Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Abstract

Organoidlerin bağışıklık hücreleri ile karmaşık ko-kültürleri, mukozal homeostazın hassas dengesini destekleyen çift yönlü etkileşimleri sorgulamak için çok yönlü bir araç sağlar. Bu 3D, çok hücreli sistemler, çok faktörlü hastalıkları ele almak ve dokuda yerleşik doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC’ler) gibi nadir hücre tiplerini incelerken ortaya çıkan teknik zorlukları çözmek için indirgemeci bir model sunar. Bu makalede, ince bağırsak organoidlerini ve ince bağırsak lamina propria’dan türetilmiş yardımcı benzeri tip-1 ILC’leri (ILC1’ler) birleştiren ve diğer ILC veya immün popülasyonlara kolayca genişletilebilen bir murin sistemi anlatılmaktadır. ILC’ler, homeostazı teşvik ettikleri ve hasar veya enfeksiyona hızla yanıt verdikleri mukozada özellikle zenginleştirilmiş dokuda yerleşik bir popülasyondur. ILC’lerle organoid ko-kültürleri, bağırsaktaki yeni epitelyal-immün sinyal modüllerine ışık tutmaya başlamış ve farklı ILC alt kümelerinin bağırsak epitel bariyeri bütünlüğünü ve rejenerasyonunu nasıl etkilediğini ortaya koymuştur. Bu protokol, mukozal homeostaz ve inflamasyon mekanizmaları hakkında yeni bilgiler sağlama potansiyeline sahip epitel ve bağışıklık hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimler hakkında daha fazla araştırma yapılmasını sağlayacaktır.

Introduction

Bağırsak epiteli ve bağırsakta yerleşik bağışıklık sistemi arasındaki iletişim, bağırsak homeostazının korunmasında merkezidir¹. Bu etkileşimlerdeki bozulmalar, İnflamatuar Bağırsak Hastalığı (IBD) ve gastrointestinal kanserler dahil olmak üzere hem lokal hem de sistemik hastalıklarla ilişkilidir². Homeostazın yakın zamanda tanımlanan kritik bir düzenleyicisinin dikkate değer bir örneği, bağırsak bağışıklık manzarasında kilit oyuncular olarak ortaya çıkan doğuştan gelen lenfoid hücrelerin (ILC’ler) çalışmasından kaynaklanmaktadır³. ILC’ler, bağırsak homeostazını düzenleyen ve inflamasyonu büyük ölçüde sitokin aracılı sinyalizasyon yoluyla düzenleyen heterojen doğuştan gelen bir immün hücre grubudur⁴.

Murin ILC’ler genel olarak transkripsiyon faktörü, reseptör ve sitokin ekspresyon profillerine göre alt tiplere ayrılır⁵. Sitotoksik Doğal Öldürücü (NK) hücreleri ve yardımcı benzeri tip-1 ILC’leri (ILC1’ler) içeren Tip-1 ILC’ler, sırasıyla T hücrelerinde (T-bet)⁶ ekspresyonlu transkripsiyon faktörü (eomezodermin) Eomes ve T-box proteininin ekspresyonu ile tanımlanır ve T yardımcı tip-1 (T_H1) bağışıklığı ile ilişkili sitokinleri salgılar: interlökin (IL)-12’ye yanıt olarak interferon-γ (IFNγ) ve tümör nekroz faktörü (TNF), IL-15 ve IL-18⁷. Homeostaz sırasında, dokuda yerleşik ILC1’ler, epitel proliferasyonunu ve matris yeniden modellemesini sağlamak için Transforme Edici Büyüme Faktörü β (TGF-β) salgılar⁸. Tip-2 ILC’ler (ILC2’ler) öncelikle helmint enfeksiyonuna T yardımcı tip-2 (T_H2) ile ilişkili sitokinlerin salgılanması yoluyla yanıt verir: IL-4, IL-5 ve IL-13 ve retinoik asitle ilişkili yetim reseptör (ROR) α (ROR-α)⁹ ve GATA Bağlayıcı Protein 3 (GATA-3)^10,11,12 ekspresyonu ile karakterizedir. . Farelerde, bağırsak “enflamatuar” ILC2’ler, epitel tutam-hücresi kaynaklı IL-25 14,15’e yanıt verdikleri Öldürücü hücre lektin benzeri reseptörün (alt aile G üyesi 1^, KLRG)¹³ ekspresyonu ile karakterize edilir. Son olarak, lenfoid doku indükleyici hücreleri ve yardımcı benzeri tip-3 ILC’leri (ILC3’ler) içeren tip-3 ILC’ler, transkripsiyon faktörü ROR-γt^16’ya bağımlıdır ve lokal IL-1β ve IL-23 sinyallerine yanıt olarak Granülosit Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktörü (GM-CSF), IL-17 veya IL-22 salgılayan gruplara ayrılır¹⁷. Lenfoid doku indükleyici hücreler Peyer’in yamalarında kümelenir ve gelişim sırasında bu ikincil lenfoid organların gelişimi için çok önemlidir¹⁸, ILC3’ler ise erişkin murin ince bağırsak lamina propriasında en bol ILC alt tipidir. ILC3’lü en eski murin intestinal organoid ko-kültür sistemlerinden biri, sitokin IL-22’nin Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü 3 (STAT-3) aracılı Lösin Bakımından Zengin Tekrar İçeren G Protein Eşleşmiş Reseptör 5 (Lgr5) ⁺ bağırsak kök hücre proliferasyonu¹⁹ üzerindeki etkisini ayırmak için kullanıldı. rejeneratif ILC-epitel etkileşiminin güçlü bir örneği. ILC’ler organlar arasında damga-heterojenlik sergiler ^20,21 ve polarize edici sitokinlere yanıt olarak alt kümeler arasında plastisite sergiler²². Bu dokuya özgü izleri ve plastisite farklılıklarını yönlendiren ve IBD²³ gibi kronik hastalıklarda hangi rolü oynadıkları, organoid ortak kültürleri kullanılarak ele alınabilecek heyecan verici konular olmaya devam etmektedir.

İntestinal organoidler, intestinal epitel^24,25’i incelemek için başarılı ve güvenilir bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bunlar, bağırsak epitelyal Lgr5 ⁺ kök hücrelerinin veya Wnt Ailesi Üyesi 3A’nın (Wnt3a) endojen bir kaynağı olarak Paneth hücrelerini içeren tüm izole kriptoların kültürlenmesiyle üretilir. Bu 3D yapılar, sentetik hidrojeller^26’da veya bazal lamina propria’yı taklit eden biyomalzemelerde, örneğin Termal-çapraz bağlanan Bazal Hücre Dışı Matriks’te (TBEM) korunur ve ayrıca çevredeki nişi, özellikle Epitel Büyüme Faktörünü (EGF), Kemik Morfogenetik Protein (BMP) inhibitörü Noggin’i ve bir Lgr5-ligand ve Wnt-agonisti R-Spondin1^27’yi taklit eden büyüme faktörleri ile desteklenir. . Bu koşullar altında, organoidler epitelyal apiko-bazal polariteyi korur ve bağırsak epitelinin kript-villus yapısını, organoidin merkezindeki emici ve salgısal hücrelere terminal olarak farklılaşan tomurcuklanan kök hücre kriptleri ile özetler, daha sonra anoikis²⁸ tarafından iç psödölümenin içine dökülür. Her ne kadar bağırsak organoidleri tek başına epitel gelişiminin indirgemeci modelleri ve izolasyondaki dinamikler olarak büyük ölçüde avantajlı olsa da^29,30, bu davranışların bağışıklık bölmesi tarafından nasıl düzenlendiğini^, etkilendiğini ve hatta bozulduğunu anlamak için muazzam bir gelecek potansiyeline sahiptir.

Aşağıdaki protokolde, murin ince bağırsak organoidleri ve lamina propria türevi ILC1’ler arasında, bu popülasyonun inflamasyonun bağırsak imzalarını beklenmedik bir şekilde nasıl azalttığını ve bunun yerine bu sistemde TGF-β yoluyla epitel proliferasyonunun artmasına katkıda bulunduğunu tanımlamak için kullanılan bir ko-kültür yöntemi tanımlanmıştır⁸.

Protocol

Tüm deneyler, hayvan kullanımı için ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal yönergelere uygun ve uygun olarak tamamlanmalıdır. Aşağıdaki makale ve videoda açıklanan çalışma için etik onay, hayvan kullanımına ilişkin ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal kılavuzlara uygun ve uygun olarak alınmıştır. Tüm fareler, eğitimli bireyler tarafından yürütülen standart etik prosedüre göre servikal çıkık ile itlaf edildi. Organ ve doku toplanmasından önce, femoral arterin dilimlenmesi veya dekapitasyon, ölümün doğrulayıcı değerlendirmeleri olarak (eldeki protokole uygun olarak) gerçekleştirildi. Hayvanlar, Birleşik Krallık Hayvanları (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 (Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı Proje Lisansı (PPL:70/7869 – Eylül 2018; Eylül 2018’den itibaren P9720273E). 1. Murin ince bağırsak organoidlerinin kurulması NOT: Protokolün bu bölümü, murin ince bağırsağından bağırsak organoidlerinin oluşumunu açıklar. Kriptolar ilk önce dokudan izole edilir, TBEM’de yeniden askıya alınır ve daha sonra EGF, Noggin ve R-Spondin (ENR) içeren ortamlarla inkübe edilir. Murin ince bağırsak organoidlerinin kurulması da başka yerlerde iyi tanımlanmıştır24,25,27. TBEM’yi çözülmesi için buz üzerine yerleştirin (40 μL / kuyu) ve önceden ısıtmak için 37 ° C’lik bir inkübatöre standart bir doku kültürü işlenmiş (hidrofilik ve negatif yüklü bir yüzeye sahip plakaları ifade eder) 24 delikli bir plaka koyun.NOT: 500 μL TBEM yaklaşık 2-4 saat içinde çözülür; oda sıcaklığında bırakmayın. Bazal ortama EGF, Noggin ve R-Spondin ekleyerek (Tablo 1) ENR ortamının kuyusu başına ~ 4 mL veya 550 mL hazırlayın ve 37 ° C’lik bir inkübatöre yerleştirin. 6-12 haftalık bir hayvanı öldürün ve forseps ve mikrodiseksiyon makası kullanarak ince bağırsağı diseke edin. Buz üzerine 15 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içine yerleştirin. Mide ve caecum’u oryantasyon noktaları olarak kullanarak, ince bağırsağın istenen bölgesini (duodenum, jejunum veya ileum) izole edin. Bu protokolde, ileum izole edilir. Bağırsağı PBS’de buz üzerinde 10cm2’lik bir Petri kabına batırın. Forseps kullanarak, bağırsaktan yağları nazikçe ama tamamen çıkarın. Mikrodiseksiyon makası kullanarak dokuyu uzunlamasına kesin (tercihen delinmeyi önlemek için yuvarlak uçlarla). Bağırsağı PBS’ye batırılmış halde tutmak, dışkı maddesini çıkarmak için sallayın ve doku oryantasyonunu izlemek için mukoza tarafını yukarı doğru tutun. Dokuyu buz üzerindeki bir Petri kabının kuru kapağına aktarın ve bağırsak mukozasını / villus tarafını yukarı doğru yerleştirin. Bağırsağın bir ucunu forsepslerle tutarak, temiz bir cam slaytın açılı kenarını kullanarak mukusları hafifçe kazıyın. Tabağı buz gibi soğuk PBS ile doldurun ve dokuyu durulayın. Dokunun plastiğe yapışmasını önlemek için 50 mL’lik bir tüpü PBS2 (PBS +% 2 FCS; bakınız Tablo 1) ile önceden kaplayın ve bu tüpe 10 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin. Bağırsağı küçük (~ 2 mm) segmentlere kesin ve PBS2 ile önceden kaplanmış 50 mL tüpe aktarın. PBS2 ile önceden kaplanmış 25 mL’lik bir pipet kullanarak, doku parçalarını temizlemek için segmentleri 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Segmentlerin 15-30 sn’ye yerleşmesine izin verin, PBS süpernatantını çıkarın ve atın ve çözüm netleşene kadar (yaklaşık 3-4 kez) 1.10 ve 1.11 adımlarını tekrarlayın. Segmentlerin PBS süpernatantını yerleştirmesine ve atmasına izin verin. 30 mL buz gibi soğuk kript izolasyon tamponu ekleyin (Tablo 1). Tüpleri 4 ° C’de 30 dakika boyunca 30-60 rpm’de (veya yumuşak) yatay bir silindir veya rocker üzerine yerleştirin. Daha yüksek hızlarda, daha yüksek sıcaklıklarda veya daha uzun sürelerde inkübe etmeyin, çünkü kriptler erken yerinden çıkacak ve daha düşük canlılık ve verime sahip tek hücreler haline gelecektir.NOT: Bu aşamadan itibaren, tüm prosedürler steril malzemeler ve reaktifler kullanılarak aseptik bir ortamda yapılmalıdır. Bağırsak segmentlerinin 50 mL tüpün tabanına yerleşmesine izin verin. Yerleşmiş segmentleri bozmadan kript izolasyon tamponunu çıkarın ve buz üzerinde 50 mL’lik bir tüpe aktarın.NOT: Şifreleme yalıtım işlemi çok titizse, bu kesirde kriptler görülebilir. Bu nedenle yedek olarak tutulabilir, ancak protokolün sonunda en uygun şekilde atılacaktır. Bağırsak segmentlerine 20 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin. PBS2 ile önceden kaplanmış 25 mL’lik bir pipet kullanıldığında, pipet bağırsakları 5-8 kez yukarı ve aşağı segmentlere ayrılır. Segmentlerin 30 s’ye yerleşmesine izin verin. PBS2 ile 50 mL’lik bir tüp ve 25 mL’lik pipeti önceden kaplayın. Bu pipeti kullanarak, süpernatantı (fraksiyon 1) önceden kaplanmış 50 mL tüpe toplayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.NOT: Bu fraksiyon, kalan kript izolasyon arabelleğini durulamaya yarar. Bununla birlikte, ek bir kalite kontrol adımı olarak da hizmet eder; pipetleme çok kuvvetli olsaydı, bu durulama fraksiyonunda kriptler bol miktarda olurdu ve eğer çok yumuşaksa, bu fraksiyonda çok az döküntü olurdu. Optimal olarak, fraksiyon 1, protokolün sonunda atılır, ancak aşağıda elde edilen fraksiyonlar 2-4 ile ilgili sorunlar ortaya çıkarsa organoidler yapmak için kullanılabilir. 1,15 ve 1,16 numaralı adımları tekrarlayın, ancak 20 mL yerine 10 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve süpernatantı PBS2 (fraksiyon 2) ile önceden kaplanmış 50 mL’lik taze bir tüpe yerleştirin. Adım 1.17’yi iki kez daha tekrarlayın, ancak fraksiyon 2-4’ü elde etmek için elde edilen süpernatantı fraksiyon 2 ile (adım 1.17’den aynı 50 mL tüpe kadar) birleştirin. Bu tek 50 mL’lik tüp, yerinden çıkmış kriptleri 30 mL buz gibi soğuk PBS’de içermelidir. Havuzlanmış 2-4 fraksiyondan 50 μL’lik bir aliquot’u çıkarın ve bir kapak kapağına yerleştirin. Ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak epitel kriptlerinin varlığını değerlendirin.NOT: Kriptolar yoksa, kriptolar serbest bırakılana kadar pipetleme sırasında daha fazla kuvvet kullanarak 1.17 ve 1.18 numaralı adımları tekrarlayın. Kriptoların, adım 1.14’teki kript yalıtım arabelleğinde veya adım 1.16’daki kesir 1’de zamanından önce yerinden çıkmadığından emin olun. PBS2 ile 100 μm’lik bir süzgeci ve 50 mL’lik bir tüpü önceden kaplayın. Havuzlanmış kript fraksiyonlarını bu süzgeçten ve önceden kaplanmış 50 mL tüpe geçirin. Gergin kript fraksiyonlarını 300 x g’de 4 ° C’de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı atın ve kriptleri 10 mL buz gibi soğuk Gelişmiş DMEM / F12’de yeniden askıya alın. Kriptleri 15 mL’lik bir tüpe taşıyın. Tek hücreleri ve lenfositleri çıkarmak için 210 x g’de kriptleri 4 ° C’de 5 dakika boyunca döndürün. Kriptoları 1 mL buz gibi soğuk Gelişmiş DMEM/F12 içinde yeniden askıya alın. 10 μL’lik bir aliquot’u çıkarın ve bir kapak kapağına yerleştirin. Ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak, kript konsantrasyonunu belirlemek için kript sayısını sayın. ~400 ve ~1.500 şifreleme için gereken hacmi hesaplayın. Bir p1000 ucunu PBS2 ile önceden kaplayın ve gerekli hacimleri (~400 ve ~1.500 kript içeren) ayrı 1,5 mL tüplere pipetlemek için bu ucu kullanın. Kriptleri 300 x g’de 4 ° C’de 5 dakika boyunca döndürün. Mümkün olduğunca fazla süpernatant çıkarın ve ardından kriptleri buz üzerine yerleştirilmiş 80 μL TBEM’de yeniden askıya alın (12 ° C’de meydana gelen matris jelleşmesini önlemek için pipet uçlarını 4 ° C’de önceden soğutun). Adım 1.1’e yerleştirilen 24 delikli plakayı inkübatörden çıkarın. Düz ama 3D kubbe yapısı oluşturmak için yavaş, dairesel bir hareketle 40 μL kriptleri bir kuyunun ortasına veya üç ayrı küçük kubbeye yavaşça pipetleyin.NOT: Organoidlerin yaşayabilirliği, besin maddelerinin ve gazların daha az etkili bir şekilde nüfuz ettiği kubbenin merkezinde en düşükolanıdır 31; Bu nedenle, net 3D yapıları korurken medyaya maruz kalan yüzey alanını en üst düzeye çıkarmak kritik öneme sahiptir. Kuyu başına ~200 kript yoğunluğa sahip toplam iki kuyu ve kuyu başına ~750 kript yoğunluğa sahip iki kuyu daha oluşturmak için adım 1.29’u tekrarlayın. Plakayı doğrudan15-20 dakika boyunca bir inkübatöre (37 ° C ve% 5 CO 2) yerleştirin, viskoz ancak yine de sıvı matris kubbelerini bozmamaya dikkat edin. Kuyu başına 550 μL önceden ısıtılmış ENR ortamı ekleyin (adım 1.2’den itibaren) ve 37 °C ve% 5 CO 2’de24 saat boyunca inkübe edin. Bu aşamada, dokudan yeni izole edilmiş kriptlerin organoid üretiminin verimini ve verimliliğini artırmak için, izolasyon sonrası kültürün ilk 24 saati için 5 μM Wnt agonisti (CHIR 99021) ve 5 μM Rho Kinaz inhibitörü (Y-27632) ile ENR ortamının desteklenmesi önerilmektedir.NOT: Kriptolar 24 saat içinde yuvarlatılmış yapılar oluşturacak şekilde kapanmalı ve kript tomurcukları 2-4 gün içinde görünmelidir (Şekil 1A). Adım 1.31’de inkübasyonun sonunda taze ENR ortamı ile değiştirin ve daha sonra her ~ 2 günde bir veya kültür ortamındaki fenol pH göstergesi soluk turuncuya döndüğünde, ancak sarıya dönmeden önce. 2. Murin ince bağırsak organoidlerinin bakımı NOT: Protokolün bu bölümü, murin ince bağırsak organoidlerinin bakımını ve geçişini açıklamaktadır. Organoidler önce hasat edilir ve daha sonra bükülmüş bir p1000 ucu kullanılarak mekanik olarak bozulur. Bu işlem, çok sayıda kriptten oluşan büyük organoidleri, genişleme için birden fazla küçük parçaya ayırır ve psödolümende biriken ölü hücreleri serbest bırakır. Murine ince bağırsak organoid bakımı da başka yerlerde iyi tanımlanmıştır24,25,27. Tüm prosedürler steril malzemeler ve reaktifler kullanılarak aseptik bir ortamda yapılmalıdır. Organoidlerin patlamasından önce, organoidlerin patlamasından önce, organoidlerin her 4-5 günde bir geçmesi veya genişletilmesi, organoid lümende önemli miktarda döküntü birikmesinden kaynaklanır. Organoidler, organoid yoğunluğuna bağlı olarak 1: 2-1: 3 oranında geçirilebilir, bu da optimal olarak kuyu başına 100-200 organoid arasında olacaktır. Adım 1.1 ve 1.2’de olduğu gibi, TBEM’i buz üzerinde çözün (40 μL / kuyu) ve ENR ortamını hazırlayın (kuyu başına 550 μL). Orta ve standart doku kültürü ile muamele edilmiş 24 delikli plakayı 37 °C’lik bir inkübatöre yerleştirin. Organoidler içeren plakayı inkübatörden çıkarın. Medyayı geçilecek kuyudan atın. Kuyuya 500 μL buz gibi soğuk Advanced DMEM/F12 ekleyin. Bir p1000 uç kullanarak (organoidin ucun içine yapışmasını önlemek için ortamla önceden kaplanmış), organoidleri 15 mL’lik bir tüpe toplayın. Kuyunun dibini 250-300 μL buz gibi soğuk Gelişmiş DMEM/F12 ile durulayın ve kuyuda hiçbir organoidin kalmamasını sağlayın ve adım 2.3’ten itibaren hasat edilen organoidleri içeren 15 mL tüpe havuzlayın. Birden fazla kuyuyu geçirirken 2.3 ve 2.4 numaralı adımları tekrarlayın ve organoidleri birden fazla kuyudan aynı 15 mL tüpte toplayın. Organoidleri 4 ° C’de 3 dakika boyunca 300 x g’de döndürün. Santrifüjleme üzerine, dört görünür fraksiyon olduğundan emin olun: sağlıklı organoidlere sahip bir baz fraksiyon, merkezi ve berrak bir matris fraksiyonu, tek ve ölü hücreler içeren bir matris fraksiyonu ve tek ve ölü hücreler içeren bir üst süpernatant tabaka. Süpernatantı, enkaz fraksiyonunu ve berrak matris parçasının mümkün olduğunca çoğunu organoidlerin peletini bozmadan çıkarın. Bir p1000 pipet ucunun ucunu yavaşça bükün (yaklaşık 2-5 mm bükün). Bu ucu PBS2 veya Advanced DMEM/F12 ile önceden kaplayın. Bu ucu kullanarak, organoidleri ve kalan matrisi mekanik olarak bozmak için organoidleri 10-20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 4 ° C’de 3 dakika boyunca 210 x g’de döndürün. Adım 2.6’da olduğu gibi, ayrışmış kriptlerin peletini bozmadan süpernatantı, enkaz fraksiyonunu ve berrak matris parçasının mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Sağlıklı kriptler veya küçük organoidler berrak bir pelet oluşturmamışsa, 4 ° C’de 3 dakika boyunca 300 x g’de tekrar santrifüj yapın. Gerekli TBEM hacmini hesaplayın (1:2 veya 1:3 pasaj oranının kullanılıp kullanılmadığına bağlı olarak hasat edilen organoidlerin kuyusu başına 80-120 μL). Peleti hesaplanan TBEM hacminde yeniden askıya alın ve bir kubbe oluşturmak için önceden ısıtılmış 24 delikli plakaya kuyu başına 40 μL uygulayın. Plakayı 15-20 dakika boyunca doğrudan inkübatöre (37 ° C; % 5 CO2) yerleştirin. Kuyu başına 550 μL ENR ortamı ekleyin ve 37 °C ve% 5 CO2’de inkübe edin. 24 saat sonra organoid oluşumu için kültürleri kontrol edin. Geçişten sonraki her 2-3 günde bir taze ENR ortamı ile değiştirin. 3. İnce bağırsak lamina propria doğuştan gelen lenfoid hücrelerin izolasyonu NOT: Protokolün bu bölümü, ILC1’in RORγtGFP muhabir farelerinin murin ince bağırsak lamina propriasından izolasyonunu açıklamaktadır. Bu, epitel hücresinin çıkarılmasını, doku sindirimini, lenfositlerin yoğunluk gradyanı ayrılmasını ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralaması (FACS) yoluyla ILC1 izolasyonunu içerir. Şekil 2’deki geçit stratejisini takip eden FACS izolasyonu, makine için Tablo 2 ve Tablo 3’te açıklanan ek boyama kontrolleri (Tablo 2) ve geçit (Tablo 3) kurulumu ile hücre dışı boyama mastermix’ini (Tablo 4) gerektirir. RORγt GFP muhabir fareleri, canlı, saf ILC1’i izole etmek ve RORγtGFP + ILC3’ü dışarı atmak için kullanılır. Lamina propria lenfositlerin izolasyonu için doku işleme başka yerlerde de iyi tanımlanmıştır32. Doku işlemeNOT: Bireysel biyolojik hayvan replikasyonlarından elde edilen dokular bu protokolde ayrı tutulur. Bu numuneler uygun şekilde etiketlenmeli ve mümkün olduğunda buz üzerinde tutulmalıdır. Sindirim enzimleri dışındaki tüm reaktiflerin, hızlı doku sindirimi sağlamak için oda sıcaklığına ulaşmasına izin verilmelidir. Çözülmesi için TBEM’yi buzun üzerine yerleştirin (40 μL / kuyu). Önceden ısıtmak için 37 ° C’lik bir inkübatörde standart bir doku kültürü işlenmiş 24 kuyucuklu plaka tutun. Taze epitel giderme tamponu ve sindirim tamponu hazırlayın (bakınız Tablo 1). İzotonik düşük viskoziteli yoğunluklu gradyan ortamı (LVDGM) (% 90 LVDGM ve% 10 10x PBS), % 40 izotonik LVDGM ve% 80 izotonik LVDGM’yi nötralize edici tamponda hazırlayın (Tablo 1). 6-12 haftalık bir hayvanı öldürün, forseps ve mikrodiseksiyon makası kullanarak ince bağırsağı diseke edin ve bağırsağı buz üzerinde 15 mL PBS’ye yerleştirin. Bağırsağı PBS’de buz üzerinde 10cm2’lik bir Petri kabına batırın ve yağları bağırsaktan nazikçe ama tamamen çıkarmak için forseps kullanın. Peyer’in yamalarını (~ 5-10; yağ dokusu çizgisinin tersi bir çizgide koşan) lenfoid doku indükleyici hücreleri ve B hücrelerini tüketmek için mikrodiseksiyon makası kullanarak çıkarın.NOT: Peyer’in yamaları Rag-/- ve diğer soy tükenmiş hayvanlarda yoktur. Hava kabarcıklarının aksine, Peyer’in yamaları dürtüldüğü takdirde yerinde kalacaktır. Mikrodiseksiyon makası kullanarak dokuyu uzunlamasına kesin (tercihen delinmeyi önlemek için yuvarlak uçlarla). Bağırsağı PBS’ye batırılmış halde tutarak, dışkı maddesini çıkarmak için çalkalayın. Dokuyu 2-4 cm uzunluğunda parçalara bölün ve 50 mL’lik bir tüpe aktarın. Yaklaşık 20-40 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve mukoza ve kalıntıları gidermek için 5-15 s boyunca kuvvetlice çalkalayın. Tüpün içeriğini taze bir Petri kabına atın ve forseps kullanarak bağırsak parçalarını aynı 50 mL tüpe yerleştirin. 3.1.8 ve 3.1.9 adımlarını 3-4 kez veya PBS temizlenene kadar yineleyin. Epitel çıkarılması Bağırsak parçalarını buz üzerinde taze bir Petri kabına yerleştirin. Forseps kullanarak, bağırsak segmentlerini toplayın ve kuru bir yüzeye dokunarak fazla sıvıyı çıkarın. Dokuyu ~ 0.75-1 cm parçalara bölün ve taze bir 50 mL tüpe aktarın. 5-7 mL epitel çıkarma tamponu ekleyin (Tablo 1). Tüpü vorteks edin ve tüm bağırsak segmentlerinin tampona batırıldığından emin olun. Numuneleri 37 °C’de 12-15 dakika boyunca sallanarak (100-150 rpm) inkübe edin. Tüpü 20-30 s için vorteks. 3.2.1-3.2.3 adımlarını bir kez daha tekrarlayın, bulutlu süpernatantı (fraksiyon epitel ve epitel içi hücreleri içerir) atın ve taze epitel çıkarma tamponu ile değiştirin. Dokunun sindirimi İçeriği taze bir Petri kabına aktarın. Forseps kullanarak, bağırsak segmentlerini toplayın ve fazla sıvıyı atmak için kuru bir yüzeye dokunun. Parçaları buz üzerinde taze bir Petri kabına yerleştirin. Segmentleri Petri kabının merkezine yoğun bir kütle halinde kümeleyin. İki neşter veya keskin makas kullanarak, dokuyu bir p1000 pipet ucundan geçebilecek viskoz bir kıvama ulaşana kadar ince bir şekilde parçalayın. Cımbız kullanarak, kıyılmış dokuyu temiz bir 50 mL tüpe yerleştirin. Petri kabını, kalan dokuları toplamak için 1-2 mL sindirim tamponu (Tablo 1) ile durulayın ve parçalanmış doku ile 50 mL tüpe koyun. Parçalanmış dokuya 5-7 mL sindirim tamponu ekleyin ve tüm dokunun tüpün dibinde toplandığından emin olun. Numuneleri 37 °C’de, 15 dakika boyunca orta sallanma (~ 100-150 rpm) ile inkübe edin. Sindirime yardımcı olmak için tüpü her 5 dakikada bir 20-30 s vorteksleyin. Numuneler inkübe edilirken, her numune için taze 50 mL’lik bir tüpün üzerine 40 μm’lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Filtreleri 1-2 mL nötralize edici tamponla kaplayın (Tablo 1). Kuluçka bittikten sonra numuneleri 20-30 sn boyunca vorteksleyin. Kısmen sindirilmiş dokuyu kaplanmış 40 μm filtreden nötralize edici tampon içeren 50 mL tüpe filtreleyin. 40 μm filtreden sindirilmemiş dokuyu toplamak için cımbız kullanın ve ikinci sindirim turu için sindirimin yapıldığı 50 mL tüpe geri yerleştirin. Filtreleri çıkarın ve filtreye yapışan sindirilmemiş dokuları yerinden çıkarmak için sindirim tamponu ile durulayın. Filtreden mümkün olduğunca fazla sindirilmemiş doku çıkarıldıktan ve sindirimin yapıldığı 50 mL tüpe geri yerleştirildikten sonra, filtreyi, filtrelenmiş süpernatanı içeren 50 mL tüp üzerinde 1-2 mL nötralize edici tamponla durulayın. Filtrelenmiş süpernatanta 20-25 mL nötralize edici tampon ekleyin ve doku sindiriminin ikinci turu sırasında izole hücrelerin yaşayabilirliğini korumak için buzun üzerine yerleştirin. Sindirilmemiş dokuya 5-10 mL daha sindirim tamponu ekleyin ve 3.3.5-3.3.10 adımlarını tekrarlayın, böylece sindirilen dokunun adım 3.3.8’de kullanılanla aynı tüpe filtrelenmesini sağlayın (aynı filtre yeniden kullanılabilir). Filtreyi 50 mL çizgisine ulaşana kadar nötrleştirici tamponla durulayın ve ardından sindirilmemiş kalan dokuları atın. Yoğunluk gradyanı ile lenfosit izolasyonu Her biyolojik replikasyon için toplanan süpernatantları 10 dakika boyunca 500 x g’da döndürün. Adım 3.4.1 sırasında, her biyolojik replikasyon için 15 mL’lik bir tüpe 5 mL% 80 izotonik LVDGM ekleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı filtrelenmiş, sindirilmiş dokudan atın. Peletin 10 mL% 40 izotonik LVDGM’de yeniden askıya alınması, peletin iyi homojenize edilmesini ve büyük parçaların kalmamasını sağlayın. Pipet yardımını en yavaş ayarına getirerek, izotonik LVDGM içeren 15 mL’lik tüpü eğin ve 10 mL’lik hücre süspansiyonunu izotonik LVDGM’de çok nazikçe kaplayarak hücre süspansiyonunun fraksiyonla karışmamasını sağlayın.NOT: Fraksiyonların yanlışlıkla karışması durumunda, PBS ile doldurulmuş iki 50 mL tüp arasında% 80 fraksiyona ulaşan lenfositleri hızla dağıtın ve 500 x g’da 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Ardından, süpernatanı atın ve 3.4.3-3.4.4 arasındaki adımları yineleyin. Boruları 900 x g ve 20 ° C’de döndürün, fraksiyonların bozulmamasını sağlamak için hızlanma ve ivmelenme en düşük ayara ayarlayın. 20 dakika santrifüj (mola süresi dahil değildir).NOT: Bu adımdan itibaren tüm prosedürler steril malzemeler ve reaktifler kullanılarak aseptik doku kültürü davlumbazında yapılmalıdır. PBS2 ile her numune için 50 mL’lik bir tüpün ön kaplamasını yapın ve 45 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, üst döküntü tabakasını 15 mL tüpten yavaşça çıkarın. Bir p1000 ucunu PBS2 ile kaplayın ve% 40-80 gradyanlar arasındaki lenfosit yüklü interfazı, 45 mL buz gibi soğuk PBS içeren 50 mL tüpe toplamak için kullanın. Tüpleri 300 x g’de 4 ° C’de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı atın ve peleti 500 μL FACS tamponunda (PBS,% 2 FCS, 0,5 mM EDTA ve 10 mM HEPES; bakınız Tablo 1) yeniden askıya alın. 40 μm’lik bir filtreyi FACS tamponu ile önceden kaplayın ve hücre süspansiyonunu bir akış tüpüne filtrelemek için kullanın. 50 mL’lik tüpü ilave 500 μL FACS tamponu ile durulayın ve aynı akış tüpüne süzün. Elde edilen 1 mL hücre süspansiyonundan 10 μL’lik bir aliquot’u çıkarın. Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak lenfosit verimini sayın ve her örnek için hücre konsantrasyonunu hesaplayın. Ayıklama için numune hazırlama – hücre dışı boyamaNOT: Hücre dışı boyama mastermix’inde kullanılan antikorların yanı sıra sabitlenebilir canlılık boyasını ve Fc blok çözeltisini hazırlamak için reaktifler, 5 x 10’a kadar yeterli konsantrasyonlarda kullanılır.6 100 μL başına hücreler Hacimler buna göre ayarlanmalıdır. ILC1’i sıralamak için FACS makine kompanzasyonu için, hücre dışı boyama mastermix’indeki floroforların her biri için tek renkli kontroller gereklidir. Antikorlar için, pozitif antikor bağlayıcı boncuk popülasyonu ve negatif antikor bağlayıcı olmayan boncuk popülasyonu içeren kompanzasyon boncukları kullanılabilir. Ultraviyole (UV) sabitlenebilir canlılık boyası tek renk kontrolü için, amin-reaktif (pozitif sinyal için) ve reaktif olmayan (negatif sinyal için) popülasyonlar içeren kompanzasyon boncukları kullanılabilir. Hücrelerden hücrelerin kullanılması önerilmez. RORγtGFPUV sabitlenebilir canlılık boyası için muhabir fareler tek renk kontrolü için, bu hücreler bir GFP içerecektir.+ sinyal.Her numuneden ~ 10 μL’lik küçük bir aliquot çıkarın ve 250 μL FACS tamponu içeren ayrı bir akış tüpünde toplayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Bu, lekesiz kontrol için kullanılacaktır. Numune tüplerinde kalan hacme 1 mL PBS ekleyin. 3-5 dakika boyunca 300-400 x g’de santrifüj. Numune başına 200 μL UV sabitlenebilir canlılık boya çözeltisi hazırlayın. UV ile sabitlenebilir canlılık boyasını seyreltin (üreticinin talimatlarını izleyerek DMSO’da yeniden askıya alınır) PBS’de 1:500 (veya üreticinin talimatlarını izleyerek). Süpernatantı atın ve numuneleri 200 μL UV sabitlenebilir canlılık boya çözeltisinde yeniden askıya alın. Tüpleri vorteks edin ve karanlıkta 4 ° C’de 10-15 dakika kuluçkaya yatırın. UV sabitlenebilir canlılık boyasını, 10 s vorteksi söndürmek için tüplere 2 mL FACS tamponu ekleyin ve tüpleri 4 ° C’de 3-5 dakika boyunca 300-400 x g’de santrifüj edin. Süpernatantı santrifüjlü tüplerden atın. Numune başına 200 μL Fc blok çözeltisi hazırlayın (FACS tamponunda 0,25 mg/mL Fc bloğu). Adım 3.5.5’teki numunelerin her birine 200 μL Fc blok çözeltisi ekleyin, 10 s vorteks yapın ve karanlıkta 4 ° C’de 10 dakika boyunca inkübe edin. Yeni bir akış tüpüne 500 μL FACS tamponu ekleyin. Her numuneden 2-5 μL’lik bir aliquot çıkarın ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri için tüpe koyun. FMO tüpünü 10 sn boyunca vorteksleyin ve FMO kontrollerinin her biri için etiketlenmiş taze akış tüplerine eşit olarak (tüp başına 100 μL) dağıtın (Lineage kokteyli FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO ve NK1.1 FMO; bakınız Tablo 3). İlgilenilen antikor dışındaki tüm antikorları her tüpe ( Tablo 3’te açıklandığı gibi) ve 10 s için vortekse ekleyin. FMO kontrollerini karanlıkta 4 °C’de bir kenara koyun. Numuneleri (FMO kontrolleri değil) 4 °C’de 3-5 dakika boyunca 300-400 x g’de santrifüj yapın. Hücre dışı boyama mastermix’ini (numune başına 200 μL) Tablo 4’te açıklandığı gibi son antikor dilüsyonlarıyla hazırlayın. 3.4.10 adımındaki hücre sayımlarına bağlı olarak uygun hücre konsantrasyonu için boyama hacmini ayarlayın (100 μL başına 5 x 106 hücreye kadar). Numunelere hücre dışı boyama mastermix’i ekleyin, 10 sn boyunca vorteks yapın ve bunları karanlıkta 4 ° C’de bir kenara koyun. Geçit stratejisinde kullanılması amaçlanan her antikor için yeni bir tek renk kontrolü hazırlayın (Şekil 2). 20 s için vorteks antikor kompanzasyon boncukları, bir akış tüpüne 1 damla boncuk ekleyin, 0.5 μL antikor ile lekeleyin ( Tablo 2’de gösterildiği gibi veya üreticinin talimatlarını izleyerek) ve 10 s için vorteks. Amin-reaktif kompanzasyon boncuk kiti kullanarak UV ile sabitlenebilir bir canlılık boyası tek renk kontrolü hazırlayın. 20 sn için vorteks amin-reaktif kompanzasyon boncukları, 1 μL Canlı / Ölü UV boyası ( Tablo 2’de gösterildiği gibi veya üreticinin talimatlarını izleyerek) ve 10 s için vorteks ekleyin. Numuneleri, FMO’ları ve tek renk kontrollerini karanlıkta 4 °C’de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında, sıralanmış hücreleri toplamak için tüpler hazırlayın. Her numune için Gelişmiş DMEM/F12’de 400-500 μL FBS ila 1,5 mL tüpler ekleyin. Kuluçkadan sonra, numunelerin, FMO kontrollerinin ve tek renk kontrollerinin her birine 2 mL PBS2 ekleyin. Numuneleri, FMO kontrollerini ve tek renk kontrollerini 300-400 x g’de 4 °C’de 3-5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı tüm santrifüjlü tüplerden atın. Numuneleri ve FMO kontrollerini 250 μL FACS tamponunda ve vorteksinde 10 saniye boyunca yeniden askıya alın. Tek renk denetimlerini 250 μL PBS2’de yeniden askıya alın. Sadece UV ile sabitlenebilir canlılık boyası tek renk kontrolüne 1 damla amin reaktif olmayan boncuk ekleyin. Vortex 10 s için tüm kontroller. Hücreler artık sıralanmaya hazırdır. Hücre canlılığını artırmak ve fotobeyazlatmadan kaynaklanan sinyal kaybını önlemek için numuneleri, FMO kontrollerini ve buz üzerindeki tek renk kontrollerini mümkün olduğunca karanlıkta tutun. 4. İnce bağırsak organoidlerinin doğuştan gelen lenfoid hücrelerle birlikte kültürü NOT: Bu bölümde, sıralanmış murin ince bağırsak ILC1’in (bölüm 3’teki protokolü takiben izole edilmiş) murin ince bağırsak organoidleri (bölüm 1 ve 2’de tanımlanmıştır) ile ortak kültürü açıklanmaktadır. Organoidler pasajdan 1-2 gün sonra en uygun şekilde kullanılmalıdır. Ko-kültür, organoidlerin toplanmasını, uygun sayıda ILC1’in eklenmesini, pelet organoidlerine ve ILC1’e birlikte santrifüj yapılmasını ve TBEM’de yeniden askıya alınmasını içerir. ILC1 izole edildikten sonra bu bölümü mümkün olan en kısa sürede tamamlayın. Tüm prosedürler steril malzemeler ve reaktifler kullanılarak aseptik bir ortamda yapılmalıdır. Adım 3.1.1’deki TBEM’nin çözüldüğünden emin olun. Adım 2.3 ve 2.4’te açıklandığı gibi 1-2 günlük organoidleri hasat edin. Organoid peleti 1 mL soğuk buz gibi soğuk Advanced DMEM / F12’de yeniden askıya alın. Organoidleri geçerken olduğu gibi p1000 ucunu bükmeyin, çünkü buradaki amaç ko-kültür için organoid yapıyı korumaktır. Gerekirse, organoidleri farklı ko-kültür koşulları arasında dağıtılmak üzere kısa bir süre için ayrı PBS2 kaplı 1,5 mL tüplere buz üzerine yerleştirin.NOT: Organoidlerin hazırlanmasına ancak ILC örnekleri ko-kültür için hazır olduğunda başlayın; epitel hücre ölümünü en aza indirmek için organoidler hasat edilir edilmez buz üzerinde ve hızlı bir şekilde çalışın. ILC çoğaltma numunesi başına PBS2 ile bir adet 1,5 mL tüpü önceden kaplayın. Her tüpe ~ 100-200 organoid (24 delikli bir plakanın yaklaşık 1 kuyucuğu) dağıtın. PBS2’de bir p1000 ucunu önceden kaplayın ve FACS saflaştırmasından sonra ILC1’lerin hacmini değerlendirmek için kullanın (250-300 μL + sıralanmış hacim). Sıralamadan kaydedilen hücre sayısını kullanarak mL başına ILC1 konsantrasyonunu belirleyin ve gerekli hacmi belirleyin. Aynı PBS2 kaplı p1000 ucunu kullanarak, organoidleri içeren PBS2 kaplamalı 1,5 mL tüpe en az 500 ILC1 ekleyin. Sıralamadan elde edilen ILC1 sayısı 500’den azsa, transferden hücre kaybını en aza indirmek için organoidi doğrudan orijinal sıralamayı içeren tüpe ekleyin. ILC1 ve organoidleri 4 ° C’de 5 dakika boyunca 300 x g’de döndürün. Mümkünse, küçük çaplı masa üstü santrifüjlerden kaçının, çünkü bunlar tüpün ucunda bir pelet oluşturmak yerine, hücreleri tüpün iç kenarı boyunca bir araya getirecektir. Hücre sayıları çok düşük olduğu için bu adımlar sırasında hücre kaybını en aza indirmek zorunludur. Pelet’i rahatsız etmeden süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu yavaşça ve nazikçe çıkarın (özellikle organoid olmayan ILC kontrollerinde, gözle görülemeyebilir). Numuneyi buzun üzerine yerleştirin. Soğuk peleti TBEM kuyucuğu başına 30 μL içinde yeniden askıya alın. Tüpü soğuk bir yüzeyde tutarken (örneğin, doku kültürü başlığına yerleştirilmiş küçük bir buz kutusu), eşit dağılımı sağlamak için organoidleri ve ILC’yi en az 10-15 kez karıştırın. Organoidlere zarar vermemek ve kabarcıkların oluşumunu önlemek için sık sık ama nazikçe tritüre edin. Tek bir kubbe oluşturmak için önceden ısıtılmış 24 veya 48 delikli bir plakaya TBEM’deki ILC-organoidlerin kuyucuğu başına 30 μL uygulayın. Plakayı10-20 dakika boyunca doğrudan inkübatöre (37 ° C ve% 5 CO 2) yerleştirin.NOT: Yalnızca ILC ve yalnızca organoid denetimlerinin aşağı akış analizi için ayarlanması önemle önerilir. ILC1 nadirdir, ancak GFP-ILC2 , bilimsel olarak uygun olduğunda immünofloresan veya FSC / SSC akış sitometrisi kontrolleri ile ikame edilebilir. İstenilen herhangi bir deneysel sitokin veya bloke edici antikorlar ile 550 μL (kuyucuk başına) tam ILC1 ortamı (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Merkaptoetanol; bakınız Tablo 1) ekleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C’de ve% 5 CO2’de inkübe edin. 24 saat sonra, plakayı inkübatörden yavaşça çıkarın ve lenfositlerin yerleşmesini sağlamak için plakanın 1 dakika boyunca bir doku kültürü başlığında oturmasına izin verin. 200-250 μL malzemeyi çıkarın ve 24 delikli bir plakanın boş bir kuyucuğuna yerleştirin. Hiçbir lenfositin çıkarılmadığından emin olmak için bu süpernatantı ters çevrilmiş bir mikroskopla kontrol edin. Süpernatant berraksa, orijinal kuyucuktaki ko-kültüre 300 μL taze ILC1 ortamı ekleyin. Süpernatantta lenfositler varsa, 4 ° C’de 3-5 dakika boyunca 300-400 x g’de santrifüj yapın ve 300 μL taze ILC1 ortamında yeniden askıya alın ve bunu orijinal kuyucukta kalan 200-250 μL ortama ekleyin. Medyayı her 1-2 günde bir veya medya soluk turuncu/sarı olduğunda yenilediğinizden emin olun.NOT: Ortamın matris kubbesinin ucunun ortamın yüzeyini kıracak kadar buharlaşmasına izin vermeyin. Her zaman matrisin tamamen suya batırıldığından emin olun. Doku kültürü plakalarında merkezi kuyucuklar kullanılarak ve çevredeki kuyucuklara ~ 600 μL PBS eklenerek aşırı buharlaşma önlenebilir. Yetişkin ILC ile ortak kültürler 1-4 gün boyunca stabildir, bu noktadan sonra büyük bir bozulma olmadan tohumlanan organoidler yırtılır ve yeni kriptolar olarak yeniden tohumlanır. Epitel analiz ediliyorsa, kültürlerin ortak kültürlerin kurulmasından sonraki 1-4 gün içinde analiz edilmesi önerilir. İmmünofloresansı, akış sitometrisi veya FACS kullanarak hedef popülasyonların lizis tamponuna saflaştırılmasını, referans8’de açıklandığı gibi tek hücreli veya toplu RNA-seq veya RT-qPCR ile gen ekspresyon analizi için aşağı akış analizi gerçekleştirin.

Representative Results

Başarılı bir şekilde tamamlandığında, yeni izole edilmiş kriptler 2-4 gün içinde tomurcuklanan kript yapıları oluşturmalıdır (Şekil 1A). Sağlıklı ve sağlam organoid kültürler aktif olarak büyümelidir ve protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi geçirilebilir ve genişletilebilir. Bu protokol, ince bağırsak ILC1’in RORγtGFP murin transgenik raporlayıcı hattından izolasyonunu açıklar ve bu da canlı ILC1’in FACS…

Discussion

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, bağırsak ayrışma protokolü sırasında lenfosit kaybını en aza indirgeyerek nadir ILC1’in izole edilmesi ve bu iki bölme arasında ko-kültürlerin oluşturulması yöntemlerini açıklamaktadır. Bu protokol için birçok adım vardır ve bazıları ILC1’lere özgü olsa da, bu yaklaşım diğer bağırsak bağışıklık hücresi tiplerine uygulanabilir ve ko-kültür kurulumları bireysel araştırma sorularına uyacak şekilde modüler olarak…

Materials

<strong>Reagents</strong>
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-mouse CD45 (BV510)	BioLegend	103137
Anti-mouse NK1.1 (PE)	Thermo Fisher Scientific	12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC)	Thermo Fisher Scientific	17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-0031-82
CHIR99021	Tocris	4423/10
COLLAGENASE D, 500MG	Merck	11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells	Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II)	Merck	4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)	Gibco	11320033
DNASE I, GRADE II	Merck	10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)	Gibco	21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid	Thermo Fisher Scientific	BP2482-100
FC block	2B Scientific	BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated	Gibco	10500064
GlutaMAX (100X)	Gibco	3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14065056
HBSS (1X)	Gibco	12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells	Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710)	Thermo Fisher Scientific	46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Thermo Fisher Scientific	L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetylcysteine (500mM)	Merck	A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7)	Thermo Fisher	25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH	Thermo Fisher Scientific	12549079
PBS (10X)	Gibco	70013032
Percoll	Cytiva	17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein	R&amp;D Systems	AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF	R&amp;D Systems	247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free)	BioLegend	589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free)	R&amp;D Systems	407-ML-005/CF
UltraComp eBeads	Thermo Fisher Scientific	01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)	Bio-techne	1254
<strong>Plastics</strong>
50 mL tube	Falcon	10788561
1.5 mL tube	Eppendorf	30121023
10 mL pippette	StarLab	E4860-0010
15 mL tube	Falcon	11507411
25 mL pippette	StarLab	E4860-0025
p10 pippette tips	StarLab	S1121-3810-C
p1000 pippette tips	StarLab	I1026-7810
p200 pippette tips	StarLab	E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate	Falcon	353047
<strong>Equipment</strong>
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
CO2 and temperature controled incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter	BD equipment	FACS Aria II
Heated shaker	Stuart Equipment	SI500
Ice box	–	–
Inverted light microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette	Eppendorf	3124000016
p1000 pippette	Eppendorf	3124000063
p200 pippette	Eppendorf	3124000032
Pippette gun	Eppendorf	4430000018
Wet ice	–	–