Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

Retina hastalıklarını incelemek için hem in vivo hem de in vitro modeller de dahil olmak üzere farklı modeller sunulmuştur. Hayvanların araştırmalarda kullanımı hala sürekli bir etik ve çeviri tartışması konusudur¹. Fareler veya sıçanlar gibi kemirgenleri içeren hayvan modelleri, retinal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır ^2,3,4. Bununla birlikte, kemirgenlerde retinanın insanlara kıyasla farklı fizyolojik fonksiyonları nedeniyle, makulanın yokluğu veya renk vizyonundaki farklılıklar gibi klinik kaygılar ortaya çıkmıştır⁵. Retinal araştırmalar için insan postmortem gözlerinin kullanımı, orijinal örneklerin genetik arka planlarındaki farklılıklar, bağışçıların tıbbi geçmişi ve bağışçıların önceki ortamları veya yaşam tarzları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok soruna sahiptir⁶. Ayrıca, retinal araştırmalarda in vitro modellerin kullanılmasının da bazı dezavantajları vardır. Retina hastalıklarını incelemek için kullanılan hücre kültürü modelleri, insan kökenli hücre hatlarının, birincil hücrelerin veya kök hücrelerin kullanımını içerir⁷. Kullanılan hücre kültürü modellerinin kontamine olma, yanlış tanımlanma veya farklılaşmama açısından problemleri olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11. Son zamanlarda, retinal organoid teknolojisi önemli ilerleme göstermiştir. Bununla birlikte, in vitro olarak oldukça karmaşık retinaların yapımının birkaç sınırlaması vardır. Örneğin, retinal organoidler olgun in vivo retinalarla aynı fizyolojik ve biyokimyasal özelliklere sahip değildir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, retinal organoid teknolojisi, düz kas hücreleri, vaskülatür ve mikroglia^12,13,14,15 gibi bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere daha fazla biyolojik ve hücresel özelliği entegre etmelidir.

Organotipik retinal eksplantlar, diyabetik retinopati ve dejeneratif retina hastalıkları gibi retina hastalıklarını incelemek için güvenilir bir araç olarak ortaya çıkmıştır^16,17,18,19. Mevcut diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, retinal eksplantların kullanımı, aynı biyokimyasal parametreler altında ve sistemik değişkenlerden bağımsız olarak çeşitli retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için benzersiz bir özellik ekleyerek hem in vitro retinal hücre kültürlerini hem de mevcut in vivo hayvan modellerini desteklemektedir. Eksplant kültürleri, farklı retina hücrelerinin aynı ortamda bir arada tutulmasına izin vererek retinal hücreler arası etkileşimlerin korunmasını sağlar^20,21,22. Ayrıca, önceki bir çalışma, retinal eksplantların kültürlenmiş retina hücrelerinin morfolojik yapısını ve işlevselliğini koruyabildiğini göstermiştir²³. Böylece, retinal eksplantlar çok çeşitli retina hastalıkları için olası terapötik hedefleri araştırmak için iyi bir platform sağlayabilir^24,25,26. Retinal eksplant kültürleri kontrol edilebilir bir teknik sağlar ve çok sayıda farmakolojik manipülasyona izin veren ve çeşitli moleküler mekanizmaları ortaya çıkarabilen mevcut güvelerin yerine çok esnek bir alternatiftir²⁷.

Bu makalenin genel amacı, retinal eksplant tekniğini in vitro hücre kültürleri ile in vivo hayvan modelleri arasında makul bir ara model sistem olarak sunmaktır. Bu teknik, retina fonksiyonlarını ayrışmış hücrelerden daha iyi bir şekilde taklit edebilir. Çeşitli retina tabakaları bozulmadan kaldığından, retinal hücreler arası etkileşimler laboratuarda iyi kontrol edilen biyokimyasal koşullar altında ve vasküler sistemin işleyişinden bağımsız olarak değerlendirilebilir²⁸.

Tüm hayvan deneyleri, Oakland Üniversitesi, Rochester, MI, ABD'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Beyanı tarafından oluşturulan yönergeleri izledi.

1. Hayvan hazırlığı

1. Hayvanları ışık kontrollü bir ortamda sabit bir sıcaklık altında tutun. Hayvan barınma odası için sıcaklık ayarları, "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu" tarafından belirtilen yönergelere uygun olmalıdır. Fareler için sıcaklık aralığı 18 °C ile 26 °C arasındadır. Nem seviyelerini kontrol altında tutun ve yaklaşık% 42'ye ayarlayın.
2. Bu deney için, 12 haftalıktan daha eski olan erkek C57BL/6J fareleri kullanın (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) (bu protokol için yetişkin bir fare kullanılmıştır).
   NOT: Bu protokolde retinayı etkileyen herhangi bir genetik anormallik olmadığı için vahşi tip bir suş kullanılmıştır. Bununla birlikte, retinal eksplant kültürü için genetik olarak manipüle edilmiş suşlar da dahil olmak üzere diğer suşlar kullanılabilir.
3. Hayvan barınma odalarında aydınlatma kontrolü ile 12 saat aydınlık / karanlık döngüleri sağlayın.
4. Her hayvanı sağlık ve yeterli yiyecek ve su alımı açısından haftada iki kez, hafta sonları ise günde bir kez kontrol edin. Onlara taze yiyecek ve temiz su sağladığınızdan emin olun.
5. Yiyecek ve su seviyeleri hafta boyunca düşükse, su şişesini durulayın ve tekrar doldurun. Gerektiğinde taze yiyecekler ekleyin. Kirlenmiş kafesleri günlük olarak veya hayvanların sağlığı için gerektiği gibi değiştirin.
   NOT: Retinadaki fotoreseptörleri ve ışık kaynaklı değişiklikleri incelemek için, fareleri hayvan tesisindeki karanlık bir odada bulunan özel bir karanlık kutuda gece boyunca karanlık bir şekilde uyarlayın.
6. Bir CO_{2 odasına} bağlı silindirlerde sıkıştırılmış CO 2 gazı kullanarak ev kafeslerindeki hayvanları CO₂ inhalasyon doz aşımı ile ötenazileştirin. Servikal çıkık gibi ikincil bir ötenazi yöntemi kullanarak ölüm doğrulaması yapın.
7. Prosedürü tamamladıktan sonra, hayvan ölümünü kalp ve solunum durmasını doğrulamak veya hayvanın sabit ve genişlemiş gözbebeklerini gözlemlemek gibi uygun bir yöntemle onaylayın.

2. Doku hazırlığı

1. Hayvan ötenazi yapıldıktan sonra, alanı% 70 etanol ile temizleyin. Ardından, göz kapaklarını bir elinizle açın, böylece göz görünür olur. Dünya çıkıntı yapana kadar kavisli forseps kullanarak karşı elinizle yörüngenin üst ve alt kısımlarına basınç uygulayın.
2. Gözü enüklee etmek için, gözün arka kısmındaki forsepsleri yavaşça kapatın ve sürekli bir hareketle yükselin. Forseps kullanarak, göz küresini optik sinirden tutun. Tüm adımlar için sterilize diseksiyon aletleri kullandığınızdan ve tam aseptik koşullar altında çalıştığınızdan emin olun.
3. Her göz küresini, penisilin-streptomisin (10.000 U / mL) ile 1 mL buz gibi soğuk HBSS içeren 1,5 mL'lik bir tüpe batırın. Göz küresini HBSS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
4. Göz küresini tam medya içeren 1.5-2 mL'lik bir tüpe aktarın (% 10 FBS,% 2 B27,% 1 N2,% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin ve streptomisin).

3. Doku diseksiyonu

1. Retinayı, Şekil 1'de sıralı olarak gösterildiği gibi, bir ameliyat mikroskobu altında dikkatlice inceleyin.
   1. Göz küresini açmak için limbüsün etrafında çevresel bir kesi yapın. Korneanın sınırı ve (limbal) insizyon boyunca dairesel olarak diseke ederek korneayı çıkarın, ardından ön segmenti, lensi ve vitreus gövdesini çıkararak boş bir göz kapağı bırakın.
   2. Optik sinir başının bölgesini ince forsepslerle tutarak, gözün dış kaplamasını nazikçe soyun. Nöral retinaya zarar vermemek ve retinanın tamamen sağlam kalmasını sağlamak için dış kaplamanın çıkarılması sırasında büyük dikkat gösterin.
      NOT: Retina, retina pigment epitelinden (RPE) dikkatlice soyulmalı ve retinayı optik sinirden ayırmak için optik sinir kafasında tek bir kesim yapılmalıdır. Optik sinirin (optik sinir başı) bıraktığı deliği tanımlayarak görsel olarak bunu sağlayın.
   3. Retinayı radyal olarak dört eşit boyutlu parçaya bölün.
2. Retina kültürünün doğru yönlendirilmesini sağlamak amacıyla retinanın küçük parçalarını işlemek için aşağıdaki adımları izleyin.
   1. Diseksiyon makaslı bir bıçak kullanarak, retina parçasının hemen altında açın (Malzeme Tablosu).
   2. Retina parçasını açık bir makas bıçağının ucuyla yavaşça kaldırın ve yavaşça kültür plakasına aktarın.
3. İzole edilmiş retinadan türetilen eksplantları, retinal ganglion hücresi (nöroretina) tarafı yukarı bakacak şekilde, her biri 300 μL retinal eksplant ortamı içeren 12 kuyucuklu bir plakadaki hücre kültürü ekzerlerine ayrı ayrı aktarın.
   NOT: Ortamın N2 ve B27 takviyeli DMEM ortamı olduğundan emin olun. Ortama penisilin-streptomisin (10.000 U / mL) de ekleyin (Malzeme Tablosu). Retina, sinapslar yoluyla birbirine bağlanan ve dışarıdan bakıldığında, diseksiyon sırasında çıkarılan siyah tabaka olan retinal pigment epitelinin pigmentli tabakası tarafından desteklenen çok sayıda nöronal hücre katmanından oluşur.
4. Pigmentli epitelin kalıntılarını çıkarın; Bununla birlikte, bu kalıntılar eksplantın doğru yönünü belirlemede yardımcı olabilir. Pigmentli kısmın aşağı baktığından ve pigmentli olmayan kısmın yukarı baktığından emin olun.
5. Retinal eksplant kültürünü nemlendirilmiş inkübatörlerde 37 °C ve% 5 CO_{2'de inkübe edin}.
6. Retina yüzeyinin yukarı baktığından emin olun. Retina parçası çevrilirse veya katlanırsa, yavaşça doğru yöne ayarlamaya çalışın.
   NOT: Kültür plakasındaki retinal eksplantın doğru yönlendirilmesine çok dikkat edin. Kültür plakasındaki eksplantın herhangi bir şekilde çevrilmesinden veya katlanmasından kaçının, çünkü bu, retina hücrelerinin kültürde düzgün büyümesinin başarısız olmasına neden olacaktır.

4. Retinal eksplant kültürü

1. Retinal eksplant kültürlerini (3.2-3.3 adımlarında hazırlanan) nemlendirilmiş inkübatörlerde 37 °C ve% 5 CO_2'de tutun.
2. Medyanın yarısını 2 hafta boyunca her gün her kuyudan değiştirin. Bunu kuyudan 150 μL'yi dikkatlice pipetleyerek yapın. Ardından, kuyucuğa 150 μL taze ortam ekleyin. Medyayı değiştirirken eksplantı çevirmekten kaçının.
3. Kültür plakasını tekrar inkübatöre koymadan önce eksplantı mikroskop altında dikkatlice kontrol edin. Hücrelerin bütünlüğünü ve retina mimarisini parlak alan mikroskobu altında inceleyin. Explant'ın hala doğru yönlendirildiğinden emin olun. Explant'ı incelemek için hem 4x hem de 20x objektif lensleri kullanın.
   NOT: Eksplantın ortama tamamen daldırılmasından kaçının.

5. İmmünohistokimya

1. 2 hafta sonra, medyayı çıkararak retinal eksplantı sabitleyin. Bunu, önce 200 μL 1x PBS ile bir kez yıkayarak ve daha sonra eksplantı içeren kuyuya 0.1 M PBS, pH 7.4'te 300 μL% 4 paraformaldehit ekleyerek ve gece boyunca bırakarak yapın.
   NOT: Bu adım, kültür eklerini plakadan çıkarmadan yapılabilir. Eksplantlar ayrıca 500 μL'lik bir konik tüpe aktarılabilir ve yıkama ve sabitleme tüpün içinde yapılabilir.
2. Eksplantı, yıkama için 300 μL 1x PBS-%2,5 Triton X içeren 500 μL konik bir tüpe aktarın.
3. Sabit eksplantları tüpteki üç kez, bir çalkalayıcı (25 rpm) üzerinde orta hız kullanarak her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
4. Antikor inkübasyonundan önce oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.02 thimerosal içeren 300 μL 1x bloke tamponu ile eksplantı inkübe ederek beklenen spesifik olmayan reaksiyonları bloke edin.
5. Sabit eksplantları, bir çalkalayıcı üzerinde orta hız kullanarak 4 ° C'de gece boyunca birincil antikorlarla inkübe edin.
   NOT: Sabit eksplanttaki retinal endotel hücrelerini GSL I, BSL I antikoru (lektin) ile boyayarak tespit edin (7:1,000). Tavşan glial fibriler asidik protein (GFAP) antikoru ile boyanarak retinal eksplantlardaki glial hücreleri tespit edin (1:250). Eksplantı tavşan NeuN antikoru ile boyayarak retinal nöronları tespit edin (1:250)^29,30. S{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome eksplantlarını lektin, NeuN kombinasyonu ile inkübe edin ve diğerlerini lektin, GFAP kombinasyonu ile inkübe edin.
6. Ertesi gün, birincil antikoru tüplerden bir pipetle aspirasyon yoluyla çıkarın. Eksplantları 1x PBS-%2,5 Triton X ile çalkalayıcıda orta hızda her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
7. İkincil antikorları ekleyin: Keçi anti-Tavşan IgG (1:500) (GFAP ve NeuN için ikincil) ve Texas Red (7:1,000) (lektin için). Bir çalkalayıcı üzerinde orta hız kullanarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
   NOT: İkincil antikorlar ışığa duyarlıdır, bu nedenle tüpü alüminyum folyo ile örtün.
8. İkincil antikorları aspirasyonla çıkarın ve ardından her biri 5 dakika boyunca 1x PBS-2.5% Triton X ile üç kez yıkayın.
9. Bir transfer pipeti kullanarak eksplantı tüpten cam bir slayda aktarın. Slayttaki fazla sıvıyı çıkarın ve ardından slayda DAPI içeren bir damla montaj ortamı ekleyin.
10. Dokuyu bir örtü ile örtün. Kapak kayması ile doku arasında hava kabarcıklarına izin vermeyin.
11. Lekeli slaytları floresan mikroskobuna götürün ve görüntüleri çekmeye başlayın. Floresan boyama ışığa duyarlı olduğu için lekeli slaytları bir slayt kutusu kullanarak örtmek önemlidir.

Retinal eksplantın nöronal ve vasküler retinal hücrelerinin kültür medyasında ex vivo olarak uzun süre hayatta kalması
Protokolümüzü kullanarak retinal bir eksplantı kültüre alarak, 2 haftaya kadar canlı olan farklı retina hücrelerini korumada başarılı olduk. Farklı retina hücrelerinin varlığını doğrulamak için, nöronal hücre belirteci (NeuN), glial hücre belirteci (GFAP) ve vasküler belirteç (izolektin-B4) kullanılarak retinal eksplantın immünofloresan boyaması yapıldı (Şekil 2). Boyama iyi organize olmuş ve iyi gelişmiş retinal nöronlar ve glial hücreler gösterdi. Ek olarak, retinal kan damarları, izolektin-B4 boyaması ile belirtildiği gibi yapısal olarak sağlamdı. Retinal eksplantın morfolojik bütünlüğü, immün boyama ile gösterildiği gibi, retinal eksplant kültürünün, deneysel olarak bir model olarak kullanılabilecek canlı retinal hücrelerin korunmasında başarılı olduğunu göstermiştir. Explant kullanılarak incelenecek farklı deneysel koşullar, ImageJ yazılımı kullanılarak çoklu hücresel belirteçler için immünofloresan boyama ile değerlendirilebilir ve analiz edilebilir. İmmün boyama, çeşitli deney grupları arasında her bir hücresel belirtecin immünoreaktivite seviyelerinin ve retinal gangliyon hücrelerinin veya fotoreseptörlerin sayısı gibi spesifik hücrelerin sayısının ölçülmesine izin verir.

Kültür plakasındaki retinal eksplantın doğru yönlendirilmesinin deneysel sonuçlar için önemi
Retinal eksplantın kültür plakasındaki doğru oryantasyonu, nöroretinanın yukarı bakacak şekilde inkübe edilmesiyle sağlanır. Öte yandan, retinal eksplantın başarısızlığı, retina dokusunun ters çevrilmesi veya katlanmasından kaynaklanabilir ve bu da nöroretinanın aşağı bakmasına neden olur. Önceki deneyde (NeuN, GFAP ve izolektin-B4) farklı retinal belirteçler kullanılarak 2 hafta sonra kültürlenmiş retinal eksplantın immünofloresan boyanması, uygun eksplant oryantasyonunun başarısızlığının nörovasküler elemanın uygun gelişiminin başarısızlığına neden olduğunu göstermiştir (Şekil 3).

Şekil 1: Retinal eksplantı oluşturmak için göz küresini diseke etme adımları . (a) Enüklee edilmiş göz küresi, hayvandan çıkarıldıktan hemen sonra ortama daldırılır. (b) Göz küresini açmak için limbüs boyunca çevresel bir kesi yapılır. (c) Kornea limbal insizyon boyunca diseksiyon yapılarak çıkarılır. (d) Optik sinir ince forseps ile tutularak, gözün dış tabakası nazikçe soyulur. (e) Lens, vitreus ve siliyer gövde çıkarılır. (F) Geride sadece nöral retina kalır. (g) Bir sonraki adımda kesilmesini kolaylaştırmak için retinada dört radyal kesi yapılır. (h) Retina iki veya dört parçaya bölünebilir ve daha sonra kesici ucu ve ortamı içeren hücre kültürü plakasına aktarılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Korunmuş retinal yapıya sahip başarılı retinal eksplant kültürü. 2 hafta boyunca kültürde kalan retinal eksplantların immünofloresan boyaması. Eksplantlar sabitlendi ve (a) retinal nöronlar için NeuN (yeşil) ve kan damarları için izolektin-B4 (kırmızı) ve (b) glial hücreler için GFAP (yeşil) ve kan damarları için izolektin-B4 (kırmızı) ile boyandı. Boyama iyi gelişmiş retina hücreleri ve retina damarları gösterdi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kusurlu, az gelişmiş retina hücreleri ile başarısız retinal eksplant kültürü. İki hafta boyunca kültürde kalan retinal eksplantların immünofloresan boyaması. Eksplantlar glial hücreler için GFAP (yeşil) ve kan damarları için izolektin-B4 (kırmızı) ile sabitlendi ve boyandı. Görüntüler kusurlu boyama ve az gelişmiş retina hücrelerini ve retina damarlarını göstermektedir. Retinal eksplant katlandı ve kültür plakasında doğru yönlendirilmedi. Retina yukarı bakacak şekilde eksplantın doğru yönlendirilmesini sağlamak için büyük dikkat gösterilmelidir. Retinal eksplantın doğru yöne yerleştirilmemesi, eksplantın uygun şekilde geliştirilememesine neden olacaktır. Ölçek çubuğu = 100 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.