Özet

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Published: March 03, 2022
doi:

Özet

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

Abstract

Bir omurgalı olarak, zebra balığı biyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı ve insanlar, insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin veren yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar. Gen fonksiyon çalışması, gen ekspresyon paternlerinin tespitine dayanmaktadır. İmmünohistokimya, protein ekspresyonunu test etmek için güçlü bir yol sunsa da, zebra balığında ticari olarak temin edilebilen sınırlı sayıda antikor, costaining uygulamasını kısıtlamaktadır. In situ hibridizasyon, zebra balığı embriyolarında mRNA ekspresyonunu tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, zebra balığı embriyo kesitleri için in situ hibridizasyon ve immünohistokimyayı birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklamaktadır. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. İmmünohistokimya ve tek kriyokesimin görüntülenmesi in situ hibridizasyon sonrası yapıldı. Protokol, iki genin ekspresyon paternini, önce in situ transkript tespiti ve daha sonra aynı bölümdeki bir proteine karşı immünohistokimya ile çözmeye yardımcı olur.

Introduction

Zebra balığı, gelişim ve genetik çalışmaları için güçlü bir omurgalı modelidir 1,2. Zebra balığı ve insanlar yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar (genlerin% 70’i insan genomu ile paylaşılır), bu da insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin verir3. Zebra balığında, iki genin ekspresyon kalıplarını ve mekansal ilişkilerini tespit etmek oldukça yaygındır. İmmünohistokimya ilk olarak 1941’de FITC etiketli antikorlar4 uygulayarak enfekte dokulardaki patojenleri tespit etmek için kullanılmıştır. Doku bölümündeki hedef protein ilk önce birincil bir antikor ile etiketlenir ve bölüm daha sonra birincil antikorun konakçı türü immünoglobuline karşı ikincil bir antikor ile etiketlenir. Antikor boyama, hücre içi düzeyde yüksek optik çözünürlük sunan proteinlerin lokalizasyonunu tespit etmek için sağlam bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, zebra balıklarında mevcut antikorların sayısı çok sınırlıdır. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, fareler için yaklaşık 112.000 antikorun ticari olarak mevcut olduğunu göstermektedir; Bununla birlikte, zebra balığı5’te çok az antikorun güvenilir olduğu gösterilmiştir.

Bunun yerine, zebra balıklarında, in situ hibridizasyon, gen ekspresyon paterni analizi için yaygın olarak uygulanmıştır. Bu yöntem ilk olarak 1980’lerde Drosophila embriyolarında gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır 6,7 ve o zamandan beri bu teknoloji sürekli olarak geliştirilmiş ve iyileştirilmiştir. Başlangıçta, mRNA transkriptlerini tespit etmek için radyoaktif işaretli DNA probları kullanıldı; Bununla birlikte, uzamsal çözünürlük nispeten düşüktü ve radyoaktivitenin neden olduğu potansiyel sağlık riskleri vardı. Daha sonra, in situ hibridizasyon, alkali fosfataza (AP) konjuge edilen veya floresan tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) ile tespit edilen digoxigenin (DIG) veya floresein (Fluo) ile etiketlenmiş RNA problarına dayanır8,9. TSA, iki veya üç geni tespit etmek için kullanılmasına rağmen, RNA problarının DIG etiketlemesi ve antiDIG AP-konjuge antikor, in situ hibridizasyon için hala oldukça hassas, kararlı ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardır. Bu nedenle, DIG etiketli in situ problarla birleştirilen ticarileştirilmiş antikorlar, protein lokalizasyonu ve bir genin ekspresyonu hakkında fikir vermek için yararlıdır.

Tam montajlı embriyolar, zebra balığı embriyoları küçük ve şeffaf10 olmasına rağmen, düşük optik çözünürlük nedeniyle genler arasındaki uzamsal ilişkiyi ortaya çıkaramazlar. Bu nedenle, hücre içi düzeyde genlerin ekspresyon kalıplarını analiz etmek için kesitleme gereklidir. Kriyoseksiyon, zebra balıklarında yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü gerçekleştirilmesi kolaydır ve antijeni etkili bir şekilde koruyabilir. Bu nedenle, zebra balığı kriyoseksiyonlarında immünohistokimya ile kombine edilen in situ hibridizasyon, iki genin ekspresyon modellerini analiz etmek için güçlü bir yol sunar. Zebra balığı11’e in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonu uygulanmıştır. Bununla birlikte, proteinaz K tedavisi, antijen bütünlüğü pahasına prob penetrasyonunu arttırmak için kullanılmıştır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu protokol antijen alımını indüklemek için ısıtma kullanır. Bu protokol sadece farklı aşamalardaki embriyolara ve çeşitli kalınlıklardaki doku kesitlerine (14 μm kafa bölümleri ve 20 μm omurilik bölümleri) uygulanamaz, aynı zamanda baş ve omurilik de dahil olmak üzere iki organda eksprese edilen genler kullanılarak doğrulanmıştır.

Bu makalede, zebra balığı embriyolarında kriyoseksiyonlarda in situ hibridizasyon ve antikor boyamanın nasıl birleştirileceği anlatılacaktır. Bu protokolün çok yönlülüğü, iki farklı nöron için in situ hibridizasyon probları da dahil olmak üzere bir dizi in situ hibridizasyon-immünohistokimya kombinasyonu kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntem, farklı bölgelerdeki mRNA ve proteini ve farklı yaşlardaki embriyoları ve ayrıca iki genin ekspresyon modellerini tespit etmek için uygundur.

Protocol

Tüm hayvan protokolleri Nantong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (No. S20191210-402). 1. Zebra balığı embriyolarının toplanması Yumurtaların toplanmasından önceki gece üreme tanklarında bir çift zebra balığı kurun, biri transgenik zebra balığı ve diğeri AB vahşi tip zebra balığı (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB vahşi tip veya Tg (hb9: egfp) X AB vahşi …

Representative Results

Bu protokol, bir mRNA ve bir proteinin ekspresyon paternini aynı anda incelemek için kullanılabilir. Şekil 1’de deneysel iş akışı gösterilmektedir. 5-HT2C reseptörü, nörotransmitter serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT) tarafından bağlanan 5-HT reseptörünün bir alt tipidir. Merkezi sinir sisteminde (CNS) yaygın olarak dağılmıştır ve iştah, ruh hali, anksiyete ve üreme davranışı dahil olmak üzere çeşitli beyin fonksiyonlarını önemli ölçüde düzenleyebilir<…

Discussion

Bu protokol, zebra balığı embriyoları üzerindeki kolokalizasyon deneylerinde önemli bir adım olan in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonunu önermektedir. Bu yöntem, bir mRNA ve bir proteini aynı anda analiz etmenin kolay ve etkili bir yolu olarak hizmet eder. Zebra balığı embriyolarında in situ hibridizasyon ve antikor boyama yapıldı. Daha önce14,15,16 yayınlanan çeşitli protokollerin aksine,</sup…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Nantong Bilim ve Teknoloji Vakfı (MS12019011), Çin Nantong Bilim ve Teknoloji Vakfı (JC2021058) ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları Doğa Bilimleri Vakfı (21KJB180009) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments Roche 11093274910
Anti-GFP antibody Millipore MAB3580
Blocking solution made in lab N/A 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple Roche 11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma B2064
CaCl2 Sigma C5670
Citrate buffer Leagene IH0305
Citric acid Sigma C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm Head Biotechnology H4566
DEPC-Treated Water Sangon Biotech B501005
Digital camera, fluorescence microscope Nikon NI-SSR 931479
E3 embryo medium made in lab N/A 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide Invitrogen AM9342
Goat serum Sigma G9023
Heparin sodium salt J&K Scientific 542858
HYB made in lab N/A preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box Mkbio MH10002
KCl Sigma P5405
Low profile leica blades Leica 819
MABT (1x) made in lab N/A 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid Sigma M0375
Methanol J&K Scientific 116481
Methylene blue Macklin M859248
MgSO4 Sigma M2643
NaCl Sigma S5886
NTMT made in lab N/A 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium Tissue-Tek 4583
PAP pen Enzo Life Sciences ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4% Abbexa abx082483 made in lab in 1x PBS
PBST (1x) made in lab N/A 1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea Merck 103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x) Invitrogen AM9624
preHYB made in lab N/A 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K Roche 1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt Sigma R3629
RNase-free 1.5 mL tubes Ambion AM12400
SSC (20x) Invitrogen AM9770
SSCT (0.2x) made in lab N/A 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x) made in lab N/A 1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose Invitrogen 15503022
Triton X-100 Sigma T9284
Tween-20 Sigma P1379
Zebrafish Laboratory Animal Center of Nantong University N/A

Referanslar

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
  3. Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  4. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  5. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
  6. Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
  7. Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
  8. Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
  9. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  10. Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
  11. Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
  12. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  13. Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
  14. Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
  15. Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
  16. Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
  17. O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Wang, J., Chai, R., Fang, X., Gu, J., Xu, W., Chen, Q., Chen, G., Zhu, S., Jin, Y. In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (181), e63715, doi:10.3791/63715 (2022).

View Video