Bu protokol, ortopik osteosarkom ve pulmoner metastaz lezyonlarını taşıyan fare modelleri oluşturmak için intratibia osteosarkom hücre enjeksiyonunu tanımlamaktadır.
Osteosarkom, çocuklarda ve ergenlerde en sık görülen primer kemik kanseridir ve akciğerler en sık metastatik bölgedir. Pulmoner metastazı olan osteosarkomlu hastaların beş yıllık sağkalım oranı %30’dan azdır. Bu nedenle, insanlarda osteosarkom gelişimini taklit eden fare modellerinin kullanılması, osteosarkom karsinogenezi ve pulmoner metastazın temel mekanizmasını anlamak ve yeni terapötikler geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Burada, osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu yoluyla primer osteosarkom ve pulmoner metastaz fare modellerini oluşturmak için ayrıntılı prosedürler bildirilmiştir. Biyolüminesans veya X-ışını canlı görüntüleme sistemi ile birlikte, bu canlı fare modelleri, osteosarkom büyümesini ve metastazını izlemek ve ölçmek için kullanılır. Bu modeli oluşturmak için, osteosarkom hücrelerini içeren bir bazal membran matrisi mikro hacimli bir şırıngaya yüklendi ve anestezi uygulandıktan sonra her bir atimik farenin bir tibiasına enjekte edildi. Fareler, birincil osteosarkom IACUC onaylı protokolde boyut sınırlamasına ulaştığında kurban edildi. Osteosarkom taşıyan bacaklar ve metastaz lezyonu olan akciğerler ayrıldı. Bu modeller kısa bir inkübasyon süresi, hızlı büyüme, ciddi lezyonlar ve primer ve pulmoner metastatik lezyonların gelişimini izlemede duyarlılık ile karakterizedir. Bu nedenle, bunlar osteosarkom karsinogenezi ve pulmoner metastaz, tümör mikroçevresi spesifik faktörlerin fonksiyonlarını ve mekanizmalarını araştırmak ve in vivo terapötik etkinliği değerlendirmek için ideal modellerdir.
Osteosarkom, çocuklarda ve ergenlerde en sık görülen primer kemik kanseridir1,2, esas olarak çevre dokuya sızar ve hatta hastalar teşhis edildiğinde akciğerlere metastaz yapar. Pulmoner metastaz osteosarkom tedavisi için temel zorluktur ve pulmoner metastazı olan osteosarkomlu hastaların beş yıllık sağkalım oranı %20-%30 gibi düşük bir seviyededir3,4,5. Bununla birlikte, primer osteosarkomun beş yıllık sağkalım oranı, kemoterapinin başlaması nedeniyle 1970’lerden bu yana yaklaşık% 70’e yükselmiştir6. Bu nedenle, yeni tedaviler geliştirmek için osteosarkom karsinogenezi ve pulmoner metastazın temel mekanizmasını anlamak acilen gereklidir. İnsanlarda osteosarkom ilerlemesini en iyi taklit eden fare modellerinin uygulanması büyük önem taşımaktadır7.
Osteosarkom hayvan modelleri spontan, indüklenmiş genetik mühendisliği, transplantasyon ve diğer tekniklerle üretilir. Spontan osteosarkom modeli, tümör oluşum süresinin uzaması, tümör oluşum hızının tutarsız olması, düşük morbidite ve düşük stabilite nedeniyle nadiren kullanılmaktadır 8,9. İndüklenmiş osteosarkom modelinin elde edilmesi spontan osteosarkomdan daha erişilebilir olmasına rağmen, indükleyici faktör mikroçevreyi, patogenezi ve osteosarkomun patolojik özelliklerini etkileyeceğinden indüklenmiş osteosarkom modelinin uygulanması sınırlıdır10. Transgenik modeller, insan fizyolojik ve patolojik ortamlarını daha iyi simüle edebildikleri için kanserlerin patogenezini anlamaya yardımcı olmaktadır; Bununla birlikte, transgenik hayvan modelleri, transgenik modifikasyonun zorluğu, uzun vadeli ve yüksek maliyeti nedeniyle sınırlamalara sahiptir. Dahası, p53 ve Rb gen modifikasyonu ile üretilen en yaygın kabul gören transgenik hayvan modellerinde bile, dört ekstremite kemiğinde sarkomun sadece% 13.6’sımeydana geldi 11,12.
Transplantasyon, basit manevrası, stabil tümör oluşum hızı ve daha iyi homojenliği nedeniyle son yıllarda en sık kullanılan primer ve uzak metastatik kanser modeli üreten yöntemlerden biridir13. Transplantasyon, heterotopik transplantasyonu ve transplantasyon bölgelerine göre ortotopik transplantasyonu içerir. Osteosarkom heterotopik transplantasyonunda, osteosarkom hücreleri, hayvanların primer osteosarkom bölgelerinin (kemik) dışına, genellikle deri altına, deri altından enjekte edilir14. Heterotopik transplantasyon, hayvanlarda ameliyat yapmaya gerek kalmadan basit olmasına rağmen, osteosarkom hücrelerinin enjekte edildiği bölgeler gerçek insan osteosarkom mikro ortamını temsil etmemektedir. Osteosarkom ortotopik transplantasyonu, osteosarkom hücrelerinin tibia15,16 gibi hayvanların kemiklerine enjekte edilmesidir. Heterotopik greftlerle karşılaştırıldığında, ortotopik osteosarkom greftleri kısa bir kuluçka süresi, hızlı büyüme ve güçlü eroziv doğa ile karakterizedir; bu nedenle, osteosarkomla ilgili çalışmalar için ideal hayvan modelleridir17.
En sık kullanılan hayvanlar fareler, köpekler ve zebra balığıdır18,19. Osteosarkomun spontan modeli genellikle köpeklerde kullanılır, çünkü osteosarkom köpeklerde en sık görülen tümörlerden biridir. Bununla birlikte, bu modelin uygulanması uzun tümör oluşum süresi, düşük tümörigenez hızı, zayıf homojenlik ve stabilite nedeniyle sınırlıdır. Zebra balıkları genellikle hızlı üremeleri nedeniyle transgenik veya nakavt tümör modelleri oluşturmak için kullanılır20. Ancak zebra balığı genleri insan genlerinden farklıdır, bu nedenle uygulamaları sınırlıdır.
Bu çalışma, atimik farelerde osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu yoluyla pulmoner metastaz ile tibiadaki primer osteosarkomun üretilmesi için ayrıntılı prosedürleri, önlemleri ve temsili görüntüleri açıklamaktadır. Bu yöntem, terapötik etkinlik değerlendirmesi için fare tibiasında primer osteosarkomu oluşturmak için uygulandı ve bu da yüksek tekrarlanabilirlikgösterdi 21,22.
Osteosarkom hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu, osteosarkom karsinogenezindeki spesifik faktörlerin fonksiyon ve mekanizmasını incelemek ve terapötik etkinliği değerlendirmek için gelişmek için ideal bir modeldir. Tümör büyümesindeki farklılıkları önlemek için, aynı sayıda% 80 -% 90 oranında akan aktif osteosarkom hücrelerinin çoğu, her farenin tibiasına dikkatlice enjekte edilir ve hücre tripsinizasyon süresi, hücre canlılığını etkilemeden sıkı bir şekilde kontrol edilir. Hücre küm…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, (1) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2018YFC1704300 ve 2020YFE0201600), (2) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408) tarafından desteklenmiştir.
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |