Özet

Temporal lob epilepsisi için bir model oluşturmak üzere elektriksel olarak çırılan VGAT-Cre fareleri için elektrotların hazırlanması ve implantasyonu

Published: August 17, 2021
doi:

Özet

Bu yazıda, transgenik VGAT-Cre farelerinin elektriksel çıralarına dayanan temporal lob epilepsi modeli oluşturma yöntemleri açıklanmaktadır. Kindled VGAT-Cre fareleri, epilepsiye neyin neden olduğunu belirlemede ve yeni tedavileri taramada yararlı olabilir.

Abstract

VGAT-Cre farelerinin elektriksel çıralarının spontan motor ve elektrografik nöbetlere yol açtığı keşfedildi. Yakın tarihli bir makale, benzersiz VGAT-Cre farelerinin çıralamadan sonra spontan tekrarlayan nöbetler (SRS) geliştirmede nasıl kullanıldığına ve olası bir mekanizmanın – Cre’nin VGAT genine yerleştirilmesi – ekspresyonunu bozdu ve GABAerjik tonu azalttı. Bu çalışma, bu gözlemleri daha büyük bir fare kohortuna genişleterek, SRS’nin çıralamadan sonra ne kadar süre devam ettiği ve hayvanın cinsiyetinin ve yaşının etkisi gibi kilit konulara odaklanmaktadır. Bu raporda aşağıdaki önemli adımlar için protokoller açıklanmaktadır: elektriksel stimülasyon ve elektroensefalogramı okumak için hipokampal derinlik elektrotlarına sahip kulaklıklar yapmak; kulaklığı farenin kafatasına güvenli bir şekilde yapıştırmak için ameliyat, böylece düşmez; ve darbenin süresi, trenin sıklığı, trenin süresi ve enjekte edilen akım miktarı gibi elektrik çıra protokolünün önemli ayrıntıları. Çıra protokolü, çoğu VGAT-Cre faresinde güvenilir bir şekilde epilepsiye yol açması ve yeni antiepileptojenik ilaçları test etmek için yeni bir model sağlaması bakımından sağlamdır.

Introduction

Epilepsi, önemli ekonomik ve beşeri yükleri olan majör bir nörolojik hastalıktır. NINDS, epilepsili 3 milyon Amerikalı olduğunu tahmin ediyor. Bu hastaların yaklaşık 0,6 milyonunda temporal lob epilepsisi (TLE) vardır1. Ne yazık ki, TLE’nin tıbbi tedavisi hastaların üçte birinde etkisizlik, ilaç direnci gelişimi veya yan etkilere karşı toleranssızlık nedeniyle başarısız olmaktadır2. Açıkçası, Amerikan Epilepsi Derneği Temel Bilim Komitesi, Preklinik Epilepsi İlaç Keşfi için Uluslararası Epilepsiye Karşı Birlik Çalışma Grubu ve Ulusal Danışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme Konseyi 3,4 tarafından paylaşılan bir sonuç olan TLE için yeni tedaviler geliştirmeye önemli bir ihtiyaç vardır.

Temporal lob epilepsisinin mevcut hayvan modelleri, uzun süreli status epileptikusu indüklemek için kemokonvülzanlar (örneğin, kainat, pilokarpin) veya uzun süreli elektriksel stimülasyon kullanır 5,6,7. İşlem sırasında birçok hayvan ölür (sıçanlarda% 10-30, farelerde% 90’a kadar8). Hayatta kalan ve epilepsi geliştiren hayvanlar, beyin boyunca yaygın nöronal ölüm gösterir 9,10. Bu ölüm, mikroglia, astrositler ve sızan monositlerin aktivasyonu ile başlayan bir dizi yanıtı tetikler. Nöronal yanıtlar arasında devre reorganizasyonu (örneğin, yosunlu lif filizlenmesi), devrelere düzgün bir şekilde entegre olamayan yeni nöronların doğumu (örneğin, ektopik granül hücreleri) ve hipereksitabiliteye yol açan içsel değişiklikler (örneğin, Na + kanallarının yukarı regülasyonu) bulunur. Önemli nöronal ölümü olmayan bir epilepsi modeli, yeni antiepileptik ilaçların araştırılmasını kolaylaştıracaktır.

Epilepsinin GABA hipotezini test ederken, VGAT-Cre farelerinin hafif bir elektriksel çıra protokolü ile tedavi edilmesinin spontan motor ve elektrografik nöbetlere yol açtığı keşfedilmiştir11. Genel olarak, kemirgenlerin elektriksel çıralanması, epilepsiyi tanımlayan spontan nöbetlere yol açmaz, ancak aşırı çıra11 vakalarında olabilir. VGAT-Cre fareleri, özellikle GABAerjik inhibitör nöronlarda eksprese edilen veziküler GABA taşıyıcı (VGAT) geninin kontrolü altında Cre rekombinazını eksprese eder. Cre yerleştirilmesinin mRNA ve protein seviyelerinde VGAT ekspresyonunu bozduğu, böylece hipokampusta GABAerjik sinaptik iletimi bozduğu bulundu. Yakılmış VGAT-Cre farelerinin epileptogenezde rol oynayan mekanizmaları incelemek ve yeni terapötikleri taramak için yararlı olabileceği sonucuna varılmıştır11. Bu rapor, modelin oluşturulmasında kullanılan yöntemleri ayrıntılı olarak sağlar.

Protocol

Hayvan kullanımı ARRIVE12 yönergelerini izledi ve Virginia Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. 1. İki bipolar elektrotlu kulaklıklar yapmak (Şekil 1) Şekil 1: EEG kulaklık üretiminde temel adımlar. (<…

Representative Results

HayvanModel başlangıçta karışık bir arka plan üzerinde VGAT-Cre fareleri (Slc32a1tm2 (cre)Lowl / J)13 kullanılarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, C57BL / 6J ile konjenik olan VGAT-Cre suşuna da uygulanmıştır. Suşlar arasında gelişen epilepside fark gözlenmemiştir. Her iki suş da veziküler GABA taşıyıcı promotörünün kontrolü altında Cre rekombinazını eksprese eder. Bu fareler, Vgat genindeki durdurma kodonundan sonra bir …

Discussion

Bu raporda, farelerin elektriksel çıralarının epilepsiye yol açtığı bir protokol açıklanmaktadır. Uyarıcı elektrot hipokampusa yerleştirildiğinden, bu hastalarda temporal lob epilepsisini (TLE) modelleyen fokal limbik bir epilepsidir. Bu protokoldeki kritik bir adım, Vgat genine bir IRES-Cre rekombinaz kasetinin yerleştirilmesi nedeniyle, bozulmuş inhibitör GABA akımları11’i gösteren VGAT-Cre farelerini kullanmaktır. C57BL / 6, bu protokolle tutuşturulduktan sonra …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu protokol hakkındaki yararlı tartışmalar için John Williamson’a teşekkür eder. Bu çalışma NIH / NINDS hibesi NS112549 tarafından desteklenmiştir.

Materials

16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) AD Instruments AM3500-115-60 Alternate EEG amplifier
363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE P1 Technologies 363SLEEVPIN0NL For electrode holder
Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM P1 Technologies 363363XXXXCM004 mouse-to-commutator cable
CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED Sony QC-SP316
Commutator SL6C/SB (single brush) P1 Technologies 8BSL6CSBC0MT formerly Plastics One, Inc.
Current amplifier A-M Systems Model 2100
Dental cement Stoelting 51459
Drill bits, #75, OD  0.310" LOC 130 PT Kyocera 105-0210.310
E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED P1 Technologies 8IE3630XXXXE pins for connector
iBond Self Etch glue Kulzer CE0197
MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE P1 Technologies 8K000229801F EEG headset connector
Ohmeter Simpson 260 High sensitivity
PowerLab 16/35 and LabChart Pro AD Instruments PL3516/P Alternate EEG software
SomnoSuite Kent Scientific Corp. SS-01 anesthesia unit & RightTemp monitoring
Stereotactic drill and micromotor kit Foredom Electric Co. K.1070
Stereotactic frame David Kopf Instruments Model 940
Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' A-M Systems 791400
VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background The Jackson Laboratory 000664

Referanslar

  1. Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
  2. Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
  3. Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
  4. Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
  5. Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
  6. Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
  7. Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  8. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
  9. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  10. Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
  11. Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
  12. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
  13. Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
  14. Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
  15. Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by ‘continuous’ hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
  16. Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
  17. Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
  18. Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
  19. Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Straub, J., Vitko, I., Gaykema, R. P., Perez-Reyes, E. Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy. J. Vis. Exp. (174), e62929, doi:10.3791/62929 (2021).

View Video