Özet

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

Published: July 01, 2021
doi:

Özet

Burada, akciğerin yüksek çözünürlüklü, intravital görüntülemesini sağlayan murine toraks için kalıcı olarak indwelling optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz. Pencerenin kalıcılığı, akciğerdeki dinamik hücresel süreçlerin, özellikle de yayılan tümör hücrelerinin metastatik ilerlemesi gibi yavaş gelişen süreçlerin incelenmesine çok uygun hale getirir.

Abstract

Kansere bağlı mortalitenin ~%90’ını oluşturan metastaz, kanser hücrelerinin primer tümörlerden kemik, beyin ve akciğer gibi ikincil bölgelere sistemik yayılmasını içerir. Kapsamlı bir şekilde çalışılsa da, bu sürecin mekanistik ayrıntıları yenememiştir. Bilgisayarlı tomografi (BT), pozitron emisyon tomografisi (PET) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) dahil olmak üzere yaygın görüntüleme yöntemleri farklı derecelerde brüt görselleştirme sunarken, her biri bireysel tümör hücrelerinin dinamiklerini tespit etmek için gerekli zamansal ve mekansal çözünürlükte değildir. Bunu gidermek için, yaygın metastatik bölgelerin intravital görüntülemesi için çok sayıda teknik tanımlanmıştır. Bu sitelerden akciğer, inceliği ve yaşamı sürdürmedeki kritik rolü nedeniyle intravital görüntülemeye erişimin özellikle zor olduğunu kanıtlamıştır. Sağlam akciğerin tek hücreli intravital görüntülemesi için daha önce çeşitli yaklaşımlar tanımlanmış olsa da, hepsi son derece invaziv ve terminal prosedürler içerir ve mümkün olan maksimum görüntüleme süresini 6-12 saat ile sınırlar. Burada açıklanan, Akciğerin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi için minimal invaziv torasik optik Pencerenin (WHRIL) kalıcı implantasyonu için geliştirilmiş bir tekniktir. Mikrokartografiye uyarlanmış bir yaklaşımla birlikte, yenilikçi optik pencere, çoklu görüntüleme seanslarında tek hücreli çözünürlükte ve birden fazla haftaya yayılan sağlam akciğerin seri intravital görüntülemesini kolaylaştırır. Görüntüleme verilerinin toplanabileceği eşi görülmemiş süre göz önüne alındığında, WHRIL metastatik ilerlemenin altında kalan dinamik mekanizmaların ve akciğer içindeki çok sayıda ek biyolojik işlemin hızlandırılmış keşfini kolaylaştırabilir.

Introduction

Ölümlerin ~%90’ından sorumlu olan metastaz, kansere bağlı mortalitenin başlıca nedenidir1. Klinik olarak gözlenen metastazın (kemik, karaciğer, akciğer, beyin) başlıca bölgeleri arasında2, akciğerin intravital mikroskopi ile in vivo görüntüleme için özellikle zor olduğu kanıtlanmıştır. Bunun nedeni, akciğerin sürekli hareket halinde hassas bir organ olmasıdır. Akciğerlerin intratorasik kardiyak hareketle daha da birleşen sürekli hareketi, doğru görüntüleme için önemli bir bariyeri temsil eder. Bu nedenle, yüksek çözünürlüklü intravital optik görüntüleme için yöntemlere görece erişilemeyenliği nedeniyle, akciğer içindeki kanser büyümesi genellikle bir okült süreç olarak kabul edilmiştir3.

Klinik ortamda, bilgisayarlı tomografi (BT), pozitron emisyon tomografisi (PET) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi görüntüleme teknolojileri akciğer4gibi sağlam hayati organların derinliklerinde görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler brüt organın mükemmel görüşlerini sağlarken (genellikle klinik semptomların başlangıcından önce patolojiyi ortaya çıkarır), metastazın erken aşamalarında ilerledikçe bireysel yayılan tümör hücrelerini tespit etmek için yetersiz çözünürlüktedirler. Sonuç olarak, yukarıda belirtilen yöntemler akciğere herhangi bir metastaz belirtisi sağladığında, metastatik odaklar zaten iyi kurulmuş ve çoğalmaktadır. Tümör mikroçevrasyonu kanser ilerlemesi ve metastaz oluşumunda önemli bir rol oynadığından5,6, metastatik tohumlamanın en erken adımlarını araştırmaya büyük ilgi vardır. Bu ilgi, kanser hücrelerinin primer tümör tespit etmeden önce bile yaydığı artan takdirve makro metastaz9’abüyümeden önce yıllarca tek hücreli ve uykuda bir durumda hayatta kaldıklarına dair artan kanıtlarla daha da besleniyor.

Daha önce, akciğerin tek hücreli çözünürlükte görüntülenmesi mutlaka ex vivo veya explant preparatlarını içeriyordu10,11,12,13, analizleri tek zaman noktalarıyla sınırlandırmak. Bu preparatlar yararlı bilgiler sağlarken, sağlam bir dolaşım sistemine bağlı organ içindeki tümör hücrelerinin dinamikleri hakkında herhangi bir fikir sağlamaz.

Görüntülemedeki son teknolojik gelişmeler, 12 saat14,15,16‘ya kadar olan dönemlerde sağlam akciğerin tek hücreli çözünürlükte intravital görselleştirilmesini sağlamıştır. Bu, mekanik havalandırma, göğüs kafesinin rezeksiyonu ve vakum destekli akciğer hareketsizleştirmeyi içeren bir protokol kullanılarak bir murine modelinde gerçekleştirildi. Bununla birlikte, fizyolojik olarak bozulmamış akciğerin ilk tek hücre çözünürlüklü görüntülerini sunmasına rağmen, teknik son derece invaziv ve terminaldir, böylece indeks prosedürünün ötesinde daha fazla görüntüleme seansı önler. Bu nedenle, bu sınırlama, uyku hali ve büyümenin yeniden başlatılması gibi 12 saatten uzun süren metastatik adımların incelenmesine uygulanmasını engeller14,15,16. Ayrıca, vakum kaynaklı basınç farklarının kan akışında sapmalara neden olabileceği göz önüne alındığında, bu görüntüleme yaklaşımı kullanılarak gözlenen hücresel davranış kalıpları dikkatlice yorumlanmalıdır.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, mekanik ventilasyona gerek kalmadan, uzun bir süre boyunca haftalarca seri görüntülemeyi kolaylaştıran, Akciğerin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülemesi (WHRIL) için minimal invaziv bir Pencere geliştirilmiştir17. Teknik, normal akciğer fonksiyonunun korunması için kapalı bir torasik boşluğa sahip bir ‘şeffaf göğüs kafesi’ oluşturulmasını gerektirir. Prosedür iyi tolere edilir, farenin temel etkinlik ve işlevde anlamlı bir değişiklik yapmadan iyileşmesine izin verilir. İlgili her görüntüleme seansında tam olarak aynı akciğer bölgesini güvenilir bir şekilde lokalize etmek için, bu pencereye mikrokartografi olarak bilinen bir teknik uygulanmıştır18. Bu pencereden, akciğerin damar yatağına ulaşan, endotelleri geçen, hücre bölünmesi geçiren ve mikro metastazlara dönüşen hücrelerin görüntülerini yakalamak mümkündü.

Burada, çalışma WHRIL implantasyonu için geliştirilmiş bir cerrahi protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunar, bu da ameliyatı basitleştirirken aynı zamanda tekrarlanabilirliğini ve kalitesini artırır. Bu protokol metastazın altında kalan dinamik süreçlerin araştırılmasını sağlamak için tasarlanmış olsa da, teknik alternatif olarak akciğer biyolojisi ve patolojisinin çok sayıdaki süreçlerinin araştırılmasına uygulanabilir.

Protocol

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, Albert Einstein Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından önceden onaylandığı da dahil olmak üzere omurgalı hayvanların kullanımına ilişkin yönergelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçek gerçekleştirildi. 1. Pencerelerin pasivasyonu Optik pencere çerçevelerini(Ek Şekil 2)%1 (w/v) enzimatik olarak aktif deterjan çözeltisi ile durulayın. Bir cam kavanozun içind…

Representative Results

Bu protokolde açıklanan cerrahi prosedürün adımları Şekil 1’deözetlenmiş ve gösterilmiştir. Kısaca, ameliyattan önce fareler uyuşturulur ve sol toraksın üzerindeki saçlar çıkarılır. Fareler, torasik boşluğun ihlali üzerine hayatta kalmayı sağlamak için entübe edilir ve mekanik olarak havalandırılır. Kaburgaları aşırı saran yumuşak doku eksilir ve6 ve7. kaburgaları kapsayan küçük bir dairesel kusur oluşturulur. Optik pencere çer…

Discussion

Akciğer gibi uzak metastaz bölgelerinde, yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme tümör hücre metastazının ayrıntılı dinamikleri hakkında fikir sağlar. Tek kanser hücrelerinin in vivo görselleştirilmesini ve konak doku ile etkileşimlerini sağlayarak, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme metastazın altında kalan mekanizmaları anlamak için etkili olmuştur.

Burada, yüksek çözünürlüklü çoktoğraflı mikroskopi ile murine akciğerin seri…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklendi: CA216248, CA013330, Montefiore’den Ruth L. Kirschstein T32 Eğitim HibeSI CA200561, METAvivor Erken Kariyer Ödülü, Gruss-Lipper Biyofotoğraf Merkezi ve Entegre Görüntüleme Programı ve Jane A. ve Myles P. Dempsey. Görüntüleme desteği için Einstein Tıp Fakültesi Analitik Görüntüleme Tesisi’ne (AIF) teşekkür ederiz.

Materials

1% (w/v) solution of enzyme-active detergent Alconox Inc N/A  concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres Invitrogen F8827
5 mm coverslip Electron Microscopy Sciences 72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
5% Isoflurane Henry Schein, Inc 29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle Ethicon, Inc. 774B
7% (w/v) solution of citric acid Sigma-Aldrich 251275
8 mm stainless steel window frame N/A N/A Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie Ethicon, Inc. LA55G
5 mm disposable biopsy punch Integra  33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors Roboz RS-5980
Buprenorphine Hospira 0409-2012-32
Cautery pen Braintree Scientific GEM 5917
Chlorhexidine gluconate  Becton, Dickinson and Company 260100 ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister Falcon DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive Henkel Adhesives LOC1363589
Fiber-optic illuminator O.C. White Company FL3000
Bead sterilizer CellPoint Scientific GER 5287-120V Germinator 500
Graefe forceps Roboz RS-5135
Infrared heat lamp Braintree Scientific HL-1
Insulin syringes Becton Dickinson 329424
Isoflurane vaporizer SurgiVet VCT302
Jacobson needle holder with lock Kalson Surgical T1-140
Long cotton tip applicators Medline Industries MDS202055
Nair Church & Dwight Co., Inc. 40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin Johnson & Johnson 501373005 Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment Dechra Veterinary Products 17033-211-38
Paper tape Fisher Scientific S68702
Murine ventilator Kent Scientific PS-02 PhysioSuite
Rectangular Cover Glass Corning 2980-225
Rodent intubation stand Braintree Scientific RIS 100
Small animal lung inflation bulb Harvard Apparatus 72-9083
Stainless steel cutting tool N/A N/A Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic Hi-Tech Pharmacal Co. 50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming Kent Scientific SURGI-M02 Heated surgical platform
Tracheal catheter Exelint International 26746 22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe Ted Pella, Inc. 528-112

Referanslar

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
  3. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
  5. DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Kanser Araştırmaları. 77 (5), 1051-1059 (2017).
  6. Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
  7. Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
  8. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
  9. Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
  10. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
  11. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  12. Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
  13. Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
  14. Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
  15. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
  16. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  17. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  18. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  19. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
  20. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
  21. Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  22. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  23. Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
  24. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  25. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  26. Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
  27. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  28. Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
  29. Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
  30. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  31. Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
  32. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
  33. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
  34. Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
  35. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  38. Travis, W. D. Classification of lung cancer. Seminars in Roentgenology. 46 (3), 178-186 (2011).
  39. Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
  40. Braman, S. S., Whitcomb, M. E. Endobronchial metastasis. Archives of Internal Medicine. 135 (4), 543-547 (1975).
  41. Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D. Lung metastases. European Radiology. 6 (5), 596-606 (1996).
  42. Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
  43. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
  44. Sharma, V. P. ImageJ plugin HyperStackReg V5.6. Zenodo. , (2018).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J. Vis. Exp. (173), e62761, doi:10.3791/62761 (2021).

View Video