Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.
Yabani Caenorhabditis nematodlarının bağırsaklarında, bağırsak mikrobiyom bakterileri ve mikrosporidia ve virüsler gibi patojenler de dahil olmak üzere çeşitli mikroorganizmalar yaşar. Caenorhabditis elegans ve memeli bağırsak hücreleri arasındaki benzerlikler ve C. elegans sisteminin gücü nedeniyle, bu konakçı bağırsak-mikrop etkileşimlerini in vivo olarak incelemek için bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bu etkileşimlerin bazı yönlerini parlak alan mikroskobu ile gözlemlemek mümkün olsa da, mikropları doğru bir şekilde sınıflandırmak ve daha kesin araçlar olmadan kolonizasyon veya enfeksiyonun derecesini karakterize etmek zordur. RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH), nematodlardaki mikropları vahşi doğadan tanımlamak ve görselleştirmek veya laboratuarda mikroplarla enfekte olmuş nematodlarda enfeksiyonu deneysel olarak karakterize etmek ve ölçmek için bir araç olarak kullanılabilir. Son derece bol miktarda bulunan küçük alt birim ribozomal RNA’yı etiketleyen FISH probları, bakteriler ve mikrosporidyen hücreler için parlak bir sinyal üretir. Birçok tür için ortak olan ribozomal RNA’nın korunmuş bölgelerini hedeflemek için tasarlanan problar, çok çeşitli mikropları tespit edebilirken, ribozomal RNA’nın farklı bölgelerini hedeflemek daha dar algılama için yararlıdır. Benzer şekilde, problar viral RNA’yı etiketlemek için tasarlanabilir. Paraformaldehit (PFA) veya aseton fiksasyonu ile RNA FISH boyama için bir protokol sunulmuştur. PFA fiksasyonu bakteri, mikrosporidia ve virüslerle ilişkili nematodlar için idealdir, oysa mikrosporida sporlarının görselleştirilmesi için aseton fiksasyonu gereklidir. Hayvanlar ilk önce paraformaldehit veya aseton içinde yıkandı ve sabitlendi. Fiksasyondan sonra, probların istenen hedefe hibridizasyonuna izin vermek için FISH probları numunelerle inkübe edildi. Hayvanlar tekrar yıkandı ve daha sonra mikroskop slaytlarında veya otomatik yaklaşımlar kullanılarak incelendi. Genel olarak, bu FISH protokolü, genetik araçların bulunmadığı mikroplar da dahil olmak üzere, C. elegans bağırsağında yaşayan mikropların tespitini, tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar.
Caenorhabditis elegans, bağırsak epitel hücrelerinde doğuştan gelen bağışıklık ve konakçı-mikrop etkileşimlerini incelemek için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Şeffaf bir gövdeye ve sadece 20 bağırsak hücresine sahip olması nedeniyle, C. elegans, sağlam bir organizma bağlamında mikrobiyal bağırsak kolonizasyonu ve enfeksiyon süreçlerini izlemek için uygun bir sistemi temsil eder. Nematod bağırsak hücreleri, memeli bağırsak epitel hücreleri ile çoklu morfolojik ve fonksiyonel benzerlikler paylaşır, bu da onları mikrobiyom kolonizasyonunu ve patojen enfeksiyonunu yöneten süreçlerin diseksiyonu için inatlanabilir bir in vivo model haline getirir 3,4,5,6.
Yabani C. elegans, bağırsağı kolonize eden ve enfekte eden çeşitli mikroplarla beslenir ve bu nematodların örneklenmesi, virüslerin, ökaryotların (mantarlar, oomisitler) ve doğal olarak bu konakçı 7,8,9,10 ile ilişkili bakterilerin keşfiyle sonuçlanmıştır. Orsay virüsünün bağırsağı enfekte ettiği bulundu ve şu anda C. elegans 9’un bilinen tek doğal virüsüdür. Mikrosporidia, vahşi yakalanan Caenorhabditis’te en sık bulunan enfeksiyon olan mantar ile ilişkili zorunlu hücre içi patojenlerdir ve C. elegans ve ilgili nematodları enfekte eden birkaç tür keşfedilmiştir 8,11. Vahşi yakalanan C. elegans’ın bağırsak lümeninde yaşayan birçok bakteri yaygın olarak bulunur ve C. elegans mikrobiyomu (CeMbio) 6,12,13,14 için doğal bir model olarak birkaç tür kurulmuştur. C. elegans’ı doğal olarak kolonileştiren ve / veya enfekte eden mikropları keşfetmek ve karakterize etmek, bu konakçı-mikrop etkileşimlerini yöneten genetik mekanizmaları anlamak ve yalnızca sağlam bir konakçı hayvan bağlamında meydana gelen yeni mikrobiyal süreçleri görselleştirmek için çok önemlidir.
Örneklemeden sonra, yabani nematodlar, enfeksiyon veya kolonizasyonun göstergesi olan fenotipleri aramak için diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu ile taranır. Örneğin, bağırsak hücrelerinin stereotipik granül görünümündeki değişiklikler, hücre içi parazit enfeksiyonunun varlığı ile ilişkili olabilir8. Spesifik olarak, bağırsak granüllerinin kaybı ve azalmış sitozolik viskozite viral enfeksiyonun belirtileridir, oysa bağırsak granüllerinin ‘oluklar’ halinde yeniden düzenlenmesi, Nematocida 8,9 cinsinde mikrosporidia ile enfeksiyonu gösterebilir. Yabani C. elegans örneklerinde çok çeşitli mikroplar bulunduğundan, DIC mikroskobu ile mikropları ayırt etmek zor olabilir. Mikropların konakçı içindeki uzamsal dağılımı ile ilgili bilgilerin, birçok mikrobun küçük boyutu nedeniyle tespit edilmesi de zor olabilir15. Ek olarak, in vitro olarak ilgilenilen herhangi bir mikrobun kültürlenmesi her zaman mümkün değildir, bu da tespit ve / veya nicelemede zorluklara yol açar.
RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH), sabit hücrelerdeki küçük ribozomal alt birimin (SSU) RNA’sına bağlanan floresan probları kullanarak mikropları floresan olarak etiketlemek için bir yöntem sağlar. Morfolojik özelliklerin analizi belirli bir mikrop sınıfını gösteriyorsa, bu tür mikropların spesifik veya geniş sınıflarını hedefleyen FISH probları kullanılabilir. Örneğin, EUB338, bakteriyel SSU için evrensel bir prob olarak kabul edilir ve yaygın olarak çok çeşitli bakterileri tespit etmek için kullanılır16. Burada açıklanan protokol, bir florofor ile etiketlenmiş ve daha önce tasarlanmış problar mevcut olmasına rağmen, ilgilenilen mikrobun hedef SSU’sunu tamamlayıcı olacak şekilde özel olarak tasarlanmış tek sarmallı DNA probları kullanır16. Mikropların SSU’sunu hedeflemenin temel avantajı, tipik olarak hücredeki tüm RNA’nın% 80-90’ını oluşturan ve çok yüksek bir sinyal-gürültü oranıyla lekelenmeye yol açan bu RNA’nın nispeten büyük bolluğudur17. Problar ayrıca, virüs aktif olarak çoğalıyorsa, enfekte olmuş hücrelerde genellikle çok yüksek kopyalarda bulunan Orsay virüsü 9,18 gibi virüsleri tespit etmek için RNA’yı hedeflemek üzere tasarlanabilir.
Bilinen problarla elde edilen sonuçlara bağlı olarak, in situ tür doğrulaması için daha spesifik problar tasarlamak için daha fazla dizi bilgisi elde etmek gerekebilir. Yaygın bir yaklaşım, daha farklı olan bölgeleri (PCR yoluyla) yükseltmek için SSU’nun korunmuş bölgelerine (bakteriler için 16S ve ökaryotlar için 18S) karşı evrensel primerler kullanmaktır8. Bu dizi bilgisi kullanılarak, daha fazla türe özgüllüğe sahip problar tasarlanabilir. Bu FISH probları daha sonra mikropların kültürden bağımsız bir şekilde tanımlanmasını sağlayabilir8. Ek olarak, RNA FISH, filamentasyon veya doku lokalizasyon paternleri de dahil olmak üzere benzersiz morfolojik kolonizasyon ve enfeksiyon özellikleri hakkında fikir verebilir19,20. Farklı renkli FISH probları aynı anda kullanılabilir, bu da vahşi nematod numunelerindeki mikroplar arasında görsel ayrım yapılmasını ve bir konakçı15,20 içindeki mikrop-mikrop dinamiklerinin gözlemlenmesini sağlar. Ayrıca, RNA FISH boyaması, bilinen bir türün enfeksiyonu ve kolonizasyonunun, örneğin enfeksiyona karşı direnci artıran veya azaltan C. elegans mutantlarının karşılaştırılmasında patojen yükü hakkında fikir vermek için manuel olarak veya otomatik yaklaşımlar yoluyla kolayca ölçülebildiği konakçı-patojen etkileşim çalışmalarına uygulanabilir21.
Vahşi C. elegans doğal olarak çeşitli mikroplarla ilişkilidir. Araştırmacılar, bu mikropları tespit etmek ve tanımlamak için RNA FISH’i kullanabilir ve bütün bir hayvan bağlamında lokalizasyonları hakkında fikir edinebilirler. İstenilen veya ilginç fenotiplere sahip mikroplar bu yöntemle tanımlanabilir ve daha sonra karakterizasyon ve dizileme için izole edilebilir. Yabani C. elegans’tan çok sayıda bakteri izolatının bolluğu da RNA FISH29 ile ölçülebilir. Burada açıklanan protokolü kullanarak, konakçılarının içindeki bilinen mikroorganizmaları gözlemlemek ve etkileşimleri hakkında daha fazla bilgi edinmek de mümkündür. Daha da önemlisi, Orsay virüsü ve mikrosporidia zorunlu parazitlerdir ve konakçıdan bağımsız olarak kültürlenemez, bu nedenle FISH standart görselleştirme aracıdır. Kolonizasyon veya enfeksiyon, istenen kültürlenebilir bakterilerle tohumlanmış plakalarda yetiştirilen nematodlar kullanılarak RNA FISH aracılığıyla da ölçülebilir. C. elegans bağırsağındaki mikroorganizmaları boyamaya ek olarak, bu protokol C. tropicalis veya Oscheius tipulae 19,23 gibi diğer nematod suşları için de kullanılabilir.
FISH protokolünün temel avantajı, C. elegans ile ilişkili mikropları boyamak için basit, hızlı ve sağlam bir yöntem sunmasıdır. FISH boyamasından üretilen görüntüler, numune içindeki SSU’nun bol RNA’sını hedef alan FISH probları kullanılarak elde edilen yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahiptir. Tipik olarak rDNA’dan 30x veya daha yüksek rRNA seviyeleri olduğu için, rRNA’yı hedef alan problarla boyanan FISH’ten gelen sinyalin çoğu, rDNA30 yerine rRNA’dan kaynaklanmaktadır. Ayrıca, RNA FISH, enfeksiyonu veya kolonizasyonu tüm hayvan bağlamında görmeyi mümkün kılar. Bu görselleştirme, konakçı çekirdeklerinin DAPI ile birlikte boyanması ve / veya numune içindeki enfeksiyon veya kolonizasyonun lokalizasyonunu daha iyi vurgulamak için floresan işaretli C. elegans suşları kullanılarak kolaylaştırılmıştır. Örneğin, farklı dokularda GFP ekspresyonu olan C. elegans suşlarının bir paneli kullanılarak Nematocida displodere’nin doku tropizmini belirlemek için mikrosporidian spesifik FISH kullanıldı20. Ek olarak, bu protokol, araştırmacıların özel ihtiyaçları için uygun ideal koşulları belirlemelerine izin veren değişikliklere uygundur (örneğin, fiksasyon süresini ayarlamak, hibridizasyon sıcaklığını arttırmak).
FISH protokolündeki kritik bir adım, numuneleri sabitlemektir. Fiksatif ilavesini takip eden kuluçka süresi, ajanın numuneyi geçirgenleştirmesi için zaman tanımak için gereklidir. Daha uzun inkübasyon süreleri, zaman içinde PFA tarafından protein bozulması nedeniyle transgenik floresan proteinleri içeren numuneler için ideal değildir. GFP içeren numuneler için, GFP sinyalini korurken, geçirgenliğe izin vermek için en uygun sabitleme süresini belirlemek zorunludur.
FISH, C. elegans’ta bakteri, virüs veya mikrosporidia için leke yapmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, FISH için kullanılan en iyi fiksatif ajan türü, numuneye ve aşağı akış gereksinimlerine bağlıdır. Bu protokol, bakteri ve virüsleri boyamak için birincil fiksatif ajan olarak bir PFA çözeltisi sunar. Bununla birlikte, PFA, spor duvarına nüfuz edemediği için mikrosporidian sporların görselleştirilmesi için yeterli değildir. Sporların görselleştirilmesi için bunun yerine aseton kullanılmalıdır. Bununla birlikte, PFA fiksasyonu, sporoplazmalar, merontlar ve sporontlar dahil olmak üzere mikrosporidianın diğer yaşam aşamalarının FISH etiketlemesi için etkilidir. Aseton fiksasyonu ile PFA fiksasyonu arasında diğer önemli farklılıklar görülür; aseton daha uygundur, çünkü numuneler eklendikten sonra, yıkamaya gerek kalmadan dondurucuda hızlı bir şekilde saklanabilir. Bununla birlikte, aseton, transgenik bir konakçıdaki mevcut GFP’leri hızla öldürür. PFA, konakçıdaki bazı fizyolojik yapıların korunması önemliyse, tercih edilen fiksatiftir, çünkü aseton ile sabitlenmiş hayvanlar daha fazla bozulmuş gibi görünmektedir ve bu da bazı dokuların tanımlanmasını zorlaştırmaktadır. Örnekler sabit olduğundan, bu FISH protokolü konakçı-mikrop etkileşimlerinin in vivo canlı görüntülenmesine izin vermez. Bununla birlikte, çeşitli zaman noktalarında örneklerin FISH boyanması ile takip edilen bir nabız kovalama enfeksiyonu zaman seyri, mikrobiyal enfeksiyonun bazı dinamiklerini görmenizi sağlayabilir 19,20,31.
Protokol boyunca bir diğer kritik adım, hibridizasyondan önce ve sonra numunelerin tamamen yıkanmasıdır. Hibridizasyondan önce, solucanları mikrofüj tüplerine toplarken, NGM plakalarındaki fazla bakteri veya diğer mikroplar solucan örneği ile birlikte taşınabilir. PBS-T ile üç yıkama standarttır; Bununla birlikte, özellikle ağır kirlenmiş, vahşi izole C. elegans kullanıldığında, dış mikroorganizmaları yeterince ortadan kaldırmak için daha fazla yıkama gerekli olabilir. FISH’ten sonra monte edilen numuneleri görüntülerken, numunenin arka planında büyük miktarda sinyal üreten bazı artık FISH probu olabilir. Yıkama sıcaklığı ve yıkama sayısı, fazla ve spesifik olarak bağlanmamış probun giderilmesi için önemlidir. Arka plan floresansını azaltmak için, bir saat boyunca 1 mL WB ile bir yıkama yerine, her 30 dakikada bir 1 mL WB ile iki veya üç yıkama yapmak mümkündür. Farklı FISH probları farklı yıkama sıcaklıkları gerektirebilir. Tipik olarak, yıkama sıcaklığı hibridizasyon sıcaklığının 2 ° C üzerindedir, ancak çok fazla arka plan floresansı varsa (yüksek gürültü) bu arttırılabilir.
FISH protokolü, türe özgü mikrobiyal RNA’yı hedeflemek için tasarlanmış floresan probları kullanır, ancak FISH probları diğer yüksek kopyalı transkriptler için tasarlanabilir. Diğer FISH probları farklı erime sıcaklıklarına sahip olabilir, bu nedenle inkübasyon adımlarının tarif edilenden daha yüksek veya daha düşük bir sıcaklıkta yapılması gerekebilir. FISH boyama, konakçı içindeki mikrobiyal kolonizasyonun veya enfeksiyonun mekansal dağılımını tanımlayabilir ve konakçı-mikrop ve mikrop-mikrop etkileşimlerinin karakterizasyonuna izin verebilir. Bir sınırlama, aynı anda sadece birkaç geleneksel floroforun kullanılabilmesidir, bu da aynı anda FISH yoluyla tespit edilebilecek farklı mikroorganizmaların sayısını azaltır. Bu, C. elegans’taki karmaşık mikrobiyom çalışmaları için kullanımını sınırlar. Bununla birlikte, çok renkli rRNA hedefli FISH, farklı mikrobiyal grup etiketlerinin sayısını artırabilen kanonik olmayan floroforlarla etiketlenmiş probları kullanır15. Diğer bir sınırlama, yakından ilişkili türler, özellikle de bakteriler arasında, oldukça benzer SSU dizilerine sahip olanları ayırt etmenin zor olmasıdır. Bununla birlikte, mikrosporidia türleri arasındaki aşırı dizi farklılaşması, bu protokolle farklılaşmalarını kolaylaştırmaya yardımcı olur (Şekil 3)32,33.
Genel olarak, bu FISH protokolü C. elegans içindeki mikroorganizmaları tespit etmek için bir teknik tanımlamaktadır. Araştırmacıların, bozulmamış bir hayvan bağlamında kolonizasyon ve enfeksiyonu tespit etmek ve ölçmek ve ayrıca konakçı içindeki benzersiz mikrobiyal davranışı veya morfolojiyi tanımlamak için şeffaf ve genetik olarak izlenebilir bir model sistemi kullanmalarını sağlar. Bu makalenin ön baskı versiyonu inceleme34 sırasında yayınlanmıştır.
The authors have nothing to disclose.
Dr. Marie-Anne Félix’e bize vahşi nematod suşları sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NSF tarafından KARİYER Hibe 2143718 ve California State Üniversitesi tarafından RJL’ye CSUPERB Yeni Araştırmacı Ödülü altında, ERT’ye R01 AG052622 ve R01 GM114139 altında NIH ve VL’ye Amerikan Kalp Derneği Bursu ile desteklenmiştir.
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
Acetone | Fisher Scientific | A-11-1 | |
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) | Vectalab | NC9524612 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
FISH probes (see Table 1) | LGC Biosearch Technologies | FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis | |
KCl | Fisher Scientific | P217 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S375-500 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 50-980-487 | CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately |
Thermal mixer | Eppendorf | 5384000020 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |