Bu protokol, sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için konfokal bir görüntüleme tekniğini tanımlar. Bu füzyon modları arasında 1) füzyon gözenek açma ve kapama içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) kaynaşmış vezikül büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Dinamik füzyon gözenek açma ve kapama ekzositoz ve endositoza aracılık eder ve kinetiklerini belirler. Burada, konfokal mikroskopinin, primer kültür sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için yama-kelepçe kaydı ile kombinasyon halinde nasıl kullanıldığı ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Üç füzyon modu arasında 1) füzyon gözeneklerinin açılmasını ve kapatılmasını içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) füzyon tarafından üretilen Ω şeklindeki profilin plazma zarında tamamen birleşene kadar büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.
Bu füzyon modlarını tespit etmek için, plazma membranı, plazma zarının sitosol yüzlü broşüründe fosfatidilinositol-4,5-bisfosfata (PtdIns (4,5) P2) bağlanan fosfolipaz C δ (PH-mNG) PH alanı ile tutturulmuş mNeonGreen'i aşırı eksprese ederek etiketlendi; veziküller, veziküler içerik salınımını tespit etmek için floresan yanlış nörotransmitter FFN511 ile yüklendi; ve Atto 655, füzyon gözenek kapanmasını tespit etmek için banyo çözeltisine dahil edildi. Bu üç floresan prob, füzyon gözenek açıklığını, içerik salınımını, füzyon gözenek kapanmasını ve kaynaştırma vezikül boyutu değişikliklerini tespit etmek için canlı kromafin hücrelerinde kare başına ~ 20-90 ms'de aynı anda görüntülendi. Analiz yöntemi, üç füzyon modunu bu floresan ölçümlerinden ayırt etmek için tanımlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, prensip olarak, kromafin hücrelerinin ötesindeki birçok salgı hücresine uygulanabilir.
Giriş
Membran füzyonu, sinaptik iletim, kan şekeri homeostazı, immün yanıt ve viral giriş 1,2,3 dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyona aracılık eder. Plazma zarında vezikül füzyonunu içeren ekzositoz, nöronal ağ aktiviteleri gibi birçok önemli fonksiyona ulaşmak için nörotransmitterleri ve hormonları serbest bırakır. Füzyon, veziküler içeriği serbest bırakmak için bir gözenek açar, bundan sonra gözenek, öp ve çalıştır 1,4 olarak adlandırılan kaynaştırıcı vezikülü almak için kapanabilir. Hem geri dönüşümsüz hem de ger....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Hayvan kullanım prosedürü NIH kurallarına uymuş ve NIH Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Sığır kromafin hücre kültürü
- Locke çözeltisini (Tablo 1) ve otoklav aletlerini kromafin hücre kültüründen 1 gün önce hazırlayın.
- Kültür gününde yerel bir mezbahadan sığır adrenal bezleri alın ve diseksiyondan önce buz gibi soğuk Locke'un çözeltisine batırılmış halde tutun.
NOT: Böbreküstü bezleri, vücut ağırlığı yaklaşık 1.400 pound (~ 635 kg) olan her iki cinsiyetten (çoğunlukla erkek) 21-27 aylık, sağlıklı, siyah Angus'tandır. - Diseksiyondan önce koll....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen deneysel prosedürleri takiben, sığır adrenal bezlerinden kromafin hücreleri, plazma zarını etiketlemek için PH-mNG ile transfekte edildi; Füzyon gözenek kapanmasını tespit etmek için banyo çözeltisine A655 eklendi; ve floresan sahte nörotransmitter FFN511, salınımın tespiti için veziküllere yüklendi. Daha sonra, FFN511, PH-mNG ve A655'in XY düzlemi konfokal timelapse görüntülemesi, hücre tabanında her 20-90 ms'de bir gerçekleştir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Füzyon gözenek ve transmitter salınımının dinamiklerini ve ayrıca sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu, yakın füzyonu, stay-füzyonu ve shrink-füzyonu tespit etmek için konfokal mikroskobik görüntüleme yöntemi tanımlanmıştır 4,24. Hücreyi depolarize etmek ve böylece ekzo- ve endositozu uyandırmak için elektrofizyolojik bir yöntem tanımlanmıştır. Sistematik konfokal görüntü işleme, füzyon ve fisyon olayları için farklı gözenek davranışı modları hakk.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışmayı destekledikleri için NINDS Intramural Araştırma Programlarına (ZIA NS003009-13 ve ZIA NS003105-08) teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Adenozin 5'-trifosfat magnezyum tuzu | Sigma | A9187-500MG | Dahili çözelti hazırlamak için ATP |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Banyo solüsyonunu etiketlemek için Atto boya |
| Primer Nöronlar için Temel Nükleofektör | Lonza | VSPI-1003 | Kit ile birlikte elektroporasyon transfeksiyon tamponu |
| Boroscilicate kılcal cam pipet | Warner Aletler | 64-0795 | Filamentli standart duvar OD = 2.0 mm ID = 1.16 mm Uzunluk = 7.5 cm |
| Sığır serum albümini | Sigma | A2153-50G | Bez sindirimi için reaktif |
| Kalsiyum Klorür 2 M | Kalite Biyolojik | 351-130-721 | Banyo çözeltisi hazırlamak için reaktif |
| Hücre Süzgeçleri, 100 & m | Falcon | 352360 | Kromaffin hücre süspansiyonunu filtrelemek için malzeme |
| Sezyum hidroksit çözeltisi | Sigma | 232041 | Dahili çözelti ve Cs-glutamat/Cs-EGTA stok tamponu hazırlamak için reaktif |
| Kollajenaz P | Sigma | 11213873001 | Bez sindirimi için enzim |
| Lamel | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm çap # 1 kalın 60 adet Laminin kaplamalı Alman lamelleri |
| D-(+)-Glukoz | Sigma | G8270-1KG | Locke'u hazırlamak için reaktif s çözeltisi ve banyo çözeltisi |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Kültür ortamı hazırlamak için reaktif |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Banyo çözeltisi için Cs-EGTA stok tamponu hazırlamak için reaktif |
| Elektroporasyon ve Nükleofektör | Amaxa Biosystems | Nükleofektör II | Plazmitleri hücrelere aktarın |
| Fetal sığır serumu | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Kültür ortamı hazırlamak için reaktif |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Vezikülleri etiketlemek için floresan yanlış nörotransmitter |
| Guanozin 5'-trifosfat sodyum tuzu hidrat | Sigma | G8877-250MG | GTP iç çözelti hazırlamak için |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Locke'u hazırlamak için reaktif s çözümü |
| Igor Pro | WaveMetrics | kelepçesi analizi ve görüntüleme verilerinin sunumu için | Igor pro |
| Leica Application Suite X yazılımı | Leica | LAS X yazılımı | Görüntüleme verilerinin toplanması ve analizi için konfokal yazılım |
| Leica TCS SP5 Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu | Leica | Leica TCS SP5 | Görüntüleme verilerinin toplanması |
| için konfokal mikroskopL-Glutamik asit | Sigma | 49449-100G | Banyo çözeltisi için Cs-glutamat stok tamponu hazırlamak için reaktif |
| Kilitli amplifikatör | Kapasitans kaydı için | Heka | Lock-in |
| Magnezyum Klorür 1 M | Kalite Biyolojik | 351-033-721EA | Dahili çözelti ve banyo çözeltisi hazırlamak için reaktif |
| Metalize Hematitometre Hausser Parlak Çizgi | Hausser Bilimsel | 3120 | Sayma haznesi |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Giga-ohm contaların oluşumunu ve stabilitesini artırmak için Polonya pipetleri |
| Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 & m | Millipore | SLGPR33RB | Bezlerin yıkanması ve sindirimi için malzeme |
| mNG(mNeonGreen) | Alel Biyoteknoloji | ABP-FP-MNEONSB | PH-mNeonGreen inşaat için şablon |
| Naylon örgü filtreleme ekranı 100 mikron | EIKO filtreleme co | 03-100/32 | Medulla süspansiyonunu filtrelemek için malzeme |
| Yama kelepçesi EPC-10 | Heka | EPC-10 | Yama kelepçesi verileri için amplifikatör koleksiyon |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid # 51407 | PH-mNeonGreen inşaat için omurga |
| Pipet çektirme Sutter | Aleti | P-97 | Yama kelepçesi kaydı için pipetler yapın |
| Potasyum Klorür | Sigma | P5404-500G | Locke'u hazırlamak için reaktif s çözeltisi ve banyo çözeltisi |
| Nabız yazılımı | Yama kelepçesi veri toplama için | Heka | Pulse |
| Kayıt odası | Warner Instruments | 64-1943 / QR-40LP | lamel odası, canlı hücrelere yama kelepçesi pipeti uygulayın |
| Sodyum klorür | Sigma | S7653-1KG | Locke'u hazırlamak için reaktif s çözeltisi, banyo çözeltisi ve iç çözelti |
| Sodyum hidroksit | Sigma | S5881-500G | Locke'u hazırlamak için reaktif |
| Sodyum fosfat dibazik | Sigma | S0876-500G | Reaktif |
| Sodyum fosfat monobazik | Sigma | S8282-500G | Reaktif s çözeltisi |
| Sıcak plakanın karıştırılması | Barnsted / Thermolyne | type 10100 | Balmumu ile pipet kaplaması için ısıtıcı |
| Şırınga, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Bezlerin yıkanması ve sindirimi için malzeme |
| Tetraetilamonyum klorür | Sigma | T2265-100G | Banyo çözeltisi hazırlamak için ÇAY |
| Tripsin inhibitörü | Sigma | T9253-5G | Bez sindirimi için reaktif |
| F Tipi Daldırma sıvısı | Leica | 195371-10-9 | Leica konfokal montaj yağı |
Kaynaklar
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
