İnsan Nazal Epitel Organoidlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Tekniğe giriş
Ex vivo kültür temelli tahliller, hassas tıp ve hastalık patofizyolojisinin incelenmesi için giderek daha fazla kullanılan bir araçtır. Primer insan nazal epitel (HNE) hücre kültürü, kistik fibroz 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ile ilgili çok sayıda çalışmada kullanılmıştır. , birden fazla organda epitel hücre fonksiyonunu etkileyen otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. HNE kültürü, prospektif olarak elde edilebilen yenilenebilir bir hava yolu epitelisi kaynağı sağlar ve Kistik Fibroz Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) aktivitesini test etmek için elektrofizyolojik ve biyokimyasal nitelikleri özetler. HNE hücreleri, yaygın viral solunum yolu çubuklarına benzer şekilde minimal yan etki¹⁴ ile örneklenebilir. HNE fırça biyopsilerinden türetilen kistik fibroz çalışması için bir model tanımlayan araştırma çalışması yakın zamanda yayınlanmıştır^11,13. Primer HNE ^2,3 ve bağırsak dokusu ^{15,16,17,18,19} kullanan diğer modellere benzer olmakla birlikte, bu modelin farklılaşmasının ve görüntülenmesinin ayrıntılı karakterizasyonu^, KF araştırmalarında kullanılmak ve diğer hava yolu hastalıklarının çalışmalarına yardımcı olmak için burada açıklanmıştır ¹³ . Organoid model, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları gibi sınırsız değildir, ancak koşullu yeniden programlama (ışınlanmış ve inaktive edilmiş besleyici fibroblastlar ve Rho-kinaz inhibitörleri kullanılarak) ile daha kök hücre benzeri bir duruma^{genişletilebilir 20,21,22,23}. HNE fırça biyopsilerinin bu yöntem kullanılarak işlenmesi, birden fazla uygulamada kullanılmak üzere çok sayıda epitel hücresinin daha yüksek verimde olmasını sağlarken, yine de tam olarak ayırt etme yeteneğini korur. Bu protokol besleyici hücreler kullanılarak geliştirilmiş olsa da, besleyici hücre teknolojisinden kaçınmak isteyen araştırmacılar tarafından başka metodolojiler de kullanılabilir^14,24.

Tekniğin pulmoner biyolojideki önemi
Epitel hücrelerinin hücre zarında düzenli, işleyen CFTR'nin yokluğunun akciğerlerde, pankreasta, karaciğerde, bağırsakta veya diğer dokularda nasıl işlev bozukluğuna neden olduğunu anlamak için önemli bir çalışma yapılmıştır. Disfonksiyonel epitel iyon transportu, özellikle klorür ve bikarbonat, epitel astar sıvılarının hacminin azalmasına ve mukoza sekresyonlarında değişikliklere neden olarak mukoza stazı ve tıkanıklığına neden olur. Primer siliyer diskinezi gibi diğer hava yolu hastalıklarında, değişmiş siliyer hareket mukosiliyer klirensi bozar ve mukoza stazı ve obstrüksiyona yol açar²⁵. Bu nedenle, mevcut HNE organoid modeli, araştırmacının deneysel tasarımına ve kaynaklarına bağlı olarak çeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir. Bu, canlı hücre boyaları kullanarak canlı hücre görüntülemeyi içerir; morfolojiyi karakterize etmek için sabitleme ve bölümleme; intraluminal yapıların bozulmasını önlemek için antikorlarla immünofloresan boyama ve tam montajlı konfokal görüntüleme; siliyer atım sıklığı ve mukosiliyer transportun kantitatif ölçümleri için parlak alan görüntüleme ve mikro-optik koherens tomografi¹³. Diğer araştırmacılara genişlemeyi kolaylaştırmak için, ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve malzemeler kültürleme için kullanılmıştır. Ortak mikroskop teknikleri ve daha özel ekipman kullanan fonksiyonel bir tahlil geliştirilmiştir. Genel olarak, mevcut model CFTR aktivitesini başlangıçta veya terapötiklere yanıt olarak değerlendirmek için tasarlanmış olsa da, bu protokolde açıklanan teknikler epitel hücre fonksiyonunu içeren diğer hastalıklara, özellikle epitel hücre sıvısı taşınımına uygulanabilir.

Diğer metodolojilerle karşılaştırma
Son zamanlarda bu organoid modelin yararlılığı, hastaların organoidlerinin in vitro CFTR modülatör yanıtlarını klinik yanıtlarıyla ilişkilendirerek geliştirilmiştir¹¹. Özellikle, mevcut modelin aynı hastalarda CFTR fonksiyonunu değerlendirmek için mevcut altın standart olan kısa devre akım tepkilerine paralel olduğu da gösterilmiştir. Kısa devre akımı, şişme tahlilinden farklıdır, çünkü birincisi, iyon taşıma²⁶ yoluyla CFTR fonksiyonunu ölçer. Buna karşılık, bu tahlil sıvı taşınması ile daha aşağı yönlü bir etkiyi ölçer ve CFTR^{27,28,29,30,31,32'nin} genel işlevi hakkında ek bilgi sağlar. Kısa devre akım ölçümleri, CFTR klorür kanal aktivitesini belirlemek için yaygın ve güvenilir bir yöntem olmaya devam etmiştir ^1,33. Bu elektrofizyolojik analizler özel, pahalı ekipman gerektirir, her deneysel kopya için organoid testten çok daha fazla hücre gerektirir, kolayca otomatikleştirilemez ve daha yüksek verim uygulamaları için ölçeklendirmeye uygun değildir. Bağırsak epitelinden türetilen başka bir organoid model, daha mükemmel replikatif yetenek gibi ek avantajlara sahiptir 15,16,17,18^, ancak ne bir hava yolu dokusundan türetilir ne de evrensel olarak mevcuttur. HNE fırçalamaları, ucuz sitoloji fırçaları ile sedasyona gerek kalmadan ve minimum risk altında elde edilir. Fırçalama yaptırmak bir klinisyen gerektirmez ve eğitimli araştırma koordinatörleri ve diğer araştırma personeli tarafından yapılabilir¹⁴. HNE organoid modeli, primer hücre kültürü yeteneklerine sahip herhangi bir laboratuvar tarafından kültürlenebilir ve bazı uygulamalar standart mikroskopi teknikleri ile gerçekleştirilebilir. Toplamda, bu avantajlar, aksi takdirde bazı laboratuvarlarda kullanılamayan hava yolu epitel fonksiyonunu değerlendirmek için teknolojiye ek erişim sağlar. Ayrıca, HNE organoidleri, bağırsak organoidlerinin yapamayacağı primer siliyer diskinezi²⁵ veya viral enfeksiyon gibi hava yolunu etkileyen diğer hastalık durumlarını incelemek için kullanılabilir.

HNE örnekleri Alabama Çocuk Hastanesi'nde toplandı. Burada açıklanan tüm prosedürler ve yöntemler Birmingham'daki IRB Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (UAB IRB #151030001). İnsan burun epitel hücrelerinin (HNE) genişlemesini kolaylaştırmak ve işlevini iyileştirmek için, mevcut kültürleme yöntemleri, iyi bilinen hava-sıvı arayüzü (ALI) kültür yöntemi ^28,34'ten uyarlanmıştır. HNE'ler başlangıçta daha önce tarif edildiği gibi fırça biyopsisi ile toplandı^12,14, tek fark bir sitoloji fırçasının kullanılmasıydı. Tüm numune işleme adımları ve hücre kültürü biyogüvenlik kabininde gerçekleştirildi.

1. Hücre kültürü ve nazal epitel hücrelerinin genişlemesi

1. Fırçaladıktan sonra, burun biyopsisi örneğini buz üzerinde 15 mL'lik bir konik tüpte 8 mL RPMI ortamında saklayın ve 4 saat içinde (en fazla 24 saat) laboratuvara aktarın.
2. Burun fırçası biyopsisini, sitoloji fırçasını 1 mL büyük delikli pipet ucundan (ucu kesin) fırça dokudan temizlenene kadar birkaç kez geçirerek 15 mL'lik bir konik tüp içinde 8 mL RPMI ortamına ayırın.
3. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin, süpernatanı çıkarın ve ardından hücre peletini 3 mL hücre ayrılma çözeltisi içinde yeniden askıya alın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve sindirmek için 16 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
4. Hücreleri iki kez yıkamak için 5 mL genleşme ortamı kullanın (Tablo 1). Daha sonra, hücreleri birlikte kültürlemek ve 7-14 gün boyunca genleşme ortamında genişlemek için ışınlanmış ve inaktive edilmiş 3T3 fibroblastları²² (% 50 -% 60 birleşim) ile önceden tohumlanmış bir T75 şişesine hücreler ekleyin (uygun koloni için Şekil 1'e bakınız). Kullanmadan önce, ışınlanmış 3T3 fibroblastları, epitel hücresi genişlemesini olumsuz yönde etkileyecek şekilde çoğalmadıklarından emin olmak için test edin.
   NOT: Nazal epitel hücre birleşimi 14 gün içinde% 70'e ulaşmazsa hücreleri atın.
5. KF'li hastalardan türetilen hücreler için, kültürün ilk 3 günü boyunca hücrelerin dezenfeksiyonu için genleşme ortamına dört antibiyotik (100 μg / mL tobramisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B, 100 μg / mL seftazidim, 100 μg / mL vankomisin, bakınız Malzeme Tablosu) uygulayın ve daha sonra medyayı her 2 günde bir değiştiren antibiyotiksiz genleşme ortamı ile değiştirin.
   NOT: Bu sınırlı antibiyotik kullanımı, bakteriyel kolonizasyona bağlı kültür kaybını azaltmayı ve ek antibiyotikler çıkarıldıktan sonra proliferasyonu teşvik etmeyi amaçlamaktadır. Bu antibiyotikler, gerekirse hassasiyetlerle hastanın spesifik mikrobiyoloji sonuçlarına göre uyarlanabilir.
6. Hücreler yaklaşık% 80 birleşime ulaştığında çift tripsinizasyon yöntemi^22'yi kullanarak ortak kültürden HNE'leri toplayın. Bu yöntem, ışınlanmış ve inaktive edilmiş 3T3 fibroblastlarının şişeden çıkarılmasını ve sonraki organoid tohumlamayı kirletmemelerini sağlar.
   1. Hücreleri 1x DPBS ile yıkayın ve daha sonra ışınlanmış ve inaktive edilmiş 3T3 fibroblastını kültürden çıkarmak için 37 ° C'de 4 dakika boyunca T75 şişesine 1.5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin.
   2. Kalan 3T3 fibroblastlarını iyice yıkamak için T75 şişesini 1x DPBS ile iki kez durulayın; HNE'leri ayırmak için T75 şişesine 37 °C'de 10 dakika boyunca 1,5 mL% 0,05 tripsin-EDTA ekleyin.
   3. Tripsini soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile nötralize edin (bakınız Malzeme Tablosu) 1: 1 oranında. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatanı çıkarın. Hücreleri 5 mL genleşme ortamı ile bir kez yıkadıktan sonra, hücreler organoidleri büyütmek için tohumlamaya hazırdır.
      NOT: Pasaj numarası üç olan HNE'lerin daha sonraki deneyler için kullanılması önerilir.

2. Slaytlarda ve kültür eklerinde organoidlerin büyümesi ve farklılaşması

1. Organoid kültür hücre dışı matrisini (ECM) gece boyunca 4 ° C'de çözün. Pipet uçlarını 4 °C'ye kadar soğutun ve 4 °C'de gece boyunca 15 delikli anjiyogenez slaytları (bkz.
   NOT: ECM, hücre hasadının yapılması gerekmeden önceki gece 4 ° C'ye konulmalıdır.
2. Kızakları buz üzerinde 5 μL soğuk% 100 ECM ile kaplayın (15 delikli kızağın her bir kuyucuğuna soğuk pipet ucu ile 5 μL soğuk% 100 ECM) ve ardından konsolidasyon için en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
3. Bir hemositometre kullanarak ko-kültürden toplanan HNE'leri sayın ve hücreleri, buz üzerinde farklılaşma ortamı (Tablo 2) ile seyreltilmiş% 20 ECM ile toplam 500 hücre / μL'ye seyreltin. Daha sonra, soğuk hücre / ECM karışımının 5 μL'sini ECM ile kaplanmış slaytların her bir kuyucuğuna tohumlayın.
4. Hücre/ECM karışımını konsolide etmek için slaytları derhal 37 °C'de 1 saat boyunca bir kültür inkübatörüne aktarın.
5. 15 kuyucuklu anjiyogenez slaytlarının her bir kuyucuğundaki hücreleri 50 μL farklılaşma ortamı ile besleyin. Organoidler daha fazla deney için hazır olana kadar medyayı her gün değiştirin.
   NOT: Organoidler genellikle 1-2 gün sonra görselleştirilebilir. Slaytların her bir kuyucuğunda yaygın olarak oluşan 20-90 organoid vardır. Organoidler tipik olarak ECM'de 40-60 gün boyunca hayatta kalabilir ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde tutulduğunda her gün beslenir.
6. Kültürdeki organoidler, aşağıda belirtilen adımlara göre, belirli uygulamalar için (histoloji veya immünofloresan için bölümleme gibi) daha fazla miktarda ( bkz. Malzeme Tablosu) ekler.
   1. Kültür eklerinde organoidleri büyütmek için, organoid kültür ECM'sini, pipet uçlarını ve kesici uçları adım 2.1-2.2'de belirtildiği gibi hazırlayın. Kesici uçları 100 μL soğuk% 100 ECM ile kaplayın.
   2. Kesici uçtaki ECM kaplamanın üzerine 60 μL hücre/ECM karışımı (farklılaşma ortamında %20 ECM ile 500 hücre/μL) tohum.
      NOT: Kesici uçlarda organoid yapmak için diğer tüm adımlar, slaytlarda uygulananlarla aynıdır, adım 2.4-2.5.
   3. Kesici ucun alt kısmına 600 μL farklılaştırma ortamı ekleyin. Organoidler deneyler için kullanılana kadar, tipik olarak 2-3 hafta boyunca medyayı her alternatif günde bir değiştirin.

3. Tam montajlı immünofloresan için organoidlerin hazırlanması ve izolasyonu

1. Organoidlerin izolasyonu ve sabitlenmesi
   1. 8 delikli cam tabanlı hazne kızaklarına hücre yapıştırıcısı ile ön işlem yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız) Referans^{35'i takip eden 30 dakika boyunca}. Çözeltiyi attıktan sonra, kuyucukları 30 dakika boyunca havayla kurulayın.
   2. Organoidleri hasat etmek için, ortamı ECM'nin üstünden çıkarın ve ardından buz üzerindeki 15 delikli slaytların her bir kuyucuğuna 50 μL soğuk 1x PBS ekleyin (ECM hacmi ile 1: 1).
   3. Büyük delikli pipet ucunun 200 μL'sini kullanarak pipeti 3-5 kez yukarı ve aşağı doğru çevirin ve ardından çözeltiyi 8 delikli hazneli kızakların bir kuyusunun ortasına dağıtın.
   4. İnce uçlu bir pipetle fazla sıvıyı derhal kuyucuklardan çıkarın. Ardından, cam tabana yapışan organoidi arttırmak için hazneyi 40 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
   5. 1x PBS ile iki kez nazikçe yıkadıktan sonra, organoidleri oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca her bir oyuğa 300 μL% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
   6. 1x PBS ile iki kez yıkayın ve organoidleri 2 haftaya kadar immün boyama için 4 ° C'de 1x PBS'de saklayın.
2. İmmünofloresan boyama
   1. Otomatik floresansı azaltmak için, RT'deki slaytların her bir kuyucuğuna 1x PBS'de 250 μL'lik 50 mM NH₄Cl'yi 30 dakika boyunca ekleyin ve 20 rpm'de bir çalkalayıcıda hafifçe sallayın.
   2. 1x PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, RT'de 30 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ile hücreleri geçirgen hale getirirken, 20 rpm'de hafifçe sallayın.
   3. 1x PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, RT'de 1 saat boyunca her bir oyuğa %5 BSA ve 1x PBS'de %0,1 Triton X-100 dahil olmak üzere 300 μL blokaj çözeltisi ekleyin.
   4. Yıkamayı takiben, uygun kuyucuklara birincil antikor ve ardından ikincil antikorlar ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu). 1x PBS'de% 2 BSA ve% 0.3 Triton X-100'de birincil ve ikincil antikor çözeltileri hazırlayın. Tüm birincil antikorları 2 gün boyunca 4 ° C'de ve tüm ikincil antikorları 1 gün boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Son konsantrasyonlar, deney için istenen proteine bağlıdır. Lütfen üreticinin veri sayfasındaki stok konsantrasyonunu kontrol edin. Ardından, Malzeme Tablosunda kullanılan seyreltmelere dayanarak nihai konsantrasyonları hesaplayın.
   5. Kuluçkadan sonra, kuyucukları 1x PBS ile iyice yıkayın ve nükleer boyama için her bir kuyucuğa% 2 BSA ve% 0.3 Triton X-100'de DAPI ekleyin.
   6. Organoidleri konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak, 20-60x yağ daldırma hedefi ile görüntüleyin ( bkz. Görüntünün üst ve alt sınırlarını ayarlamak için Z-yığını modunu kullanın ve konfokal yazılım tarafından belirlenen önerilen optimum Z-adım boyutunu kullanın.
      NOT: Aşağıdaki dört konfokal lazer uyarma dalga boyu kullanılmıştır: 408.7 nm, 489.1 nm, 561.7 nm ve 637.9 nm.

4. Histolojik kesitleme için organoidlerin hazırlanması ve izolasyonu

1. Histolojik çalışmalar için organoidleri toplamak için, medyayı kültürden çıkarın ve buz üzerindeki slaytların her bir kuyucuğuna 50 μL soğuk 1x PBS ekleyin.
2. 200 μL büyük delikli pipet ucu kullanarak üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipet, 15 delikli sürgü veya kültür uçlarındaki tüm çözeltileri buz üzerinde 15 mL'lik konik bir tüpte birleştirin. Ek soğuk 1x PBS ekleyerek tüpteki toplam çözelti hacmini 10 mL'ye ayarlayın.
3. Tüpü 4 ° C'de, 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın; Süpernatantı aspire edin ve 200 μL'lik büyük delikli pipet ucu kullanarak organoid pelet ile karıştırmak için 60 μL sıcak histojel ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
4. Süspansiyonu hemen bir histoloji kalıbına aktarın. Histojelin oda sıcaklığında konsolidasyonundan sonra, kalıp bloğunu 4 ° C'de gece boyunca sabitlemek için% 4 paraformaldehit içine koyun.
5. Parafine gömüldükten sonra, histojel bloğunu 5 μm enine kesitlere (örneğin bir mikrotomla) kesin, bölümleri cam slaytlara sabitleyin ve hematoksilin ve eozin (H & E) veya immünofloresan etiketli antikorlar kullanarak lekeleyin. Parlak alan mikroskobu veya ters epi-floresan mikroskobu kullanarak görüntü çekin (bkz.

5. Canlı organoidlerin görüntülenmesi

NOT: Aşağıdaki adımlar otomatik bir görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Farklı görüntüleme sistemlerinin, kendi üreticilerinin talimatlarını izleyerek bu adımları uyarlamaları gerekir. Kullanılan ekipmandan bağımsız olarak, canlı organoidlerin görüntülenmesi, eşlik eden bir CO₂ gaz kontrolörü ile sıcaklık kontrollü ve nemlendirilmiş bir çevre odası gerektirir.

1. İşlevsel bir şişme testi³⁶ gerçekleştirmeden önce organoidlerin farklılaşmasını izlemek için, tüm slayt görüntülerini aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi herhangi bir parlak alan mikroskobu veya otomatik bir görüntüleme sistemi ile manuel olarak yakalayın.
   1. Otomatik görüntüleme sistemine ve CO_2/O2 gaz kontrolörüne giden gücü açın ve sistemin otomatik kalibrasyonu tamamlamasına izin verin (~30 dakika).
   2. Tamamlandıktan sonra, görüntüleme sistemi sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın; nemlendirme haznesine 15 mL steril su ekleyin, CO₂ valflerini açın, kapakları kapatın ve görüntüleme sisteminin görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca ön inkübe etmesine izin verin.
   3. Görüntüleme için bir protokol ayarlamak üzere otomatik görüntüleme yazılımını açın ve ham deneysel verilerin kaydedileceği konumu seçin.
      NOT: Görüntüleme sistemine özgü örnek bir protokol dosyası (Ek Dosya 1), organoid farklılaşmasını izlemek için organoidlerin otomatik görüntülenmesi için bir şablon olarak sağlanmıştır.
   4. Çevresel ayarlar yerine getirildikten sonra, kapaklı iki adede kadar 15 delikli kızağı, otomatik görüntü sisteminin slayt tutucu ekindeki çevre odasına derhal aktarın (bkz.
   5. Görüntülenecek kuyuları seçin ve istenen kuyucukların görüntülenmesini tamamlamak için görüntülemeye başlayın.
      NOT: Önerilen temel ayarlar şunlardır: 4x ve 10x hava hedefi, parlak alan kanalı, tüm kuyu alanını kapsayacak şekilde 4x objektif için 2 x 2 montaj, 10x objektif için 4 x 4 montaj. Z-yığını ayarları: üç ila altı Z-yığını dilimi, Z-adım boyutu = 50-100 μm, otomatik netleme noktasının altında bir ila iki dilim ve yukarıda üç ila beş dilim.
2. Forskolin kaynaklı şişlik (FIS) testinde kullanılmak üzere canlı organoidleri görüntülemek için, sıcaklık ve CO₂ kontrolüne izin veren çevre kontrollü bir görüntüleme odası ile donatılmış otomatik bir aşamaya sahip bir mikroskop kullanın.
   1. Adım 5.1.1-5.1.4 ile başlayın, adım 5.1.3'teki protokol dosyasını, FIS testi gerçekleştirmek için özel ayarları içeren örnek protokol dosyasında (Ek Dosya 2) sağlanan dosyayla değiştirin.
   2. Her denemeden önce, her slayt için en az üç kuyu (en sol, orta ve en sağ) değerlendirerek pozlama ayarlarını yapın. Hedefin tüm kuyular için kuyunun merkezinde olmasını sağlamak için X ve Y koordinat ofsetlerini uygulayın.
      NOT: Önerilen temel ayarlar şunlardır: 4x hava hedefi, Kanal 1 = Parlak Alan, Kanal 2 = DAPI, 2 x 2 montaj (dört görüntü döşemesi). Z-yığını ayarları: üç ila dört Z-yığını dilimi, Z-adım boyutu = 50-100 μm, otomatik netleme noktasının bir dilim altında ve yukarıda iki ila üç dilim. Görüntü alma süresi: 20 dakikalık aralıklarla 8 saat (Toplam okuma sayısı = 25; Okuma 1, T = 0'dır).
   3. Tüm ayarlar uygun şekilde seçildikten sonra, her iki slayt için de görüntülenecek kuyucukları seçin veya tümünü seçin ve ekipmanın talimatlarına göre çalıştırmaya başlayın.
   4. Çalıştırdıktan sonra denemeyi kaydedin, görüntüleme yazılımını kapatın ve görüntüleme sistemini kapatın³⁷.

6. Temel lümen ölçümleri

NOT: Bu, manuel görüntüleme analiz yazılımı kullanılarak yapılır (bkz. Benzer bir metodoloji, açık kaynaklı bir yazılım³⁸ veya bir görüntü üzerindeki bir bölgenin alanını ölçebilen herhangi bir yazılım kullanılarak takip edilebilir.

1. Yazılımda, ekranın alt kısmına sağ tıklayarak Otomatik Ölçüm Panelini açın, Ölçüm'ü ve ardından Otomatik Ölçüm Sonuçları'nı seçin. Ölçülen her ilgi alanının (ROI) alanı burada görünecektir.
2. Yazılımda organoid görüntüyü açın ve görünür lümenli 5-10 organoid seçin.
   NOT: Lümen, organoidin ortasında, organoidin geri kalanından gözle görülür şekilde farklı renkte dairesel bir alan olacaktır (Şekil 2A).
3. Poligon YG ölçüm özelliğini kullanarak, menüyü açmak için resme sağ tıklayın ve organoidin toplam yüzey alanını (TSA) elde etmek üzere tam organoidi özetlemek için Poligonal YG'yi seçin. Ardından aynı özelliği kullanarak, lümen alanını (LA) ana hatlarıyla belirtin (Şekil 2B).
4. Kuyuda kalan organoidler ve tahlildeki tüm kuyucuklar için tekrarlayın.
5. Verileri excel'e aktarın. LA'yı TSA'ya bölün ve Temel Lümen Oranı (BLR) ^11,13'ü elde etmek için numunedeki tüm organoidlerin ortalamasını alın.
   NOT: Tipik olarak, CF olmayan organoidlerin ~% 87'si 0.6'nın üzerinde bir BL'ye sahip olacak ve% 97'si 0.5'in üzerinde olacakken, CF organoidlerinin sadece% 14'ü 0.6'nın üzerinde bir BBR'ye sahip olacak ve% 31'i 0.5'in üzerinde olacaktır.

7. HNE organoidlerinin ön tedavisi ve otomatik görüntülenmesi

NOT: Tüm ön işlem adımları temiz bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Otomatik görüntüleme sistemini ve adım 7.1'den önce tahlili kaydetmek için yazılımı önceden ayarlayın. DAPI ile inkübasyon isteğe bağlıdır, ancak parlak alan görüntülerinin kalitesi tehlikeye girerse arıza emniyetli olarak önerilir. Bu durumda, bunun yerine DAPI kanalı (377 nm) analiz edilebilir.

1. Organoidleri, 100 μM CFTRinh-172 içeren veya içermeyen DAPI içeren 50 μL farklılaşma ortamı içeren 15 kuyucuklu bir kuyucukta 15 kuyucuklu bir kuyucukta 1 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde önceden inkübe edin. Organoidler inkübe ederken, Ek Dosya 2'yi takip eden bir şişme testi özel protokolü kullanarak adım 5.2.1'i gerçekleştirin.
2. Ön inkübasyon ortamını, aspirasyonlu bir cam Pasteur pipet kullanarak çıkarın. Her bir kuyucuğa toplam 50 μL farklılaşma ortamı hacmi için 10 μM forskolin ve 100 μM IBMX (stimülasyon kokteylleri) ekleyin (bkz.
   NOT: Kuyucuklara kabarcık girmediğinden emin olun. Görüntülerdeki kabarcıklar otomatik analizi etkiler.
3. Gecikmeden, 5.2.2 ila 5.2.4 arasındaki adımları izleyerek FIS görüntüleme protokolünü başlatın. Her kuyu boşluğunda her 20 dakikada bir, toplam çalışma süresi 8 saat olan görüntüler elde edin.

8. HNE organoidleri üzerinde forskolin kaynaklı şişlik testinin otomatik analizi

1. Otomatik görüntüleme analizi yazılımını açın, daha önce adım 7.3'ten kaydedilen denemeyi bulun ve denemenin görüntülerini getirin.
2. Değerlendirilecek kap penceresini seçin ve dikilmiş ve z-yansıtılan işlenmiş görüntüleri içeren seçeneği belirleyin. Bu adım, maskeleme değerlendirmesi ve ölçümleri için görüntüleme çerçevesindeki tüm organoidlerle birlikte tüm kuyunun bir resmini sağlamalıdır.
3. Değerlendirilecek kuyu görüntüsünü seçin. Analiz Et'i seçin. Otomatik ölçümlere dahil edilen tüm görüntüler için uygun maskelemeyi sağlamak üzere diğer görüntüler için bu işlemi tekrarlayın. Ayar parametrelerini kaydedin.
4. Analiz ayarlarını tamamladıktan sonra değişiklikleri uygulayın. Yazılım, ayarlara göre ölçümleri değiştirecektir.
   NOT: İlk görüntü ön işleme tamamlandıktan sonra, tutarlı maskeleme sağlamak için kalite kontrol (QC) önlemleri alınmalıdır. Bunlar, organoidlerin görüntüleme çerçevesi içinde olduğundan, kabarcıkların veya döküntülerin uygunsuz şekilde maskelenmediğinden emin olmak için tüm kuyucukların manuel olarak gözden geçirilmesini ve maskelemenin parlak alan ve DAPI kanallarında kontrol edilmesini içerir.
5. Özet analiz için verileri dışa aktarın (grafik ve istatistiksel analiz dahil).

HNE'lerin genişlemesi, gelişen bir organoid kültür için gereklidir. Başarılı bir numune koleksiyonundan elde edilen HNE'ler, 10 gün içinde p'in üzerinde bir birleşime kadar genişlemelidir. Başarılı ve başarısız örneklere bir örnek sırasıyla Şekil 1A ve Şekil 1B'de gösterilmiştir. Hücreler, ışınlanmış 3T3 hücrelerle ko-kültürden 14 gün sonra% 70 birleşmeye ulaşamazlarsa atılmalıdır. Kirlenmiş herhangi bir hücre, ek antimikrobiyal ajanlarla hızlı bir şekilde kurtarılamazsa derhal atılmalıdır.

Organoidlerin büyümesi 15 delikli slaytlarda ve kültür eklerinde karşılaştırıldı. Kültür ekleri, optik olarak optimize edilmiş slaytlardan daha kalın ve hedeften daha uzaktır, bu da görüntüyü ve çözünürlüğü etkiler. Buna rağmen, Şekil 2'de gösterildiği gibi, bu iki kültür yönteminde morfolojide anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi KF olmayan ve KF organoidleri arasında morfolojik farklılıklar görülebilir. CF olmayan organoidler, içinde daha fazla sıvı içeren daha büyük bir lümene sahip olma eğilimindedir. Buna karşılık, CF organoidleri genellikle daha az sıvı içeren daha küçük bir lümene sahiptir ve bazen mukus ve döküntü ile doldurulur. Lümen boyutu manuel olarak ölçüldü (Şekil 3B) ve taban çizgisi lümen oranı hesaplanarak Şekil 3C'de gösterildi. Kesitli organoidler H&E ve immünofloresan boyama kullanılarak karakterize edildi. Temsili görüntüler Şekil 4A,B'de gösterilmiştir. Kirpikler, mukus ve sıkı bağlantı gibi hava yolu epitel belirteçleri, organoidlerde Şekil 5A-D'de gösterilen tam montajlı immünofloresan boyama ile gösterilmiştir. Uygulamaya bağlı olarak, kesitli veya tam montajlı immünofloresan kullanılabilir. Tam montaj yöntemi, organoidin üç boyutlu doğasını korur ve daha önce yayınlanan çalışma13'te gösterildiği gibi, organoidin içini sağlam tutar.

CFTR fonksiyonu, otomatik görüntüleme sistemi kullanılarak forskolin kaynaklı şişlik (FIS) testi ile değerlendirildi. Daha iyi görüntü çözünürlüğü nedeniyle işlevsel testler için yalnızca 15 delikli slaytlar kullanılır. CF olmayan gönüllülerin (n = 5 denek) temsili bir forskolin doz-yanıt deneyi, optimize edilmiş görüntüleme süresinin ve analizinin mantığını göstermek için Şekil 6A'da gösterilmiştir. KF dışı ve KF organoid yanıtlarını karşılaştıran veriler önceki yayınlarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır11,13. Bir doz-yanıt, ölçümlere en iyi yaklaşımı göstermek için CFTR aktivitesindeki artımlı değişikliği gösterir. 1 saat ve 8 saatlik tahlil süreleri değerlendirilmiş (Şekil 6B,C) ve eğrinin altındaki alana (AUC) karşı ortalama fraksiyonel değişim (AFC) kullanılarak yapılan analizler Şekil 6C,D'de görülmektedir. Önceki deneyimlerimize dayanarak, çoğu denek ve koşul için 8 saat sonra plato şişmesi ve bazı durumlarda, organoidlerin bu süre zarfında patlamasına neden olur. Bu nedenle, tahliller sadece 8 saat ile sınırlıydı. Bu uzatılmış tahlil uzunluğunda, şişlik doğrusal olmayan hale gelir. AUC'nin kullanımı aynı zamanda hem boyuttaki değişiklikleri hem de değişim oranını dikkate alır. Bu nedenle, son metodolojideki tüm FIS testleri için 8 saatin üzerindeki AUC kullanılmıştır.

Şekil 1: Ortak kültürdeki HNE'lerin parlak alan görüntüleri. HNE'ler, ışınlanmış ve inaktive edilmiş 3T3 fibroblastları ile genişleme ortamlarında 10 gün boyunca genişler. Hücreleri görüntülemek için ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu kullanılır. (A) HNE'ler büyük bir kümede (siyah ok) iyi büyür. Buna karşılık, (B)'de, HNE'ler ışınlanmış 3T3 hücrelerini çevreleyen iki küçük kümede (siyah oklar) zayıf büyür. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: 15 delikli bir slayt ve kültür ekinde HNE organoid oluşumu. Organoidlerin parlak alan görüntüleri, 21 gün boyunca ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu kullanılarak yakalandı. 15 delikli slayttaki (A) organoidler, kültür ekindeki (B) görüntülerden daha hassas ve keskin görüntülere sahiptir. Slayt ve kesici uçta kültürlenen organoidler arasında morfolojik fark gözlenmedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 3: Organoid lümen boyutu (panel A) ve lümen ölçümleri (Panel B ve C). (A) CF olmayan organoidler tipik olarak CF (F508del / F508del) organoidlerinden daha büyük bir lümene ve daha fazla sıvıya sahiptir. (B) Kırmızı anahat ile gösterilen toplam yüzey alanını (TSA) ve tek bir organoidde yeşil anahat ile belirtilen lümen alanını (LA) manuel olarak ölçmek için bir yöntem. (C) CF olmayan bir kişiden organoidlerdeki temel Lümen Oranını (LA: TSA) hesaplamak için toplam yüzey alanını ve lümen alanını kullanmak için bir örnek. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Parafin içine gömülü organoidlerin kesiti. (A) CF olmayan ve CF (F508del/F508del) bir denekten organoidlerde H&E boyama örneği. (B) Bir organoidde kirpiklerin immünofloresan boyanması. Yeşil, asetillenmiş tübülin ve FITC etiketli ikincil antikor ile boyanmış kirpiklerdir (beyaz ok), mavi ise DAPI ile etiketlenmiş çekirdeklerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Organoidlerde tam montajlı immünofloresanın konfokal görüntüleri. (A,C) İki temsili organoidin maksimum projeksiyon görüntüleri. (B,D) Sırasıyla (A) ve (C)'nin üç boyutlu rekonstrüksiyon görüntüleri. Konfokal mikroskop platformuna 8 delikli cam tabanlı bir slayt yerleştirildi ve fotomikroskopları oluşturmak için 40x lens kullanıldı. Görüntülerin görüntülenmesi ve rekonstrüksiyonu için görüntüleme analiz yazılımı uygulandı. Beyaz oklar, organoidlerin lümenindeki mukus (B cinsinden) ve kirpikleri (C cinsinden) gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Şişlik tahlil uzunluğunun gerekçesi ve analiz yöntemleri. Primer burun epitel hücrelerinde CFTR fonksiyonunu test etmek için Forskolin (FSK) kaynaklı şişlik (FIS) testi. Şekillerde belirtilen farklı dozda forskolin, farklılaşma ortamındaki 21 günlük organoidlere uygulandı; organoid şişlik otomatik görüntüleyici ile 8 saat boyunca hemen kaydedildi. 8 saat sonra, şişlik ortalama fraksiyonel değişim (AFC) kullanılarak (A) (n = 5, CF olmayan denekler) içinde gösterilir. FSK doz-yanıtı, 1 saat (B) ve 8 saat (C) 'de AFC ile karşılaştırılır, bu da 8 saatlik tahlilin farklı FSK dozları arasında 1 saattekilerden daha önemli bir şişme farkı üretebileceğini düşündürmektedir. Panellerdeki X ekseni (B-D), şekil göstergesindeki sembollere karşılık gelen farklı işlem koşullarını temsil eder. Şekillerdeki tüm hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Genişletme ortamını yapmak için tüm bileşenler. Reaktif stok konsantrasyonu, stok depolama, 500 mL'lik bir ortam yapmak için stok miktarı ve nihai konsantrasyon hakkında ayrıntılı bilgi açıklanmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Farklılaştırma ortamı yapmak için tüm bileşenler. Reaktif stok konsantrasyonu, stok depolama, 500 mL'lik bir ortam yapmak için stok miktarı ve nihai konsantrasyon hakkında ayrıntılı bilgi açıklanmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: Görüntüleme sistemine özgü örnek bir protokol dosyası, organoid farklılaşmasını izlemek için organoidlerin otomatik görüntülenmesi için bir şablon olarak sağlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: FIS testi gerçekleştirmek için özel ayarları içeren örnek bir protokol dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

JSG, benzer bir modeli tanımlayan Kuzey Carolina Üniversitesi'nden bir patent başvurusu 20170242033 mucit olarak listelenmiştir. UNC'nin lisanslı teknolojisi telif hakkı ürettiğinde, mucitler gelirden pay alırlar. Aksi takdirde, yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Fon sağlayıcıların, çalışmanın tasarımında, verilerin toplanmasında, analizinde veya yorumlanmasında, makalenin yazımında veya sonuçların yayınlanması kararında hiçbir rolü yoktu.