Özet

Glikojen Yapısının Belirlenmesi için Karaciğer Glikojen Moleküllerinin Ekstraksiyonu

Published: February 08, 2022
doi:

Özet

Sükroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak karaciğer glikojeninin ekstraksiyonu için optimal bir sükroz konsantrasyonu belirlendi. Glikojen parçalayıcı enzimleri inhibe etmek için 10 dakikalık bir kaynatma adımının eklenmesinin faydalı olduğu kanıtlandı.

Abstract

Karaciğer glikojeni, hayvanlarda kan şekeri seviyelerinin korunmasında rol oynayan hiperdallı bir glikoz polimeridir. Glikojenin özellikleri yapısından etkilenir. Bu nedenle, temsili glikojen örneklerini izole eden uygun bir ekstraksiyon yöntemi, bu makromolekülün incelenmesi için çok önemlidir. Diğer ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, sükroz yoğunluk gradyanlı santrifüjleme adımı kullanan bir yöntem moleküler hasarı en aza indirebilir. Bu yönteme dayanarak, yakın tarihli bir yayın, santrifüjleme sırasında kullanılan sakaroz çözeltisinin yoğunluğunun, çok çeşitli boyutlardaki glikojen parçacıklarını ekstrakte etmek için en uygun konsantrasyonu bulmak için nasıl değiştirildiğini (%30, %50, %72.5) açıklamaktadır. Glikojen parçalayıcı enzimleri denatüre etme yeteneğini test etmek ve böylece glikojeni korumak için 10 dakikalık bir kaynatma aşaması tanıtıldı. En düşük sükroz konsantrasyonunun (% 30) ve kaynatma aşamasının eklenmesinin, en temsili glikojen örneklerini çıkardığı gösterilmiştir.

Introduction

Glikojen, hayvanlarda, mantarlarda ve bakterilerde bulunan karmaşık, hiperdallı bir glikoz polimeridir1. Memelilerde, karaciğer glikojeni, homeostazı koruyan bir kan şekeri tamponu olarak işlev görürken, kas glikojeni, doğrudan enerji sağlamak için kısa süreli bir glikoz rezervuarı görevi görür2. Glikojenin yapısı genellikle üç seviye ile tanımlanır (Şekil 1’de gösterilmiştir): 1. Doğrusal zincirler, (1→4)-α glikozidik bağlar yoluyla glikoz monomerleri tarafından oluşturulur ve dallanma noktaları (1→6)-α glikozidik bağlarla bağlanır; 2. Özellikle iskelet kası gibi dokularda bağımsız glikojen molekülleri olarak işlev gören çok dallı β parçacıkları (~20 nm çapında) 3,4; 3. Karaciğerde5, kalpte 6 ve bazı memeli olmayan türlerde bulunan daha küçük β glikojen birimlerinden oluşan daha büyük α glikojen parçacıkları (çapı300 nm’ye kadar)7. Diyabetik farelerden elde edilen hepatik α partikülleri moleküler olarak kırılgandır, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündüğünde β partiküllere bozunma eğilimi gösterirken, diyabetik olmayan kontrollerden α partiküller genellikle değişmeden kalır. Bir hipotez, bu kırılganlığın diyabette görülen zayıf kan şekeri dengesini daha da kötüleştirebileceğidir, kırılgan α partikülleri potansiyel olarak daha hızlı bozunan β partikülünün daha yüksek oranlarına neden olur 8,9,10,11.

Geleneksel glikojen ekstraksiyon yöntemleri, karaciğer dokusunu sıcak alkali çözeltiye (TCA)12 veya trikloroasetik asit (TCA) 13 veya perklorik asit (PCA) 14 gibi asit çözeltilerine maruz bırakmanın nispeten sert koşullarını kullanır. Glikojeni karaciğer dokusunun diğer bileşenlerinden ayırmada etkili olmakla birlikte, bu yöntemler kaçınılmaz olarak glikojen yapısını bir dereceye kadar bozar15,16. Bu yöntemler, glikojen içeriğinin kantitatif ölçümü için uygun olsa da, bu yapısal hasar nedeniyle glikojen hakkında yapısal bilgi elde etmeye odaklanan çalışmalar için ideal değildir. Bu yöntemlerin geliştirilmesinden bu yana, sükroz yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme 17,18,19 ile soğuk Tris tamponu (glukozidaz bozunmasını inhibe ettiği gösterilmiştir) kullanan daha hafif bir ekstraksiyon prosedürü geliştirilmiştir. PH ~8’de kontrol edildiğinde, bu yöntem glikojeni önceki prosedürlerde görülen asit veya alkali hidrolize maruz bırakmaz.

Homojenize karaciğer dokusunun sükroz yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjü, glikojen partiküllerini hücre materyalinin çoğundan ayırabilir. Gerekirse, hazırlayıcı boyut dışlama kromatografisi ile ek saflaştırma gerçekleştirilebilir, bu da saflaştırılmış glikojenin bağlı glikojen ile ilişkili proteinlerletoplanmasıyla sonuçlanır 20. Daha hafif koşullara sahip bu yöntemin glikojenin yapısını koruma olasılığı daha yüksek olsa da, glikojenin bir kısmının süpernatantta, özellikle daha az yoğun olan daha küçük glikojen parçacıklarında kaybolmasını önlemek zordur15. Glikojen kaybının bir başka potansiyel nedeni, daha ılıman koşulların bir miktar enzimatik bozunmaya izin vermesi ve bunun sonucunda daha sert ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla daha düşük glikojen verimine neden olmasıdır. Son araştırmalar, glikojen21’in yapısını korumak için karaciğer-glikojen ekstraksiyon yönteminin optimizasyonunu bildirmiştir. Burada, daha düşük sakaroz konsantrasyonlarının daha küçük glikojen partiküllerinin kaybını en aza indirip indirmediğini belirlemek için çeşitli sükroz konsantrasyonları (%30, %50, %72.5) test edildi. Gerekçe, daha düşük yoğunluğun daha küçük, daha az yoğun parçacıkların sakaroz tabakasına nüfuz etmesine ve glikojenin geri kalanıyla birlikte pelette toplanmasına izin vermesiydi.

Bu çalışmada, glikojen bozunma enzimlerinin denatüre olup edilemeyeceğini test etmek için 10 dakikalık kaynatma aşaması olan ve olmayan ekstraksiyon yöntemleri karşılaştırıldı ve bu da kısmi bozunmadan arınmış daha fazla glikojenin ekstraksiyonu ile sonuçlandı. Daha önce yayınlanan bir nişasta ekstraksiyon optimizasyonuna benzer şekilde, ekstrakte edilen glikojenin yapısını belirlemek için tüm moleküler boyut dağılımları ve glikojen zincir uzunluğu dağılımları kullanıldı22. Diferansiyel kırılma indisi (DRI) algılamalı boyut dışlama kromatografisi (SEC), toplam moleküler ağırlığı moleküler boyutun bir fonksiyonu olarak tanımlayan glikojenin boyut dağılımlarını elde etmek için kullanıldı. Florofor destekli karbonhidrat elektroforezi (FACE), verilen her bir boyuttaki (veya polimerizasyon derecesinin) nispi glukozit zincirlerinin nispi sayısını tanımlayan zincir uzunluğu dağılımlarını analiz etmek için kullanıldı. Bu makale, önceki optimizasyon çalışmasına dayalı olarak karaciğer dokularından glikojen ekstraksiyon metodolojisini açıklamaktadır21. Veriler, glikojen yapısını korumak için en uygun yöntemin, 10 dakikalık bir kaynatma adımı ile% 30’luk bir sükroz konsantrasyonu olduğunu göstermektedir.

Protocol

Bu prosedürü optimize etmek için kullanılan fare karaciğerleri21 , 12 erkek BKS-DB / Nju arka plan faresinden alınmıştır (7.2 haftalık, Malzeme Tablosuna bakınız). Hayvan kullanımı, Wuhan Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi, IACUC Sayı No. WDRM 20181113. 1 Hayvan dokuları Fare karaciğerini tartın (her fareden 1-1.8 g tam karaciğer). Fare karaciğerini sıvı nitrojen içinde hızla dondurun ve -80 °C’de…

Representative Results

Yukarıda açıklanan prosedür en uygun yöntem için olsa da (10 dakikalık bir kaynatma aşamasının eklenmesiyle% 30 sakaroz), burada daha önce açıklandığı gibi kaynatma aşaması olan ve olmayan üç sükroz konsantrasyonu (% 30,% 50,% 72.5) yoluyla ekstrakte edilen glikojen için veriler sağlanmaktadır21. Protokolü takiben, farklı koşullarla ekstrakte edilen kuru glikojenin saflığı, ham verimi ve glikojen verimi,21’den çoğaltılan Tablo 1’de</…

Discussion

Önceki çalışmalar, glikojenin yapısının özellikleri için önemli olduğunu göstermiştir; Örneğin, moleküler boyut, glikojen10’un bozunma hızını etkiler ve zincir uzunluğu dağılımı, çözünürlüğünü26 etkiler. Bu ilişkileri doğru bir şekilde anlamak için, glikojeni, mümkün olduğunca temsili ve hasarsız bir numuneyi izole eden bir prosedürle ekstrakte etmek önemlidir. Geleneksel ekstraksiyon yöntemlerinde ya sıcak alkali koşullar ya da …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, FACE ile teknik yardım için Bay Gaosheng Wu ve Bayan Yunwen Zhu’ya ve SEC ile teknik yardım için Bay Zhenxia Hu ve Bay Dengbin’e minnettardır. Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Programı, Çin Doğa Bilimleri Vakfı hibe C1304013151101138 ve 2017 Jiangsu İnovasyon ve Girişimcilik yetenekleri programı tarafından desteklenmiştir. Şekil 1-5 BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Materials

8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) SIGMA Aldrich 9341 0.1 M solution
Acetic acid SIGMA Aldrich 695092 0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system Agilent, Santa Clara, CA, USA Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) Megazyme K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) SIGMA Aldrich 431788
Homogenizer IKA T 25
Hydrochloric acid SIGMA Aldrich 2104 0.1 M solution
Hydrochloric acid SIGMA Aldrich 2104 0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system Ab Sciex, US Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate SIGMA Aldrich 241245 1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide SIGMA Aldrich S2002
Sodium chloride SIGMA Aldrich S9888
Sodium cyanoborohydride SIGMA Aldrich 156159 1 M solution
Sodium fluoride SIGMA Aldrich 201154
Sodium hydroxide SIGMA Aldrich 43617 0.1 M solution
Sodium nitrate SIGMA Aldrich NISTRM8569
Sodium pyrophosphate SIGMA Aldrich 221368
Sucrose SIGMA Aldrich V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns Polymer Standards Services, Mainz, Germany Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma SIGMA Aldrich T 1503
Ultracentrifuge tubes Beckman 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm

Referanslar

  1. Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M., Freeeman, W. H. . Life: the science of biology. 12th edn. , (2020).
  2. Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
  3. Rybicka, K. K. Glycosomes – The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
  4. Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
  5. Drochmans, P. Morphologie du glycogene – etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
  6. Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
  7. Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
  8. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  9. Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
  10. Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
  11. Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
  12. Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
  13. Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
  14. Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
  15. Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526 (2020).
  16. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  17. Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
  18. Ryu, J. -. H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
  19. Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
  20. Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
  21. Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887 (2020).
  22. Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch – Starke. 72, 1900214 (2020).
  23. Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
  24. Kerly, M. The solubility of glycogen. The Biochemical Journal. 24, 67-76 (1930).
  25. Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
  26. Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
  27. Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
  28. Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination. J. Vis. Exp. (180), e63088, doi:10.3791/63088 (2022).

View Video