Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans’ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.
Nöronlarda, mikrotübül yönelimi, genellikle karışık oryantasyona sahip artı uçlu mikrotübüllere ve dendritlere sahip aksonları tanımlamak için önemli bir değerlendirici olmuştur. Burada, C. elegans’taki dokunmatik nöronların gelişimi ve yenilenmesi sırasında mikrotübül dinamiklerini ve büyümesini etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz. Mikrotübül uçlarının genetik olarak kodlanmış floresan muhabirlerini kullanarak aksonal mikrotübülleri görüntüledik. Aksotomi sonrasında akson rejenerasyonunu başlatan mikrotübül davranışındaki lokal değişiklikler bu protokol kullanılarak ölçülebilir. Bu test, çeşitli hücresel süreçlerde mikrotübül dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için diğer nöronlara ve genetik geçmişlere uyarlanabilir.
Nöronlar dendritler, hücre gövdeleri, aksonlar ve sinapslar gibi özel bölmelere sahip ayrıntılı bir mimariye sahiptir. Nöronal sitoskeleton mikrotübüller, mikrofilamentler ve nörofilamentlerden oluşandır ve farklı organizasyonları nöronal bölmeleri yapısal ve işlevsel olarakdestekler 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Yıllar içinde mikrotübül organizasyonu nöronal polarite ve fonksiyonun önemli bir belirleyicisi olarak tanımlanmıştır. Nöronlar gelişim veya yenilenme sırasında yapısal tadilata tabi tuttukça, mikrotübül dinamikleri ve yönelimi çeşitli nöronal bölmelerin kimliğini, polarize taşınmasını, büyümesini ve gelişimini belirler7. Bu nedenle, nöronal yeniden şekillendirme işlemi ile ilişkili olmak için mikrotübül dinamiklerini ve oryantasyonunu değerlendirmek zorunludur.
Mikrotübüller, dinamik artı uçları ve nispeten istikrarlı eksi uçları11,12olan α ve β Tubulin heterodimerlerinin protofilamentlerinden oluşur. Artı uç kompleksinin ve ilişkili uç bağlama proteinlerinin keşfi, mikrotübül organizasyonunun13. Son bağlayıcı proteinler (EBP) geçici olarak mikrotübüllerin büyüyen artı uçları ile ilişkilidir ve ilişki dinamikleri mikrotübül protofilamentlerinin büyümesi ile ilişkilidir14,15. Artı uç kompleksinin mikrotübül ile sık sık ilişkilendirilmesi ve ayrışması nedeniyle, GFP etiketli EBP’nin nokta yayma işlevi bir timelapse filmi15,16’dabir “kuyruklu yıldız” olarak görünür. Memelinöronlarında öncü gözlemden bu yana16, floresan proteinlerle etiketlenmiş son bağlayıcı proteinler, farklı model sistemleri ve nöron tipleri 17 , 18 ,19, 20 ,21,22,23arasında mikrotübül dinamiklerini belirlemek için kullanılmıştır.
Basit sinir sistemi ve şeffaf gövdesi nedeniyle, C. elegans geliştirme ve rejenerasyon sırasında nöronal remodeling çalışmak için mükemmel bir model sistemi olduğunu kanıtlamıştır vivo. Burada, C. elegans’taki dokunmatik nöronların gelişimi ve yenilenmesi sırasında mikrotübül dinamiklerini ve büyümesini etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz. Genetik olarak kodlanmış EBP-2::GFP kullanarak, PLM nöronunda mikrotübülleri görüntüledik, bu nöronun iki farklı nötroritinde mikrotübüllerin polaritesini belirlememizi sağladı24. Bu yöntem, EBP kuyruklu yıldızlarının farklı hücresel bağlamlardaki mikrotübül dinamiklerinin bir ölçüsü olarak gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin verir, örneğin aksotomi sonrası akson yenilenmesini başlatan mikrotübül davranışındaki lokal değişiklikler protokolümüz kullanılarak değerlendirilebilir. Bu test, çeşitli hücre tiplerinde ve genetik geçmişlerde çeşitli hücresel süreçlerde mikrotübül dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için uyarlanabilir.
Mikrotübül dinamiklerini anlamak, yıllar boyunca sitoskeletal araştırma alanında önemli bir odak noktası olmuştur. Mikrotübüller, sürekli dinamik dengesizlik süreci ile birlikte çekirdeklenme ve felakete uğrar44,45,46,47. Bu bilgilerin çoğu, serbest vs polimerize tübulinin ışık saçılım okumaları, floresan tübulinden mikrotübül büyüme ta…
The authors have nothing to disclose.
İlk destek ve çalışmada kullanılan suş için Yishi Jin ve Andrew Chisholm’a teşekkür ederiz. OP50 bakteriyel suş, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetics Center’dan (CGC) ticari olarak yararlanmıştır. Dharmendra Puri’ye deneysel prosedürlerin standardizasyonu için de teşekkür ederiz. Çalışma, Ulusal Beyin Araştırma Merkezi’nin temel hibesi (Biyoteknoloji Bölümü tarafından desteklenmektedir, Hindistan Govt. ), DBT/Wellcome Trust India Alliance Erken Kariyer Hibesi (Grant # IA/E/18/1/504331) S.D.’ye, Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/ I/ 13/ 1 / 500874) A.G.-R’ye ve Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu’ndan (SıRP: CRG/2019/002194) ‘a A.G.-R.
CZ18975 worm strain | Yishi Jin lab | CZ18975 | Generated by Anindya Ghosh-Roy |
Agarose | Sigma | A9539 | Mounting worms |
Coverslip (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Mounting worms |
Dry bath with heating block | Neolab | Mounting worms | |
Glass slides (35 mm x 25 mm) | Blue Star | Mounting worms | |
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) | Polysciences Inc. | 00876 | Mounting worms |
Test tubes | Mounting worms | ||
OP50 bacterial strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Worm handling |
60mm petri plates | Praveen Scientific | 20440 | Worm handling |
Aspirator/Capillary | VWR | 53432-921 | Worm handling |
Incubator | Panasonic | MIR554E | Worm handling |
Platinum wire | Worm handling | ||
Stereomicroscope with fluorescence attachment | Leica | M165FC | Worm handling |
0.3% Sodium Chloride | Sigma | 71376 | Nematode Growth Medium |
0.25% Peptone | T M Media | 1506 | Nematode Growth Medium |
10mg/mL Cholesterol | Sigma | C8667 | Nematode Growth Medium |
1mM Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | Nematode Growth Medium |
1mM Magnesium sulphate heptahydrate | Sigma | M2773 | Nematode Growth Medium |
2% Agar | T M Media | 1202 | Nematode Growth Medium |
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | Nematode Growth Medium |
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | 1X M9 buffer |
0.04M Sodium chloride | Sigma | 71376 | 1X M9 buffer |
0.1M Ammonium chloride | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 buffer |
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | 1X M9 buffer |
Glass bottles | Borosil | Buffer storage | |
488 nm laser | Zeiss | Imaging | |
5X objective | Zeiss | Imaging | |
63X objective | Zeiss | Imaging | |
Camera | Photometrics | Evolve 512 Delta | Imaging |
Computer system for Spinning Disk unit | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Imaging |
Epifluorescence microscope | Zeiss | Observer.Z1 | Imaging |
Halogen lamp | Zeiss | Imaging | |
Mercury Arc Lamp | Zeiss | Imaging | |
Spinning Disk Unit | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
ZEN2 software | Zeiss | Imaging | |
Image J (Fiji Version) | Image analysis and processing | ||
Adobe Creative Cloud | Adobe | Image analysis and processing | |
Computer system for Image Analysis | Dell | Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz | Image processing/Representation |