Özet

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

Published: August 27, 2021
doi:

Özet

Burada, melanositler için optimize edilmiş bir doğrudan yeniden programlama sistemi ve sorunsuz doğrudan yeniden programlama sağlayan yüksek verimli, konsantre bir virüs paketleme sistemi açıklanmaktadır.

Abstract

Melanositlerin fonksiyon kaybı, etkilenen bireylerin fiziksel ve zihinsel sağlığını ciddi şekilde etkileyen vitiligoya yol açar. Halen, vitiligo için etkili bir uzun süreli tedavi yoktur. Bu nedenle, vitiligo için uygun ve etkili bir tedavi geliştirmek zorunludur. Cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için rejeneratif tıp teknolojisi, vitiligo’nun umut verici yeni bir tedavisi gibi görünmektedir. Bu, vitiligolu hastalarda melanosit kaybını iyileştirmeye yardımcı olmak için hastanın cilt hücrelerinin fonksiyonel melanositlere doğrudan yeniden programlanmasını içerir. Bununla birlikte, bu yöntemin önce fareler üzerinde test edilmesi gerekir. Doğrudan yeniden programlama yaygın olarak kullanılmasına rağmen, melanositlere doğrudan yeniden programlama için net bir protokol yoktur. Dahası, mevcut transkripsiyon faktörlerinin sayısı çok fazladır.

Burada, cilt hücrelerini melanositlere yeniden programlamak için seçilen transkripsiyon faktörlerini üretmek için Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 ve Snai2 dahil olmak üzere konsantre bir lentivirüs paketleme sistemi protokolü sunulmaktadır. Fare embriyonik fibroblastları (MEF’ler), MEF’lerin in vitro olarak indüklenmiş melanositlere (iMel’ler) doğrudan yeniden programlanması için tüm bu transkripsiyon faktörleri için konsantre lentivirüs ile enfekte olmuştur. Ayrıca, bu transkripsiyon faktörleri tarandı ve sistem melanositlere doğrudan yeniden programlama için optimize edildi. iMel’lerde melaninin karakteristik belirteçlerinin gen veya protein seviyesinde ekspresyonu önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar, fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanmasının vitiligo için başarılı bir yeni terapötik strateji olabileceğini ve fibroblastların in vivo melanositlere doğrudan yeniden programlanması için temel oluşturacak melanosit gelişim mekanizmasını doğrulayabileceğini düşündürmektedir.

Introduction

Vitiligo, etkilenen bireylerin fiziksel ve zihinsel sağlığını ciddi şekilde etkileyen bir cilt hastalığıdır. Metabolik anormallikler, oksidatif stres, inflamatuar mediatörlerin oluşumu, hücre dekolmanı ve otoimmün yanıt gibi çeşitli nedenlerden dolayı, fonksiyonel melanositler kaybolur ve melanin salgılanması durdurulur ve vitiligo 1,2’nin gelişmesine yol açar. Bu durum yaygın olarak görülür ve özellikle yüzünde sorunludur. Ana tedavi kortikosteroidlerin ve immünomodülatörlerin sistemik kullanımıdır. Fototerapi sistemik veya lokal hastalıklarda kullanılabilmekte olup, delikli deri nakli ve otolog melanosit transplantasyonu gibi cerrahi tedaviler vardır 3,4,5. Bununla birlikte, ilaç tedavisi ve fototerapi kullanan hastalar nüksetmeye eğilimlidir ve bu tedavilerin uzun vadeli terapötik etkileri zayıftır. Cerrahi tedavi travmatiktir ve sadece orta derecede etkilidir 2,6. Bu nedenle vitiligo için yeni ve etkili bir tedavi stratejisine ihtiyaç vardır.

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC’ler) yeniden programlanması, bu hücreleri terminal durumlarından pluripotent bir duruma çevirir, bu da transkripsiyon faktörleri, Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc7 tarafından aracılık edilen bir süreçtir. Bununla birlikte, tümörojenisite olasılığı ve uzun üretim süresi nedeniyle, bu teknoloji klinik ortamlara uygulandığında şüphecilikle karşılanmıştır8. Doğrudan yeniden programlama, bir terminal hücresi türünün başka bir terminal hücresi türüne dönüşmesini sağlayan bir teknolojidir9. Bu işlem uygun transkripsiyon faktörleri ile elde edilir. Kardiyomiyositler10, nöronlar 11 ve koklear saç hücreleri12 dahil olmak üzere çeşitli hücreler doğrudan başarıyla yeniden programlanmıştır. Bazı araştırmacılar, cilt dokusunu doğrudan in situ olarak yeniden programlamışlardır, bu da yara onarımı için kullanılabilir13. Doğrudan yeniden programlamanın avantajları arasında daha az bekleme süresi ve maliyeti, daha düşük kanser riski, daha az etik sorun ve hücre kaderinin belirlenmesinin altında yatan mekanizmanın daha iyi anlaşılmasıyer almaktadır 9.

Doğrudan yeniden programlama yöntemi yaygın olarak kullanılmasına rağmen, özellikle14,15 olarak kabul edilecek çok sayıda transkripsiyon faktörü nedeniyle, cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için şu anda kesin bir yöntem yoktur. Transkripsiyon faktörleri, Mitf, Sox10 ve Pax3, cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için kullanılmıştır14. Buna karşılık, MITF, PAX3, SOX2 ve SOX9’un kombinasyonu, başka bir çalışmada cilt hücrelerinin insan melanositlerine doğrudan yeniden programlanması için de kullanılmıştır15. Bu protokolde, farklı bir tarama yönteminin kullanılmasına rağmen, daha önce tarif edildiği gibi cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için Mitf, Sox10 ve Pax3 kombinasyonu ile aynı sonuç elde edilmiştir14. Diğer cilt hücrelerinden melanosit üretmek için bir sistem geliştirmek, vitiligo hastalarının diğer cilt hücrelerini melanositlere dönüştürmek için bir şema sağlayabilir. Bu nedenle, melanositleri başarılı bir şekilde üretmek için bu doğrudan yeniden programlama için basit ve etkili bir yöntem oluşturmak çok önemlidir.

Protocol

Bu çalışma, Jiangsu Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Yönetimi ve Kullanım Komitesi (UJS-IACUC-AP–20190305010) tarafından onaylanmıştır. Deneyler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC International) tarafından belirlenen standartlara sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir. İnsanları içeren hiçbir deney yoktu, bu yüzden bu çalışmanın insan araştırma etik komitesinden onay alması gerekmiyordu. Reaktifler hakkında ayrı…

Representative Results

Bu makalede, fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanması için transkripsiyon faktörlerinin lentivirüsünü üretmek için konsantre bir lentivirüs paketleme sisteminin protokolleri ve transkripsiyon faktörlerinin taranması ve melanositlerin MEF’lerden doğrudan yeniden programlanması için protokoller bulunmaktadır. Konsantre lentivirüs üretiminin başarısı, GFP’nin floresan yoğunluğunu gözlemleyerek (Şekil 1A) veya HEK-293T h?…

Discussion

Virüsün kalitesi, bu protokolde melanositlere doğrudan yeniden programlamanın başarısı için çok önemlidir. Bu protokoldeki virüsleri paketleme ve yoğunlaştırma yöntemi basit ve tekrarlanması kolaydır ve başka herhangi bir yardımcı konsantre reaktife dayanmaz. Bu protokol çoğu laboratuvarda başarıyla takip edilebilir. Konsantre virüsün kalitesini sağlamak için, aşağıdaki noktalara özel dikkat gösterilmesi gerekir. Birincisi, HEK-293T’nin hücre durumudur. HEK-293T hücreleri ölümsüzleş…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82070638 ve 81770621) ve Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (BK20180281) tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-062 Stored at -20 °C
0.45 μM filter Millipore SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube Falcon 352052
95%/100% ethanol LANBAO 210106 Stored at RT
Adenine Sigma A2786 Stock concentration 40 mg/mL
Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a Invitrogen A21137 Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep) Gibco 15140-122 Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody Millipore MABC592 Host/Isotype: Mouse IgG2a
Species reactivity: Mouse/Human
Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody Abcam ab74073 Host/Isotype: Rabbit IgG
Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Stock concentration 10 mM
Final concentration 3 μM
Cholera toxin Sigma C8052 Stock concentration 0.3 mg/mL
Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 111-165-144 Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose) HyClone SH30243.01 Stored at 4 °C
DMSO  Sigma D2650 Stored at RT
FBS Gibco 10270-106 Stored at -20 °C
Heat-inactivated before use
Gelatin Sigma G9391 Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) Hanheng Biological Technology Co., Ltd. pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 Stored at -20 °C
Hematoxylin Abcam ab220365 Stored at RT
Human EDN3 American-Peptide 88-5-10A Stock concentration 100 μM
Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone Sigma H0888 Stock concentration 100 µg/mL
Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA Sigma D9628 Stored at RT
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit Solarbio G2032 Stored at 4 °C
Neutral balsam Solarbio G8590 Stored at 4 °C
Paraformaldehyde Sigma P6148 Stored at RT
PBS (-) Gibco C10010500BT Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) Sigma P8139 Stock concentration 1 mM
Final concentration 200 nM
Polybrene Sigma H9268 cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL
Final concentration 4 ng/µL
Puromycin Gibco A11138-03 Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF Invitrogen 13256-029 Stock concentration 4 μg/mL
Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin Sigma  I3536 Stock concentration 10 mg/mL
Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF R&D 255-SC-010 Stock concentration 200 μg/mL
Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640 Gibco 11875-093 Stored at 4 °C
Xylene Sigma 1330-20-7 Stored at RT

Referanslar

  1. Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
  2. Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).
  3. Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
  4. Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
  5. Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
  6. Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
  7. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
  8. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  9. Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
  12. Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
  13. Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
  14. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
  15. Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
  16. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
  17. Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
  18. Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
  19. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Zhang, Y., Liu, L., Jin, M., Sun, H., Zhang, H., Li, Y. Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes. J. Vis. Exp. (174), e62911, doi:10.3791/62911 (2021).

View Video