Fare Femurunun Stabilize Pin ile Enine Kırılması

Kırıklar, kemik yüzeyinin sürekliliğindeki kırılmalar, popülasyonun tüm segmentlerinde meydana gelir. Yaşlanma veya hastalık nedeniyle kırılgan kemikleri olan kişilerde şiddetlenirler ve kırılganlık kırıklarının sağlık bakım maliyetlerinin 5 yıl içinde 25 milyar doları aşması beklenmektedir ^1,2,3,4,5. Kırık onarımında yer alan biyolojik mekanizmaların anlaşılması, iyileşme sürecini iyileştirmeyi amaçlayan yeni tedavilerin geliştirilmesinde bir başlangıç noktası olacaktır. Önceki araştırmalar, kırık üzerine, kemiğin iyileşmesini sağlayan dört önemli adımın gerçekleştiğini göstermiştir: (1) hematom oluşumu; (2) fibrokıkırdaklı nasır oluşumu; (3) kemik oluşturmak için yumuşak nasırın mineralizasyonu; ve (4) iyileşmiş kemiğin yeniden şekillenmesi ^6,7. Kırığı başarılı bir şekilde iyileştirmek için birçok biyolojik süreç aktive edilir. İlk olarak, bir kırık ^6,7'den hemen sonra akut bir pro-inflamatuar yanıt başlatılır. Daha sonra, periost aktive olur ve genişler ve periosteal hücreler, bozulmuş kemik segmentlerinin 6,7,8,9 tarafından bırakılan boşluğu doldurmak için büyüyen bir kıkırdak nasır oluşturmak için kondrositlere farklılaşır. Nöral ve vasküler hücreler, onarımı kolaylaştırmak için gereken ek hücreleri ve sinyal moleküllerini sağlamak için yeni oluşan nasırları istila eder 6,7,8,9,10. Nasır oluşumuna katkıda bulunmanın yanı sıra, periosteal hücreler ayrıca köprüleme nasırında dokunmuş kemiği bırakan osteoblastlara da farklılaşır. Son olarak, osteoklastlar yeni oluşan kemiği orijinal şekline ve lamel ^{yapısına 7,8,9,10,11} geri döndürmek için yeniden şekillendirir. Birçok grup kırık onarımı için fare modelleri geliştirdi. Farelerde daha erken ve en sık kullanılan kırık modellerinden biri, bacak üzerinde belirli bir yükseklikten¹² ağırlık bırakıldığı Einhorn yaklaşımıdır. Açı üzerinde kontrol eksikliği ve kırığı indüklemek için uygulanan kuvvet, kemik süreksizliğinin yeri ve boyutunda çok fazla değişkenlik yaratır. Daha sonra, gözlenen spesifik kırık iyileşme yanıtında değişikliklere neden olur. Diğer popüler yaklaşımlar, tibial monokortikal defekt veya stres kırıkları üretmek için cerrahi müdahale, nispeten daha hafif iyileşme yanıtlarını indükleyen prosedürlerdir^10,13. Bu modellerdeki değişkenlik öncelikle prosedürü uygulayan kişiden kaynaklanmaktadır¹⁴.

Burada, ayrıntılı bir fare femur yaralanması modeli, tekrarlanabilir bir yaralanma sağlamak ve femur kırığı onarımının kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin vermek için mola üzerinde kontrol sağlar. Spesifik olarak, yetişkin farelerin femurlarında tam bir atılım tanıtılır ve fiziksel yüklemenin kemik iyileşmesinde oynadığı rolü hesaba katmak için kırık uçlarını stabilize eder. Histoloji ve mikrobilgisayarlı tomografi (mikroBT) kullanılarak dokuların toplanması ve iyileşme sürecinin farklı adımlarının görüntülenmesi için yöntemler de ayrıntılı olarak verilmektedir.

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Harvard Tıp Alanı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde 12 haftalık C57BL/6J fareler (erkek ve dişi) kullanılmıştır. C57BL / 6J erkek ve dişi fareler, stabilize edici bir pime sığacak kadar geniş femurlarla yaklaşık 12 haftalıkken pik kemik kütlesine ulaşır ve bu da onları bu protokol¹⁵ için kullanmak için uygun bir suş haline getirir.

1. Ameliyata hazırlık

1. Enfeksiyon riskini en aza indirmek için cerrahi makas, düz forseps, kavisli forseps, cerrahi kelepçeler ve elmas kesme tekerleği dahil olmak üzere cerrahi ekipmanı otoklav edin (bkz.
2. Ameliyat sonrası iyileşmeyi kolaylaştırmak için bir ısıtma yastığına temiz bir fare kafesi yerleştirin. Isı yastığını 37-45 °C arasında bir sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın.
3. Fareyi bir izofluran odası kullanarak anestezi altına yerleştirin. İndüksiyon oksijen akışını 2 L / dak'ya, izofluran indüksiyonunu% 2-4'e, bakım burun konisi oksijenini 2 L / dak'ya ve bakım izofluranını% 1.4'e ayarlayın.
4. Farenin nefes alışının sabit olduğunu ve ayak parmağı sıkışmasına tepki vermediğini onaylayın. Kornea çizilmesini önlemek için her göze ince bir oftalmik merhem tabakası uygulayın. Fareyi steril bir ped'e aktarın ve izofluran'ı sürekli olarak adım 1.3'te olduğu gibi aynı oranda vermek için bir burun konisi kullanarak anesteziyi sürdürün.
   NOT: 12 haftalık veya daha yaşlı farelerin kullanılması önerilir, çünkü genç farelerden gelen femurlar stabilize edici bir pimi barındırmak için çok ince olabilir.
5. Fareyi deri altından 0.05 mg/kg vücut ağırlığı yavaş salınımlı buprenorfin ile enjekte edin (bkz.
6. Elektrikli bir düzeltici kullanarak, femur konumuna karşılık gelen her iki uylukta 2 x 2 cm'lik bir kareyi tıraş edin.
7. Bir iyot tabakası yaymak için steril gazlı bez veya çubuklar kullanarak tıraş edilen bölgeyi dezenfekte edin ve% 70 etanol ile durulayın (Şekil 1A).

2. Ameliyat

1. Steril bir neşter kullanarak, tıraş edilmiş, dezenfekte edilmiş bölgede 5 mm'lik bir kesi yapın ve altta yatan fasyayı ortaya çıkarmak için cildi soyun.
2. Kasları açığa çıkarmak için femuru doğrudan kaplayan fasyayı hassas bir şekilde tutup kesmek için düz forseps ve ince makas kullanın. Fasyanın 5 mm'lik bir kesimi, altta yatan kaslara erişmek için yeterlidir.
3. Bir çift düz forseps kullanarak, kası femurdan en az doku hasarı ile yavaşça ayırın.
4. Femur görünür olduğunda, kavisli forsepsleri femur altından ayrılmış kas ve kemik arasında kaydırın. Forsepslerin kas ayrımını korumak için yavaşça açılmasına izin verin ve temiz bir kesimi kolaylaştırmak için femuru sabitleyin.
   NOT: Femur, Forseps tutulmadığında Şekil 1B'de gösterildiği gibi açıkta kalmalı ve kas ve deriden ayrılmalıdır.
5. Düşük güç ayarında el tipi bir testere kullanarak femur milinin ortasında enine bir kesim yapın (Kullanılan bıçak ve Döner Alet Kiti için Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Femur tamamen kesildikten sonra, iki kırık ucu oluşturulur: proksimal bölüm (kalça kemiğine bağlı) ve distal bölüm (diz üzerine bağlı, boğucu eklem olarak da bilinir). Femuru tek bir hareketle kesmekten kaçının. Bunun yerine, femur tamamen kesilene kadar 3-5 geçiş yapın. Bu, çevreleyen dokunun aşırı ısınmasını ve iyileşmeyi olumsuz yönde etkileyen önemli kemik kalıntıları oluşturmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.
6. Distal bölümün kemik iliği boşluğuna bir kılavuz iğne (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (bkz. Diz ekleminden iplik geçirmeye iterken iğneyi hafifçe bükmek için parmaklarınızı kullanın (Şekil 1C).
   1. Kılavuz iğneyi distal uçtan çıkarın ve kılavuz iğneyi kalça ekleminden itmek için aynı yumuşak büküm hareketini kullanarak proksimal uçta tekrarlayın. Kılavuz iğneyi proksimal uçta, ucu deriden çıkmış şekilde bırakın (Şekil 1D).
      NOT: Kırık uçlarını stabilize etmek için, önce kırık uçlarından bir yol oluşturmak için bir kılavuz iğne kullanıldı ve daha sonra kırık uçlarını¹⁴ sabitlemek için bu yoldan stabilize edici bir pim geçirildi.
7. Sabitleme pimini (iğne, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) ( bkz. Malzeme Tablosu) kılavuz iğnenin ucuna yerleştirin (Şekil 1E). Kılavuz iğne proksimal ucun ilik boşluğundan çıkarken dengeleyici pim girecek şekilde yavaşça itin.
   1. Kılavuz iğneyi atın. Distal ucu proksimal uçla tutmak ve hizalamak için cımbız kullanın ve 2.6'da yapılan yolu kullanarak diz ekleminden çıkana kadar stabilizatör pimi distal kemik iliği boşluğundan geçirmeye devam edin (Şekil 1F).
      NOT: Stabilize edici pim şimdi kalça ve diz eklemlerinden çıkıntı yapıyor olmalıdır.
8. Cerrahi kelepçeyi kullanarak, proksimal ve distal bölümleri birbirine yaklaştırmak için pimin ucunu çekin, böylece zar zor dokunuyorlar. Gerekirse kırık uçlarını forseps ile yeniden hizalayın ve cerrahi kelepçeyi kullanarak stabilize edici pimin uçlarını kırık bölgesine doğru katlayın (bkz.
   1. Tel kesiciler kullanarak plastiği iğnenin tabanından çıkarın. Kelepçeyi kullanarak, iç doku hasarını önlemek için pimin her iki ucunu da körelene kadar bükün.
      NOT: Kırık uçları artık yerine kilitlenmiştir, böylece fare yaralı bacağa ağırlık verebilir. Kırık uçları ayrılamıyorsa pim sabitlenir. Uçları köreltmek için bir tel kesici de kullanılabilir. Dengeleyici pim, fare ötenazi yapılana kadar çalışmanın tüm süresi boyunca yerinde kalmalıdır. Pimi yerinden çıkarma girişimlerinin kırık tepkisini istikrarsızlaştırması ve hayvana zarar vermesi muhtemeldir. Pin diseksiyonda çıkarılabilir.
9. Kasları femur üzerine yeniden konumlandırmak için düz forseps kullanın. Kavisli forseps kullanarak, cildin uçlarını birbirine sıkıştırın ve yara klipslerini kullanarak açıklığı kapatın.
   NOT: Cildi klipslerle çok sıkı bir şekilde kapatmayın, aksi takdirde fare bu bacağa ağırlık vermekten kaçınacaktır. İyileşme sırasında fiziksel yüklemenin sınırlandırılması iyileşme sürecini geciktirebilir.
10. Diğer bacakta 2.2 ila 2.4 arasındaki adımları tekrarlayın ve femur kırığı gerçekleştirmeden yarayı kapatın.
    NOT: Bu sahte ile çalışan femur, kontralateral kontrol görevi görür.
11. İzofluran maruziyetini geri çekin, fareyi ısıtılmış kafese yerleştirin ve 10-15 dakika içinde bilincini yeniden kazanmalarını sağlayın.
12. Farenin aktivitesini ve kesi bölgesini ameliyattan sonraki 5 gün boyunca günlük olarak sıkıntı veya enfeksiyon belirtileri açısından izleyin.
    NOT: Hayvan ağrı belirtileri gösteriyorsa, yemek yemiyorsa ve / veya arka bacaklarında yürümekte tereddüt ediyorsa, veteriner personeline danışın ve ek analjezik uygulayın.
13. Ameliyattan 10 gün sonra yara klipslerini çıkarın.
    NOT: Yara 10 gün sonra kapanmış gibi görünmüyorsa, klipsleri çıkarmadan önce veteriner personeline ve IACUC'ye danışın.

3. Doku hasadı

1. Fareleri CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal çıkık yoluyla ötenazileştirin.
   NOT: Bu prosedür, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli ile tutarlıdır.
2. Makas ve forseps kullanarak, cildi her iki fare bacağından çıkarın, femur kafasını kalça kemiğinden çıkarın ve bacağı serbest bırakmak için bitişik kası kesin.
   NOT: Nasır yerinden çıkabileceği veya hasar görebileceği için femur çevresinde çok fazla kas çıkarmaktan kaçının.
3. Stabilize edici pimden kaçınarak, femuru tibiadan ayırmak için diz ekleminden kesin.
4. Stabilize edici pimin uçlarını ortaya çıkarmak için femurun distal ve proksimal kısımlarının etrafını diseke edin.
5. Sert bir tel kesici ile, pimin katlanmış künt uçlarını kesin, böylece pimin sadece düz kısmı kalır. Stabilize edici pimi yavaşça ve nazikçe femurdan çıkarmak için forseps kullanın.
   NOT: Pin kolayca dışarı kaymazsa, nasır yerinden çıkabileceğinden ve numuneye zarar verebileceğinden kuvvet uygulamayın. Bunun yerine, pimi döndürmeye ve hassas bir şekilde çıkarmaya çalışın. Fiksasyondan sonra pimin çıkarılması da daha kolay olabilir.

4. Histoloji - Alcian Blue / Eosin / Orange G boyama

NOT: Alcian Blue / Orange G / Eozin boyaması, kıkırdak (mavi) ve kemiği (pembe) görselleştirmek için rutin olarak kullanılır. Kıkırdak alanı toplam nasır alanının bir oranı olarak ölçülebilir (Şekil 2A,B).

1. Femurları 4 ° C'de gece boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin.
2. Sabit numuneleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yıkayın.
3. Numuneleri 0,5M EDTA, pH 8,0 içine 2 hafta boyunca yavaşça dönen bir çalkalayıcıya yerleştirin. Etkili kireç çözme sağlamak için EDTA çözümünü her geçen gün değiştirin.
   NOT: Çalkalayıcı için belirli bir rpm gerekmez; sıvının tüm numuneleri kapsayacak şekilde kapta aktığından emin olun. Tam kireçlenme, femurların röntgeni ile test edilebilir.
4. Parafin gömme numunelerini işlemek için bunları aşağıdaki çözeltilerde (her biri 1 saat) inkübe edin:% 70 EtOH,% 95 EtOH,% 100 EtOH,% 100 EtOH, Ksilen, Ksilen, Parafin, Parafin.
5. Örnekleri bölümleme için parafine gömün.
6. Kırık femurların 5-7 μm kalınlığındaki uzunlamasına kesitlerini mikrotom kullanarak kesin.
7. Bölümleri 2 Ksilen banyosunda (her biri 5 dakika) inkübe ederek deparaffinize edin.
8. Aşağıdaki etanol gradyanında (her biri 2 dakika) inkübe ederek bölümleri rehidre edin:% 100 EtOH,% 100 EtOH,% 80 EtOH,% 70 EtOH.
9. Kaydırakları 1 dakika boyunca musluk suyuna yerleştirin.
10. Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi histoloji için Alcian mavisi, Asit alkol, Amonyum suyu ve Eozin / Turuncu G çözeltilerini yapın.
    NOT: Her çözeltinin önerilen hacimleri, boyama için slaytları tamamen suya batırmak için yeterli olmalıdır.
11. Slaytları 30 sn boyunca Asit alkole yerleştirin ve 40 dakika boyunca Alcian mavisinde inkübe edin.
12. Su yaklaşık 2 dakika temizlenene kadar akan musluğun altında yavaşça yıkayın.
13. Slaytları hızla 1 s boyunca asit alkole batırın.
14. Adım 4.9'da açıklandığı gibi durulayın.
15. 15 s boyunca amonyum suyunda inkübe edin.
16. Adım 4.9'da açıklandığı gibi durulayın.
17. 1 dakika boyunca% 95 EtOH'ye yerleştirin ve 90 saniye boyunca Eosin / Turuncu G'de kuluçkaya yatırın.
18. %70 EtOH, %80 EtOH ve %100 EtOH'ye tek bir daldırma ile kızakları hızlı bir şekilde kurutun.
19. Slaytları temizlemek için slaytları 1 dakika boyunca Xylene içine yerleştirin.
20. Görüntüleme için montaj ortamı ve bir kapak kapağı uygulayın.
    NOT: Moleküler analiz için, RNA ve protein nasırdan izole edilebilir. Kasları diseksiyon kapsamı altında dikkatlice diseke edin ve nasırı bir neşter kullanarak altta yatan kemikten ayırın.

5. MikroBT

NOT: İyileşmenin sonraki aşamalarında, sert nasır ve kırık boşluğundaki mineralizasyonu görüntülemek ve ölçmek için mikroBT yapılabilir. C57BL/6J farelerde, nasır genellikle mineralize edilir ve kırıktan 10 gün sonra (dpf) mikroBT ile tespit edilebilir (Şekil 2C).

1. Femurları 4 ° C'de gece boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin.
   NOT : MikroBT, EDTA dekalsifikasyonundan önce yapıldığı sürece histoloji için kullanılan aynı femurlar üzerinde yapılabilir (adım 4.3). Her iki teknik için de aynı femurları kullanırken, mikroBT gerçekleştirin, örnekleri alın ve adım 4.3'e gidin.
2. Sabit numuneleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yıkayın ve% 70 EtOH'de saklayın.
3. 55 kVP enerji seviyesinde ve 145 μA yoğunlukta 7 μm'lik izotropik voksel boyutunda microCT gerçekleştirin (bkz.
4. MikroBT dilimlerini nasır içerecek ve kortikal kemiği dışlayacak şekilde konturlayın.
   NOT: Nasır zamanla daha mineralize oldukça, eşik nasır hacmini farklı aşamalarda görselleştirmek ve ölçmek için ayarlanabilir.
5. Nasır konturlarında bulunan kemik hacmini, nasır hacminin bir ölçüsü olarak elde edin.
   NOT: Kırılma boşluğu, kırılmanın kapladığı mesafe olarak doğrudan mikroBT dilimleri üzerinde ölçülebilir.

C57BL / 6J farelerinde, başarılı bir cerrahi, daha önce bahsedilen iyileşme adımlarını, sahte ameliyat edilen kontralateral femurda çok az lokal enflamatuar yanıt veya periosteal tutulum olmadan tamamlar. Ameliyattan birkaç saat sonra bir hematom oluşur ve periosteum, kondrogenez için iskelet progenitörlerini işe almak için aktive edilir. Prx1 + mezenkimal progenitörler gibi çeşitli hücre popülasyonları, ticari olarak temin edilebilen floresan muhabir fare modelleri kullanılarak onarım işlemi sırasında izlenebilir (Şekil 3). Kırıktan 5 gün sonra (dpf), yumuşak nasır görselleştirmek ve daha sonra kıkırdak alanını ölçmek için Alcian Blue boyama kullanılabilir (Şekil 2A, B). Mineralizasyon mikroBT ile 28 dpf'de tespit edilebilir (Şekil 2C). Mineralize kalsusun hacmi, kırık boşluğunun mesafesi ve mekanik testlerle ölçülen kemik kuvveti, kırık onarımının ölçülebilir sonuçları olarak yaygın olarak kullanılır. Genetik modifikasyon veya ilaç müdahalesi iyileşme sürecini değiştirebilir, bu nedenle onarımın farklı aşamalarında kırıkları karakterize etmek için bir zaman kursu çalışması yapılması önerilir. Tüm nasır moleküler analiz için diseke edilebilir ve kontralateral kemik şaftı kontrol olarak kullanılabilir.  Kırık uçları pim ile yeterince hizalanmazsa veya yeterince sabitlenmezse, ortaya çıkan görüntüler kırık bölgesinin tamamında veya bir tarafında nasır oluşumunun olmadığını gösterecektir (Şekil 4).

Resim 1: Sabitleme piminin kırılması ve takılması . (A) C57BL/6J farenin sağ bacağında bir kare traş edilir. (B) Deride ve fasyada bir kesi yapıldıktan sonra, kas, cilt ve kemiği ayırmak için femur altına kavisli forseps sabitlenir. (C) Kesim yapıldıktan sonra, iki kırık ucu oluşturulur: kalça kemiğine bağlı femurun proksimal bölümü ve dize bağlı distal bölüm. Kılavuz iğne (yeşil) distal bölüme yerleştirilir ve diz ekleminden itilir. (D) Kılavuz iğne distal bölümden çıkarılır, proksimal bölüme yerleştirilir ve kalça ekleminden itilir. (E) Dengeleyici pim (gri iğne), kalça ekleminden çıkıntı yapan kılavuz iğneye yerleştirilir. (F) Stabilize edici pim, proksimal bölümden, distal bölüme ve C'deki kılavuz iğne tarafından yapılan yol kullanılarak diz ekleminden itilir.

Şekil 2: Femur kırığının histolojisi ve mikroCT'si . (A) Femur kırıklarının formalin-sabit parafin kesitleri 5, 10 ve 28 dpf'de toplandı ve Alcian Blue/Eozin/Orange G. Scale bar = 500 μm ile boyandı. (B) Kıkırdak alanı 5, 10 ve 28 dpf'de ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. (C) 28 dpf'de mineralizasyon gözlendi ve nasır hacmi ve kırık boşluğu mikroBT ile ölçülebildi. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. Ortalama ± SEM olarak gösterilen veriler. Mineralize nasır hacmi, kırık bölgesinde kortikal kemiğin etrafında konturlama yapılarak ölçüldü. Koyu gri alan görüntüdeki mineralize nasırı tanımlarken, kortikal kemik (açık gri) ölçüme dahil edilmez. Ortalama ± SEM olarak gösterilen veriler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kırılma sonrası Prx1+ periosteal hücrelerinin genişlemesini görselleştirmek için kullanılan floresan muhabir modeli. Prx1CreER; Rosa26tdDomates fareleri, tdDomates ekspresyonunu indüklemek için 80 mg / kg vücut ağırlığı tamoksifen ile beş gün boyunca günlük olarak enjekte edildi. Son enjeksiyondan üç gün sonra, femur kırığı başlatıldı ve fareler, Prx1 eksprese eden hücrelerin ve soylarının (Prx1 +) kırık nasır ve genleşmiş periost içinde nerede bulunduğunu izlemek için 7 veya 14 dpf'de kurban edildi. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Cerrahi sorunlar nedeniyle düzensiz iyileşme örneği. Kırık uçları düzgün bir şekilde hizalanmadı ve stabilize edici pim bu örnekte femurun proksimal bölümünden delindi. Bu hatalar, kesik bölgesinde değil, femurda delindiği yerde (sarı kutu) nasır oluşumuna neden oldu. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Histoloji için gerekli çözümlerin bileşimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacağı herhangi bir çıkar çatışması yoktur.