı bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin çoğunluğu 2D kültüründe ayırt edici polarize hücre şeklini kaybetmiştir.
Bu çalışmada, mezenkimal progenitörlerle birlikte kültürlenmiş servikal döngü epitelinden ameloblast benzeri hücrelerin büyümesini kolaylaştırmak ve yerçekimine bağlı besin akışının azalması ve sitoiskelet değişiklikleri de dahil olmak üzere 2D kültür sistemlerinin zorluklarının üstesinden gelmek için bir Döner Hücre Kültürü Biyoreaktör Sistemine (RCCS) döndük. Ek olarak, RCCS, periodontal doku mühendisliği ile ilgili hücre / iskele etkileşimlerinin incelenmesi ve inflamatuar mediatörlerin akciğer alveoler dokuları üzerindeki etkilerinin in vitro olarak incelenmesi için yeni yollar sağlamıştır. Birlikte, bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, mikrogravite tabanlı döner kültür sistemlerinin farklılaşmış epitelinin yayılması ve hücre / iskele etkileşimleri ve enflamatuar koşullara doku yanıtı da dahil olmak üzere in vitro olarak yetiştirilen hücreler üzerindeki çevresel etkilerin değerlendirilmesi için faydalarını vurgulamaktadır.
Mikrogravitedeki hücrelerin büyümesi için protokolün kritik adımları arasında biyoreaktör, iskele, 3D kültür için kullanılan hücreler ve hücre farklılaşmasını indüklemek için bir araç olarak iskele kaplaması bulunur. Çalışmalarımızda kullanılan biyoreaktör tipi, NASA tarafından simüle edilmiş mikro yerçekiminde hücreleri büyütmek için geliştirilen orijinal Döner Hücre Kültür Sistemi (RCCS) dönen silindirik doku kültürü cihazının yakın tarihli bir modifikasyonu olan RCCS-4…
The authors have nothing to disclose.
Çalışmalar, Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü’nden (UG3-DE028869 ve R01-DE027930) gelen hibelerle cömertçe desteklenmiştir.
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
Fibronectin | Corning | 354008 | |
Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
Laminin | Corning | 354259 | |
LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
Matrigel | Corning | 354234 | |
Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |