Özet

Echinococcus granulosus'un Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu

Published: September 16, 2022
doi:

Özet

Üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus’un farklı gelişim evrelerinde hızlı geçici transdüksiyon tekniğini tanımladık.

Abstract

Kistik ekinokokkozis veya hidatik hastalık, köpeklerin bağırsağında bulunan küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus’un neden olduğu en önemli zoonotik paraziter hastalıklardan biridir. Patogenezin ve hastalık kontrol ve korunma mekanizmalarının anlaşılması için uygulanan genetik araştırmalara acil ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasını engellemektedir. Bu çalışma, E. granulosus’un metacestod ve strobile formlarında lentiviral gen geçici transdüksiyonunun potansiyelini göstermektedir. Protoskoleces (PSC’ler) hidatik kistlerden izole edildi ve strobile solucanlara dönüşmek üzere spesifik bifazik kültür ortamına aktarıldı. Solucanlar, bir transdüksiyon süreci kontrolü olarak HEK293T hücreleri ile birlikte hasat edilmiş üçüncü nesil lentivirüs ile transfekte edildi. Strobillenmiş solucanlarda 24 saat ve 48 saat boyunca belirgin bir floresan tespit edildi ve bu da E. granulosus’ta geçici lentiviral transdüksiyonu gösterdi. Bu çalışma, tenyalarda lentivirüs bazlı geçici transdüksiyona yönelik ilk girişimi sunmakta ve yassı solucan biyolojisi üzerine yapılan deneysel çalışmalarda potansiyel etkileri olan umut verici sonuçları göstermektedir.

Introduction

Kistik ekinokokkozis (CE), Taeniidae 1,2 familyasında küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus’un neden olduğu en önemli helmint hastalıklarından biridir. E. granulosus için immünodiagnostik ve aşı geliştirme konusunda kapsamlı çalışmalar yapılmıştır. Ancak parazit biyolojisinin moleküler temeli hakkında yetersiz bilgi sahibi olmak, hidatik hastalığının tanı, yönetim ve önlenmesinde önemli sınırlamalar getirmektedir 3,4,5,6.

Son yıllarda, genom dizilimi ve transkriptomik yöntemlerin gelişmesi nedeniyle, çeşitli araştırma grupları 7,8,9 tarafından yassı solucanlar üzerinde çok çeşitli moleküler çalışmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, parazitler dünyasında, parazitik yassı solucanlarda gen transfer teknolojisindeki ilerlemeler, bazı protozoalar10,11,12 için geliştirilen yüksek oranda tekrarlanabilir geçici transdüksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında hala sınırlıdır.

Viral dağıtım sistemlerinin kullanımı, son yirmi yılda transgen dağıtımı ve gen / protein araştırmaları için gerekli bir araç olarak ortaya çıkmıştır13. Lentivirus hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte eder, böylece postmitotik hücreleri enfekte etmeyi mümkün kılar14,15,16. Son kanıtlar, memeli hücrelerinde lentivirüs tabanlı bir transdüksiyon sistemi kullanmanın, önceki knock-in / knock-down tekniklerinin sınırlamalarının çoğunun üstesinden gelme potansiyeli sunduğunu göstermektedir. GFP ekspresyonu gibi uygun moleküler belirteçlere sahip ekspresyon lentiviral vektörlerinin tasarımı ve yapımı daha önce16 olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, E. granulosus’un protoskolekslerinde ve strobilated solucanlarında GFP muhabir geninin lentiviral geçici transdüksiyonunu değerlendiriyoruz.

Protocol

Bu çalışma, Ulusal Tıbbi Araştırma Geliştirme Enstitüsü ve Araştırma Etiği İnceleme Komitesi, No. 958680 tarafından onaylanmıştır. Lentivirüsler BSL-2 organizmaları olarak sınıflandırılır; Bu nedenle, bu protokoldeki tüm laboratuvar kültürü prosedürleri steril laboratuvar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilmiş ve NIH kılavuzlarına göre laminer bir akış başlığı altında yürütülmüştür. Şekil 1 , farklı E. granulosus aşamaları i…

Representative Results

Burada, E. granulosus’ta üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak hızlı ve etkili bir geçici transdüksiyon tekniği tanımlanmıştır. PSC’leri, daha önce25,26’da tanımlandığı gibi, strobillenmiş solucanlar elde etmek için bifazik bir kültür ortamında kültürledik. Protoscoleces in vitro 6 hafta sonra strobilated solucanlar haline gelir. Bifazik kültür ortamında, invaginasyonlu PSC’ler (Şekil 2A), evajine PSC’ler …

Discussion

Nematodların moleküler temelini ve Platyhelminthes biyolojisini anlamak, zoonotik parazitlerin patojenitesini anlamak için çok önemlidir27. Etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri12,27 de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasının önünde büyük bir engeldir. Bu çalışma, E. granulosus geçici transdüksiyonunda lentivirüsün m?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Tahran, İran’daki Ulusal Tıbbi Araştırma Geliştirme Enstitüsü’nden (NIMAD) 958680 ödül numarası altında Elit Araştırmacı Hibe Komitesi tarafından desteklenmiştir.

Materials

12-well culture plates SPL Life Sciences 30012
25 cm2 culture flask SPL Life Sciences 70325
6-well culture plates SPL Life Sciences 30006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C4901-500G Working concentration: 2.5 mM
CMRL 1066 medium Thermo Fisher Scientific 11530037
CO2 incubator memmert ICO150
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
DMEM Life Technology 12100046
Dog bile Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter
Eosin Y Sigma-Aldrich E4009-5G prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test
Fetal Bovine Serum (FBS) DNAbiotech DB9723-100ml Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C)
Fetal Bovine Serum (FCS) DNAbiotech DB9724-100ml Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C)
HEK293T cells BONbiotech BN_0012.1.14 Human embryonic kidney 293T
HEPES buffered saline (HBS) Sigma-Aldrich 51558-50ML 2x concentrate
Inverted fluorescence microscope OLYMPUS IX51
Penicillin Sigma-Aldrich P3032-10MU Working concentration: 100 IU/mL
Pepsin Roche 10108057001 Working concentration: 2 mg/mL, pH 2
Phosphate-buffered saline (PBS) DNAbiotech DB0011 This reagent solve in less than 1 min in D.W
Polybrene (Transfection reagent) Sigma-Aldrich TR-1003-G
RPMI medium BioIdea BI-1006-05
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761-1KG
Streptomycin Sigma-Aldrich S9137-25G Working concentration: 100 μg/mL
Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) SBI System Biosciences (BioCat GmbH) CD513B-1-SBI Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) Invitrogen (Life Technologies) K4975-00 Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) Addgene Plasmid 12259 Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA Buffer (TE) DNAbiotech DB9713-100ml
Trypsin Sigma-Aldrich T9935-50MG 1x working solutions (pH 7.4–7.6)

Referanslar

  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
  3. Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
  4. Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
  5. Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55 (2016).
  6. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
  7. Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
  8. Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
  9. Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
  10. Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
  11. Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
  12. Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161 (2015).
  13. Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
  14. Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230 (2011).
  15. Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
  16. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
  17. Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
  18. Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
  19. Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
  20. Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
  21. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
  22. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499 (2009).
  23. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
  24. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
  25. Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
  26. Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  27. Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
  28. Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
  29. Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
  30. Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
  31. Thompson, R. C. A., Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. 95, 65-109 (2017).
  32. Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
  33. Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Mohammadi, M. A., Afgar, A., Faridi, A., Mousavi, S. M., Derakhshani, A., Borhani, M., Fasihi Harandi, M. Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus. J. Vis. Exp. (187), e62783, doi:10.3791/62783 (2022).

View Video