Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Soy izleme fare çizgisinin değeri
Kök hücrelerin in vivo analizi zor olabilir, çünkü bu tür hücreleri inceleyen birçok tahlil, yalnızca hayvanın ölümü sırasında bu hücreleri karakterize etmeye odaklanır ve bu da zaman içinde bir terminal anlık görüntüsünü temsil eder. Progenitör, ara / geçiş hücre tipleri ve olgun hücrelerin zaman içinde proliferasyon, farklılaşma ve göç süreçlerini daha iyi anlamak için uzunlamasına bir analiz yaklaşımı gereklidir. Bu, kök / progenitör hücrelerin silinmez bir şekilde işaretlendiği ve daha sonra herhangi bir süre boyunca takip edilebileceği soy izleme çalışmaları ile sağlanabilir¹.

Yetişkin memeli beyninde, yetişkin doğumlu nöronların kök ve progenitör hücrelerden yaratıldığı nörogenez süreci ilk olarak timidin-H 3^2,3,4 veya 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) ile etiket retansiyonu yoluyla analiz edilmiştir5,6,7,8 . Bu çalışmalarda, proliferatif hücreler, replikasyon ve hücre bölünmesi / proliferasyonu sırasında hücrelerin DNA'sına dahil edilen timin analoğu ile işaretlenmiştir. İşaretli hücre ve onların soyları, bu nedenle, daha sonra ölüm sonrası tanımlanan bu analogu içeriyordu. Bununla birlikte, timidin-H3 ve BrdU, kök hücrelerin yeterince anlaşılmadığı beyin bölgelerinde proliferatif hücrelerin ve soylarının işaretlenmesine izin verirken, bu çalışmalar bu araçların dezavantajları tarafından engellenmiştir. Timidin-H3, hücre döngüsü arresti, apoptozu ve doza bağımlı DNA sentezi inhibisyonunu inhibe 9'a indüklerken, BrdU, uygulama yoluna bağlı olarak hücreleri¹⁰ olarak değiştirir ve onarım veya apoptoz sırasında ve ayrıca hücre bölünmesi sırasında hücreler tarafından alınır¹¹. Son zamanlarda 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile etiketleme gibi daha verimli etiketleme yöntemleri kullanılmıştır, ancak BrdU ile aynı sorunların çoğu hala¹² olarak kalmaktadır. Bu yaklaşımlar, sadece kök hücreleri değil, herhangi bir proliferatif hücreyi işaretlemeleri açısından da sınırlayıcıdır ve bu nedenle sonuçların yorumlanması karıştırılabilir. Nörojenik soyda, tüm kök ve progenitör hücreler mitotik kapasiteyi korur ve sadece terminal / olgun nöronlar proliferatif değildir. Astrositler ve mikroglia için, ancak oligodendrositler için değil, proliferasyon süresiz olarak korunur^13,14,15.

Burada kullandığımız yetişkin kök hücreleri tanımlamak için onaylanan gibi, yalnızca ilgilenilen bir proteini ifade eden hücreleri izlemek için kullanılan transgenik fareler, bu nedenle kök hücreleri ve soylarını araştırırken daha yaygın hale gelmiştir. Fare transgenik yaklaşımlarıyla üretilmesi zor olsa da, soy izleme fare çizgileri beyinde özel olarak işaretlenmiş hücrelerin izlenmesine izin verir ve yalnızca çoğalmaya dayanmaz. Tet-On transgenik fare sisteminde, tetrasiklin veya doksisiklin (bir tetrasiklin türevi) uygulanması, bir ters tetrasiklin transaktivatörü (rtTA) ile tasarlanmış hücrelerde Cre-rekombinaz ekspresyonunu indükler. Tet ile indüklenebilir Cre-driven rekombinasyon, kullanılan Rosa-reporter faresine bağlı olarak, ilgili hücrelerde silinmez bir floresan veya ışıldayan proteinin ekspresyonunu aktive edecektir. Bu silinmez şekilde işaretlenmiş hücreler, bölünme, farklılaşma veya göçten sonra bu muhabiri ifade etmeye devam ederek, bu hücrelerin ve soylarının zaman içinde veya farklı müdahalelerden sonra izlenmesine izin verir¹⁶. Transgenik soy izleme yaklaşımlarının avantajları şunlardır: 1) rtTA ile işaretlenmiş belirli bir hücre soyuna veya progenitör / kök hücreye izlemenin özgüllüğü, 2) hücre döngüsüne veya farklılaşmasına rağmen floresan veya ışıldayan proteinin silinmez ifadesi, 3) düşük toksisite, 4) hayvanın yaşam döngüsünün herhangi bir noktasında koşullu aktivasyon ve 5) ortak tahlillerle kullanım kolaylığı, immünoboyama/immünofloresan dahil¹⁶.

Farelerde geçici olarak indüklenebilir muhabir araçlarının diğer yöntemleri, ROSA-GFP, ROSA-mTmG veya diğer floresan muhabir transgenleri ile eşleştirilebilen Cre-ERT2 farelerinin kullanımını içerir. Bu hayvanlarda, bir promotör veya arttırıcı bölge gibi hücreye özgü bir düzenleyici unsur, yalnızca tamoksifen uygulaması yoluyla aktive edilebilen Cre rekombinaz üretimini yönlendirir. Cre-ERT2 fare çizgileri, belirli hücre hatlarında Cre'nin indüksiyonuna izin verirken, tamoksifenin yetişkin nörogenezi^17,18 üzerindeki etkilerini detaylandıran zengin bir bilgi birikimi vardır. Ek olarak, YFP veya CFP de dahil olmak üzere GFP veya mTmG yerine kullanılabilecek birçok ROSA-güdümlü floresan muhabir geni vardır, bu da diğer floresan dalga boylarında alternatif floresan etiketlemeye izin verecektir. Bu floresan muhabir genleri Tet-On veya Cre-ERT2 sistemleri ile kullanılabilir.

Telomeraz ters transkriptaz (TERT), holoenzim telomerazın hız sınırlayıcı bileşenidir ve hücre bölünmesi^19,20 sırasında kısaltıldıktan sonra telomerleri genişletmek için çalışır. TERT, bağırsak 21,22, kemik iliği 21, karaciğer 23, yağ ²⁴, endometriyum^25,26 ve kemik ^1'deki yetişkin doku kök hücrelerinin bir belirteci olarak tanımlanmıştır. Bu yetişkin kök hücrelerdeki TERT ekspresyonunun sadece telomeraz uzatıcı aktivite için mi yoksa kanonik olmayan TERT rollerini yerine getirmek için mi olduğu hala bilinmemektedir²⁷. TERT eksprese eden sessiz yetişkin kök hücreler (qASC'ler), bu kök hücrelerin çok etkili ve kendini yenileme yeteneğinin yanı sıra aktive etme, çoğalma, farklılaşma ve göç etme potansiyellerini incelemek için transgenik soy izleme fareleri ile vücutta tanımlanmış ve izlenmiştir 1,22,23,28. Tert-rtTA transgeninin oluşturulması daha önce^{gerçekleştirilmiştir 1}. Bu yazıda, yetişkin fare beyninde yeni bir ASC popülasyonu olarak tanımladığımız TERT + qASC'leri incelemek için bir soy izleme TERT fare çizgisinin kullanımını açıklayacağız.

Transgenik bir soy izleme fare çizgisinin oluşturulması
Tet-On sistemini kullanarak soy izleme fare çizgisi oluşturmak için, fare çiftleşmesi yoluyla tek bir hayvanda üç transgen birleştirilmelidir. Birincisi, ilgilenilen genin promotörünün kontrolü altında ifade edilen bir rtTA'dır (bizimki TERT-rtTA'dır). Bu ilgi genini ifade eden bir hücrede, rtTA bu nedenle ifade edilecektir. İkincisi, hem rtTA füzyon transkriptinin hem de tetrasiklin veya doksisiklin varlığında Cre rekombinazının transkripsiyonuna izin verecek bir tetrasiklin yanıt elemanı (TRE) içeren bir oTet-Cre genidir. Tetrasiklin veya doksisiklin bir hayvana içme suyu veya chow²⁹ yoluyla uygulanabilir. Son olarak, Cre rekombinaz bölünmesi ile aktive edilecek bir gen olmalıdır. Bu yazıda, tanımlayacağımız etiketleme geni, Cre rekombinasyonuna kadar her yerde mTomato'yu (tüm hücrelerde membran kırmızısı floresan) transkripte edecek olan Rosa26-mTmG genidir. Bununla birlikte, eğer bir hücre rtTA transkriptini ifade ederse ve tetrasiklin veya doksisiklin içeriyorsa, mDomates ve mGFP bölgeleri arasındaki bir dizi lox P bölgesinin Cre rekombinasyonu, R26 bölgesini değiştirecek ve hücrenin membran domates yerine membran EGFP (mGFP veya membran yeşil floresan) üretmesine neden olacaktır. Bu mGFP sinyalinin silinmez doğası, çoğalırken, göç ederken ve farklılaşırken hücrelerin in vivo etiketlenmesine ve izlenmesine izin verecektir. İzi takiben, hücreler standart kriyoseksiyonlarda veya daha kalın optik olarak temizlenmiş beyinlerde immünofloresan yoluyla GFP'nin ekspresyonu için analiz edilebilir.

Bu yazıda, belirli fare çizgisi olan mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG'nin kullanımını açıklayacağız. Bu üçlü transgenik fare hattını oluşturmak için, oTet-Cre hayvanlarını (Jackson Lab suşu #006234) Rosa-mTmG hayvanlarıyla (Jackson Lab suşu #007676) çiftleştirdik ve oTet-Cre::Rosa-mTmG çift transgenik fareler oluşturduk. Bu hayvanlar, Ek Tablo 1 ve 2'de belirtilen primerler ve PCR şablonları ile genotiplendirildi. mTert-rtTA fareleri (David Breault 1 tarafından yaratılmıştır) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fareleri oluşturmak için oTet-Cre::Rosa-mTmG hayvanlarıyla çiftleştirilmiştir (Şekil 1A)^1,30. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fare çizgisinin etki mekanizması Şekil 1B'de gösterilmiştir.

Doksisiklin indüksiyonu ve nabız kovalama tasarımı
Deneyleri planlarken, hayvanın doksisiklin indüksiyonundaki yaşı, doksisiklin uygulamasının uzunluğu ("nabız" dönemi), doku toplanmasından önce doksisiklin çıkarılmasından sonraki sürenin uzunluğu ("kovalamaca" dönemi) ve bu işlemler sırasında herhangi bir müdahalenin zamanlaması dahil olmak üzere soy izleme deneylerinin sonucunu etkileyecek çeşitli faktörleri göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu çalışma tasarımı hususları, etiketli hücreleri ve bunların soylarını deneyin sonunda anlamak için gereklidir. Süreçteki ilk adım, hayvanın ilgi yaşını ve doksisiklin uygulamasının uzunluğunu tanımlamaktır. Daha uzun nabız süreleri, daha fazla hücrenin rtTA'ya bağlı promotörün eksprese edilmesini ve daha fazla ilgi çekici hücrenin silinmez bir şekilde işaretlenmesini sağlayacaktır. İlgilenilen genin geçici ekspresyonunu sergileyen bir hücre tipi, ilgilenilen geni sürekli olarak ifade eden hücrelerden daha uzun bir nabız süresi gerektirebilir. Bununla birlikte, çalışmanın amacı, ilgilenilen hücrenin veya akut bir müdahalenin kısa vadeli etkilerini anlamaksa, nabız periyodu çok uzun olamaz, çünkü bir hücre işaretlendiğinde, nabız periyodunun geri kalanında herhangi bir sayıda değişiklikle izlenecektir. Bazı çalışmalarımızda, TERT için doğrudan muhabiri daha yakından taklit etmek için kovalamaca süresi olmayan 2 günlük bir nabız kullanılmıştır. Bunun nedeni, Rosa-mTmG geninin rekombinasyonu için minimum sürenin 2 gün³¹ olmasıdır.

Bir nabız kovalama deneyindeki bir sonraki temel dönem, doksisiklin ile hayvanın perfüzyonu arasındaki uzunluktur, aynı zamanda 'kovalamaca' olarak da bilinir. Farelerde doksisiklin yarı ömrü, uygulama yolundan bağımsız olarak yaklaşık 170 dakikadır ve doksisiklin indüksiyonunun çıkarıldıktan birkaç saat sonra³² artık gerçekleşmediği sonucuna varılmasına izin verir. Bununla birlikte, doksisiklin metabolizmasının yaşlı farelerde daha yavaş olduğunu ve bunun da genç hayvanlardan daha uzun etkili 'nabız' dönemlerine yol açabileceğini belirtmek önemlidir³³.

Kovalama döneminde, etiketlenmiş hücreler çoğalma, farklılaşma veya göçten sonra bile etiketlenmeye devam edecektir. Bu hücrelerin soyu da etiketlenecektir. Çalışmanın amacı, nabız kovalama paradigmasının uzunluğunu şekillendirecektir. Çalışmanın amacı, bir dokunun ilgilenilen hücrelerle uzun bir süre boyunca yenilenmesini anlamaksa, uzun bir kovalamaca süresi gerekebilir. Son olarak, herhangi bir müdahalenin veya tedavinin zamanlamasına karar verilmelidir. Nabız periyodu sırasında uygulama, bu süre zarfında yaratılan herhangi bir soyu olduğu kadar ilgi genini ifade eden hücreleri de etkileyecektir, oysa kovalamaca döneminde uygulama, çoğunlukla ilgili hücrelerin soyunu etkileyebilir, ancak bu, etiketlenmiş hücrelerin ne kadar hızlı bölündüğüne veya farklılaştığına bağlı olacaktır. Kullandığımız nabız kovalama deneysel tasarımlarının örnekleri Şekil 2A'da özetlenmiştir.

Sızdıran ifade nedeniyle arka plan GFP sinyalinin olasılığının farkında olmak da önemlidir. Sızdıran ekspresyon, doksisiklin yokluğunda rtTA ve Otet dizileri arasındaki doğal bağlanma potansiyelinin ve rtTA'nın yokluğunda Otet transgeninin artık aktivitesinin bir sonucu olarak ortaya çıkar (^34'te gözden geçirilmiştir). Sızdıran ifade, Tet sistemlerinin bir zayıflığını temsil eder ve sızıntı genellikle sistem için kabul edilebilir bir dezavantaj olmasına rağmen, sızdıran ifadenin Otet-DTA hayvanlarında dipteri toksini (DTA) gibi toksisiteye ve mortaliteye yol açabileceği durumlar bu sistemlerin kullanımını sınırlayabilir³⁵.

Mikroskopi için ince kesitlerin beyin işlemesi, bölümlenmesi ve immünofloresansı
Bir soy izleme deneyinden sonra farelerin beyinlerini analiz etmek için, fareler önce beyinde yüksek otofloresansa yol açabilecek kan ve CSF'yi çıkarmak için transkardiyal perfüzyon yoluyla perfüze edilmelidir. Hayvanın perfüze edilebileceği yaygın olarak kullanılan iki fiksatif vardır: Histochoice Doku Fiksatifi, glioksal fiksatif (GF) veya% 4 paraformaldehit (PFA). Glioksal fiksatörler, PFA'dan daha az çapraz bağlama ile nispeten yumuşak bir fiksasyon işlemine izin verir. Bu, doku sertliğini azaltır, antijen alma ihtiyacını azaltır ve immün boyama sırasında daha az konsantre antikor çözeltilerine izin verir. Bununla birlikte, metanol içeriyorsa, bu otofloresan^36'yı arttırmaya hizmet edebilir. Öte yandan, PFA genellikle daha sağlam bir fiksasyona izin verecektir ve immün boyama sırasında antijen geri kazanımı gerekli olsa da, sadece PFA ile sabitlenmiş dokularla çalışacak antikorlar vardır ve% 4 PFA ile perfüzyon daha sonra açıklanan optik temizleme tekniği için gereklidir.

Perfüzyonu takiben, beyinlerin bir gecede perfüzyon sırasında kullanılan aynı fiksatif tipine daldırıldığı bir fiksasyon sonrası adımdır. Bu, perfüzyon sırasında tamamen sabitlenmemiş olabilecek beyin bölgelerinin düzeltilmeye devam etmesini sağlar. Daha sonra, beyinler, doku içinde buz oluşumunu önlemek için donma adımından önce mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sakkarozda inkübe edilecektir ("kriyo-koruma"). Beyinler daha sonra işlenmek üzere herhangi bir sayıda sagital, koronal veya enine doku bölümüne kesilebilir. Hem hassasiyet hem de tekrarlanabilirlik için, kalibre edilmiş beyin bloklarının hayvanlar arasında tutarlı bregma kesimleri sağlayacak şekilde kullanılması gerekir. Beyinlerin nasıl bölümlendiğini etkileyebilecek en önemli faktör, ilgilenilen beyin bölgeleridir. Örneğin, bir sagital kesim bir doku bölümünde daha fazla beyin bölgesinin analiz edilmesine izin verebilirken, bu kesim ventriküler-subventriküler bölgenin (V-SVZ) nöro / gliojenik bölgelerinin analizine izin vermeyecektir, çünkü lateral ventrikülün lateral ve medial taraflarının bu boyutta ayırt edilmesi imkansız olacaktır ve koronal düzlemde daha iyi gözlenir. Bu, yetişkin nörogenez çalışmalarında yapılması gereken önemli bir ayrım olabilir, çünkü lateral ventrikülün lateral tarafı nörojenik V-SVZ'yi içerirken, lateral ventrikülün medial duvarı daha gliojenik bir niş^37'dir.

Dokular koronal, sagital veya enine bölümlere ayrıldıktan sonra, Optimum Soğutma Sıcaklığı (OCT) gömme çözeltisi kullanılarak bloklar halinde dondurulacaktır. Burada, beyinler kuru buz ve etanol karışımı kullanılarak bu gömme malzemesi içinde dondurulur. İnce kesit analizi gerekiyorsa, bloklar bir kriyostat üzerinde dilimlenir ve gerekli aşağı akış analizine bağlı olarak pozitif yüklü cam slaytlara ince kesitler (<20 μm) olarak yapıştırılabilir. Şarj edilmemiş cam slaytlar da kullanılabilir, ancak yüksüz slaytların kullanılması, dokuların slaytlardan yapışmasına neden olabilir³⁸. Orta kalınlıkta serbest yüzen doku kesitleri (>20 μm) gerekiyorsa, dokular serbest yüzen kesitler halinde toplanacaktır. Kalın kesitler (0.5-4 mm) gerekiyorsa, dondurulmamış beyin bölümlerinin bir vibratom ile dilimlenmesi gerekir. Slaytlardaki -20 ila -80 °C'de donma gerektiren bölümler ile 4 °C'de saklanacak serbest yüzen bölümler arasındaki depolama farklılıklarına dikkat etmek önemlidir.

Beyin temizleme ve tüm montaj immünofloresan konfokal mikroskopi
Fare beynindeki soy izlenen hücrelerin daha geniş, ancak daha az ayrıntılı bir analizi istenirse, iDISCO beyin temizleme³⁹ ve ardından immün boyama ve fayanslı z-yığını konfokal mikroskopi veya ışık tabakası mikroskobu ile beyin dokusunun daha kalın segmentlerinin kapsamlı bir analizi mümkündür. Burada, fare beyninin büyük bölümleri optik olarak temizlenecek (bir delipidasyon süreci³⁹), bu da 1 mm'lik bir doku bölümünde floresan sinyal görüntülemeye daha iyi izin verecektir. Bu işlemin dezavantajları, yüksek otofloresan ve daha geleneksel yöntemlerle (ince kriyozasyonlar veya serbest yüzen kesitler) karşılaştırıldığında gereken artan çalışma mesafeleri nedeniyle hücre morfolojisinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etme yeteneğinin azalması ve ayrıntılı birlikte boyama analizidir. Bu nedenle, tek tek hücreleri karakterize etmeye veya analiz etmeye çalışmak yerine, birden fazla beyin bölgesinde büyük ölçekli soy izleme sonuçlarını analiz etmek için beyin temizlemeyi öneriyoruz.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Deneysel kohort fareler için Tet-On fare çizgisini izleyen bir soy izleme, üreme stratejileri ve genotipleme oluşturulması

NOT: Burada, Cre rekombinasyonuna tabi tutulan floresan muhabir geni olarak Rosa-mTmG ile bir Tet-On fare sisteminin oluşturulmasını özetliyoruz, ancak Tet-On sistemi ile birlikte çeşitli diğer Cre-rekombinasyon tahrikli muhabir hatları da kullanılabilir.

1. Bir veya daha fazla R26 (mTmG) (+/+) dişi ile bir oTet-Cre (+/-) erkeğin çiftleşme kafesini kurun. Deneysel fare çiftleşme kurulumuna genel bir bakış için Şekil 1'e bakın.
2. Elde edilen yavrular (F1) oTet-Cre (+/-) veya oTet-Cre (-/-) ve R26 (mTmG) (+/-) olacaktır. Ek Tablo 1'deki primerlere ve Ek Tablo 2'deki protokollere göre genotipleme yapın.
3. Sütten kesmede, her sütten kesmeden bir kulak yumruğu alarak germline testi yapın. GFP / FITC spektrumunda bir epifloresan mikroskop altında kulak punch'ı inceleyin, hayvanın gelişimde germline rekombinasyonuna maruz kalıp kalmadığını belirlemek için. Eğer öyleyse, hayvan her hücrede GFP'yi ifade edecek ve kulak yumruğu mGFP sinyali ile floresan yapacaktır. Bu hayvanlar çiftleşme veya deneyler için kullanılamaz.
   NOT: Germline olmayan farelerden alınan kulak klipsleri mikroskop altında sadece endojen floresan gösterirken (Şekil 1C), germline hayvanlar parlak bir GFP sinyali gösterir (Şekil 1D). Kontrol kulakları, floresan transgenleri içermeyen farelerden olabilir. Bir not olarak, kulak kılları yüksek endojen floresana sahiptir ve belirleyici bir faktör olarak kullanılmamalıdır (Şekil 1C). Ek olarak, beyaz ve siyah ceket rengindeki fareler arasında endojen floresandaki farklılıklar gözlenir ve test edilen farelerle aynı kaplama rengine sahip farelerin kontrollerinin bu analizde kullanılması gerekecektir.
4. Bir erkek oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) ile bir veya daha fazla dişi oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG) fareyi eşleştirin.
5. Elde edilen nesil (F2) 1/4 R26 (mTmG) (+/+) ve 1/2 Cre (+/-) olacaktır. Bir oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) ile bir veya daha fazla mTert-rtTA (+/+) hayvanını çiftleştirerek bu hayvanları mTert-rtTA (+/+) hayvanlarla geçin.
   NOT: mTert-rtTA (+/+) hayvanları kullandık, ancak bu işlem herhangi bir rtTA fare satırı³⁰ ile gerçekleştirilebilir.
6. Deney hayvanları için, mTert-rtTA (+/+) veya (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) veya (+/-) üretmek üzere ıslahlar ayarlayın.

2. Cre ve nabız kovalama tasarımının Doksisiklin indüksiyonu

1. Hayvanlar çalışmanın başlaması için doğru yaşta olduklarında, içme sularını dox suyuyla değiştirin:% 5 sakkaroz ve 2 mg / mL doksisiklin hiklatı içeren içme suyu. Elde edilen floresan ekspresyon kalıpları için deney hayvanlarıyla aynı doksisiklin nabız kovalamasını alan Cre-negatif hayvanları bir kontrol grubu olarak kullanın.
   1. Hazırlandıktan sonra, doks suyunu 4 ° C'de 1 aya kadar saklayın. Daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakın. Dox suyu, içme şişelerindeki hayvanlara değiştirilmeden önce 5 güne kadar uygulanabilir, çünkü dox suyu oda sıcaklığında daha uzun süre dışarıda bırakılırsa mantar büyümesi meydana gelebilir.
      NOT: mTmG transgeni (ilk mTmG kağıdı) kullanılırken mGFP sinyalinin indüklenmesi için en az 2 günlük bir doksisiklin darbesi gereklidir.
      NOT: 2 mg/mL dışındaki doksisiklin konsantrasyonlarını test etmedik. Önceki literatür, bu konsantrasyonun içme suyu yoluyla uygulandığında en yüksek etkilere sahip olduğunu belirlemiştir²⁹. Verilen doksisiklin miktarı, her hayvan tarafından yapılan içme miktarına bağlı olarak değişebilir. Hayvanlar arasında tutarlı olması için doksisiklin enjeksiyonu veya gavage da yapılabilir⁴⁰.
2. Nabız süresi sona erdikten sonra, kafeslerden doks suyunu çıkarın ve normal içme suyuyla değiştirin. Hayvanlar artık ölene kadar 'kovalamaca' döneminde olacaklar.

3. Transkardiyal perfüzyon ve beyin diseksiyonu

1. Bir fareyi kafesinden çıkarın ve sol baş parmağını ve işaret parmağını kullanarak hayvanı kısıtlayın. Hayvana intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon yoluyla, 200 mg / kg ketamin ve 20 mg / kg ksilazin nihai konsantrasyonu için% 0.9 steril salin içinde 100 mg / mL ketamin ve 20 mg / mL ksilazin çözeltisi enjekte edin. Daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakın.
   DİKKAT: Anestezi protokolleri ülkeye göre farklılık gösterebilir. Ek olarak, anesteziklerin beyin üzerinde mikroglial morfoloji ve etkideki değişiklikler ve kortikosteron seviyeleri de dahil olmak üzere beyin üzerinde etkileri vardır ve beyin toplama ve analizi amacıyla perfüzyon yaparken anlaşılması gerekir^41,42.
2. Yaklaşık 1-2 dakika sonra hayvan haklı refleksini kaybedecektir. Bunu test etmek için, hayvanı sırt üstü yuvarlayın ve eğer ayaklarının üzerine geri dönemezse, doğru refleksini kaybetmiştir.
3. Yaklaşık 5-10 dakika sonra hayvan pedal refleksini kaybedecektir. Pedal refleksini kontrol etmek için, hayvanın ayaklarının her birini sıkıştırmak için baş parmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın. Yanıt yoksa, atlama veya kas spazmı şeklinde, hayvanın ayaklarının her birini sıkıştırmak için baş parmağın tırnaklarını ve işaret parmağını kullanın. Yanıt yoksa, hayvan pedal refleksini kaybetmiştir.
   NOT: Hayvan, enjeksiyondan sonra 15 dakikadan daha uzun bir süre pedal refleksine yanıt verirse, ilk ketamin / ksilazin enjeksiyonunun 1 / 2'sinin ek bir enjeksiyonu gerekebilir. Yaş, cinsiyet, genotip, fenotip ve tedavi, hayvanın bu ilaç kokteyline verdiği cevabı etkileyebilir.
4. Sağ ve pedal refleksleri kaybolduktan sonra, fare göz küresine eldivenli bir parmakla hafifçe temas ettirerek oküler refleksi test edin. Yanıt eksikliği, oküler refleksin kaybolduğunu gösterir.
5. Fareyi, pençeleri sabitlenebilir bir çalışma yüzeyine sabitlenmiş olarak sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
6. Ksifoid sürecin yaklaşık 1-2 cm altında torasik orta hat boyunca cerrahi makasla deriden bir kesi yapın. Ksifoid işlemine kadar üstün kesin.
7. Ksifoid sürecin kıkırdağını forseps ile kavrayın. Makas yerleştirin ve kas sistemini ve göğüs kafesini farenin sağ tarafı boyunca çapraz olarak klavikulaların seviyesine kadar kesin.
   1. Torasik kas sistemini forseps ile yükseltin ve kalp görselleştirilene kadar diyaframdan dilimleyin. Ardından, farenin sol tarafı boyunca aynı çapraz kesimi yapın ve kalple herhangi bir teması önlediğinizden emin olun. Torasik kas sistemini boşluktan uzak tutmak için bir hemostat kullanın.
      NOT: Bu noktada, fare artık nefes alamayacak, bu nedenle sonraki adımlardan önce ölümü önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
8. Atan kalbi künt forseps ile sabitleyin ve aort kemerinin tabanından sol ventriküle bir dağıtım iğnesi yerleştirin.
9. İğne tabanını yerleştirme yerinin hemen üstündeki sol ventriküle kelepçeleyin.
10. Sağ atriyumda bir kesi yapın ve kan akışının ilk belirtisinde, hayvanı 8.11 mL / dakika'da 20 mL 1x PBS ile perfüze etmeye başlayın.
11. 1x PBS gövdeyi deldikten sonra, aşağı akış uygulaması için uygun fiksatöre geçin ve fareyi 20 mL fiksatif ile perfüze edin.
    1. Dondurulmuş kesit ve immün boyama için, beyin temizliği için glioksal fiksatif ile perfüze hayvanı, 1x PBS'de% 4 PFA (pH 7.4) ile perfüze hayvanı.
       NOT: Başarılı bir perfüzyonun belirtileri arasında hayvan sertliği (glioksal ile hafif sertlik, PFA ile yoğun sertlik) ve dokular boyunca görünür kan damarlarının eksikliği bulunur.
12. Farenin kafasını kesin ve beyin sapına makas yerleştirerek ve skuamozal sütür boyunca her iki taraftaki frontomaksiller sütüre kadar keserek beyni çıkarın. Daha sonra kafatası kapağını çıkarmak için fontonazal sütür boyunca kesin, koku alma ampulüne zarar vermemeye dikkat edin. Oradan, kafatasını baş aşağı çevirin ve beyni çıkarmak için kavisli forseps kullanın, optik siniri kestiğinizden emin olun.
13. Perfüze edilmiş beyni bir doku kartuşuna yerleştirin ve hayvanı gece boyunca 4 ° C'de perfüze etmek için kullanılan fiksatif içine daldırın.

4. Beyin tedavisi, dilimleme ve immün boyama

1. Beyin tedavisi ve dilimleme
   1. Beyin kartuşlarını glioksal fiksatiften çıkarın ve 4 ° C'de 2 gün boyunca veya beyinler batana kadar 1x PBS'de% 15 sakkarozda inkübe edin.
   2. Beyin kartuşlarını% 15 sakarozdan çıkarın ve 4 ° C'de 2 gün boyunca veya beyinler batana kadar 1x PBS'de% 30 sakkarozda inkübe edin.
      NOT: Daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakın.
   3. Beyinleri 1x PBS'de% 30 sakarozdan çıkarın ve bir koronal beyin bloğu veya sagital beyin bloğu kullanarak beyni çeşitli 'bloklara' ayırın.
   4. Beyin bölümlerini kuru buz ve etanol (EtOH) karışımı üzerine yerleştirerek koronal veya sagital beyin bölümlerini OCT bileşiğine yerleştirin. OCT beyaza döndükten ve katılaştıktan sonra, kuru buz-EtOH karışımından çıkarın ve parafilme sarılı, -20 ° C'de hava geçirmez bir torbanın içinde saklayın.
   5. Dondurulmuş blokları dondurucudan çıkarın ve iç sıcaklığı -20 ° C'ye ayarlanmış bir kriyostatın içine yerleştirin. Doku sağlam bir şekilde tutturulması için bloğu metal bir aynaya bağlamak için OCT kullanın. Dokunun mandrene donması için ~ 5 dakika bekleyin. Dokuyu 7 μm'de dilimleyin ve her doku dilimini yüklü bir cam slayta yerleştirin.
   6. Slaytların gece boyunca 37 ° C'de pişmesine izin verin ve daha sonra immün boyama için kullanılana kadar -20 ° C'ye yerleştirin.
2. İmmün boyama
   1. Oda sıcaklığına (RT) sıcak kayar ve 15 dakika boyunca buz gibi soğuk asetonla sabitleme yapar.
   2. Kızakları 1x durulama tamponunda (örneğin, IHC Select TBS Durulama Tamponu) 5 dakika boyunca yıkayın, her adım arasında RT'de 60 rpm'de çalkalayın.
   3. RT'de 10 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100 ile nükleer antijenlerin boyanması için geçirgenleştirin RT'de 10 dakika boyunca% 0.3 Tween-20 ile sitoplazmik antijenlerin boyanması için geçirgenleştirin.
   4. 50-100 mL'lik 1x DAKO Antijen Retrieval Solution'da slaytları 10 dakika boyunca iki kez kısık sesle dalga sallayarak antijen alımı gerçekleştirin. Daha sonra RT'de 5 dakika durulama tamponu ile durulayın.
   5. RT'de 20 dakika boyunca kızakları %70 EtOH'da %0,3 Typogen Black'te inkübe edin ve ardından durulama tamponu ile yıkayın.
   6. Dokuların kurumasına izin vermeden her dokunun etrafına hidrofobik bir bariyer çizin. Daha sonra doku başına 1 damla Millipore Bloke Reaktif ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca bloke edin. Daha sonra her dokuya antikor seyreltici olarak seyreltilmiş 100 μL birincil antikor ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   7. Ertesi gün, Alexa Fluor sekonder antikorlarındaki bölümleri RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları durulama tamponunda yıkayın.
   8. İzlenen hücreleri işaretleyen endojen GFP sinyalini artırmak ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe etmek için AlexaFluor 488'e konjuge edilmiş 1:500 anti-GFP antikorunun 100 μL'sinde beyin bölümlerini örtün.
   9. Ertesi gün, 2x durulama tamponu ile yıkayın ve ardından 5 dakika boyunca akan DI suyunda yıkayın.
      NOT: DI suyuyla nazikçe yıkadığınızdan emin olun, slaytların kendilerinde beyin bölümlerini slaytlardan çıkarabilecek akan sulardan kaçınmaya özen gösterin.
   10. 5 dakika boyunca 100 ng/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile karşı leke yapın. Daha sonra 5 dakika boyunca akan DI suyunda yıkayın.
   11. Her doku kesitinin üzerine bir damla montaj ortamı ekleyin ve 22 mm x 22 mm'lik bir kapak kayması ile kapatın. Optimum sinyal sağlamak için montaj gününde görüntüleme önerilir.

5. iDISCO beyin temizleme (39'dan uyarlanmıştır)

1. Sabitleme ve bölümleme
   1. Sabitleme sonrası beyinler% 4 PFA'da gece boyunca 4 ° C'de ve daha sonra RT'de 1 saat boyunca tekrar sabitlenir.
   2. RT'de beyinleri 1x PBS'de bir saat, iki kez yıkayın. Daha sonra gerekli beyin bloğunu kullanarak 1 mm kalınlığında bölümler halinde kesin ve 1x PBS içeren 5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.
2. Metanol ön işlemi (metanol ile)
   NOT: Metanolün bazı proteinlerin immün boyamasını etkileme olasılığı nedeniyle, yazarlar okuyucuyu metanol içermeyen bir iDISCO protokolü alternatifi^39'a bir protokol için Renier ve ark. 2014'e yönlendirmek istemektedir. Bu bölümdeki aşağıdaki çözümlerle ilgili daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakın.
   1. RT'de 1x PBS ile 1 saat boyunca iki kez yıkayın (sallama).
   2. RT'de %50 metanol (PBS'de) içinde 1 saat (çalkalama) yıkayın.
   3. RT'de 1 saat (sallama) için% 80 metanol içinde yıkayın.
   4. RT'de iki kez 1 saat boyunca% 100 metanol içinde yıkayın (sallama).
   5. %₂₀dimetil sülfoksit (DMSO)/metanol (1 hacim %30 H 2 O₂/1 hacim DMSO/4 hacimli metanol, buz gibi soğuk) içinde %5 hidrojen peroksit (_H2 O₂) içeren ağartıcı numuneleri gece boyunca 4 °C'de (çalkalanma).
   6. Ağartmadan sonra, numuneleri RT'de iki kez 1 saat boyunca metanol içinde yıkayın (çalkalayarak).
   7. RT'de %20 DMSO/metanol ile 1 saat boyunca iki kez yıkayın (sallama).
   8. RT'de 1 saat (sallama) için% 80 metanol içinde yıkayın.
   9. RT'de 1 saat (çalkalama) için% 50 metanol içinde yıkayın.
   10. PBS'de RT'de iki kez 1 saat boyunca yıkayın (sallayarak).
   11. RT'de PBS/%0,2 Triton X-100'de 1 saat boyunca iki kez yıkayın (sallama).
3. Berrak beyinlerin immün boyaması
   1. Orbital çalkalayıcıda gece boyunca 37 °C'de numuneleri 1x PBS / % 0.2 Triton X-100 / % 20 DMSO / 0.3 M glisin içinde inkübe edin.
   2. 1x PBS/%0.2 Triton X-100/%10 DMSO/%6 keçi serumunu 37 °C'de yörüngesel çalkalayıcıda 3 gün boyunca bloke edin.
   3. Numuneleri domuz mukozasından 1x PBS/%0,2 Tween-20/10 μg/mL heparin sodyum tuzunda 37 °C'de iki kez 1 saat yıkayın ve daha sonra 2 gün boyunca yörüngesel çalkalayıcıda 37 °C'de 1:500 konsantrasyonda tavşan anti-GFP AlexaFluor 488 içeren 1x PBS/%0,2 Tween-20/10 μg/mL heparin/%5 DMSO/%3 keçi serumu içinde inkübe edin.
   4. Numuneleri 1x PBS/%0,2 Tween-20'de 10 μg/mL heparin ile 37 °C'de 1 saat boyunca orbital çalkalayıcıda üç kez ve daha sonra 2 gün boyunca günde bir kez yıkayın.
   5. Numuneleri 15 mL'lik konik bir tüp içinde %50 v/v Tetrahidrofuran (THF)/H₂O'nun 10 mL'sinde gece boyunca inkübe edin.
   6. Numuneleri 10 mL'de 1 saat boyunca %80 THF/H 2 O oranında_inkübeedin.
   7. Numuneleri% 100 THF'de 1 saat boyunca iki kez inkübe edin.
   8. Numuneleri steril bir mendille kurutun ve şişenin dibine batana kadar (yaklaşık 40 dakika) diklorometan içinde inkübe edin. >60 dakika kuluçkaya yatırmayın.
      NOT: Diklorometanı bir duman başlığı altında tuttuğunuzdan emin olun.
   9. Numuneleri 18 mL dibenzil eter (DBE) içinde berrak olana kadar (>2 saat) inkübe edin.
   10. Görüntülemeye hazır olana kadar örnekleri RT'de DBE'de saklayın.
       NOT: En iyi sonuçlar için, temizleme işlemi tamamlandıktan sonra numuneleri mümkün olan en kısa sürede görüntülemek önemlidir.

6. Lekeli slaytların veya temizlenmiş beyinlerin görüntülenmesi

1. İmmünoboyalı beyin bölümlerini görüntülemek için, çoklu antikorların birlikte ekspresyonunun doğrulanabileceği konfokal mikroskopi yoluyla slaytları analiz edin. HyD S hibrid dedektörlü bir Leica Stellaris 5 mikroskobu kullanıyoruz, ancak herhangi bir nokta taramalı konfokal mikroskop çalışacaktır. Hedefler arasında HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 ve HC PL APO 63x/1.40 yer alıyor.
   1. Doğru lazer çizgilerini ve emisyon filtrelerini yapılandırın. Gerekli lazerler ve buna karşılık gelen lazer yoğunlukları, kullanılan mikroskop ve florofor kombinasyonlarına tabidir.
      NOT: Her florofor veya çapraz konuşmayı azaltmak ve ortadan kaldırmak için kullanılan florofor grupları için uyarma ve emisyon spektrumlarına ince ayar yapmak için diyot 405 nm ve beyaz ışık lazerlerinin bir kombinasyonunu kullanıyoruz. Benzer sonuçlar geleneksel lazer/filtre kombinasyonları kullanılarak da elde edilebilir, ancak kanal kanamasına çok dikkat edin. Kanama, her bir lazerden hangi kanalların etkilendiğini görmek için istenen emisyon filtresi kombinasyonlarının her biriyle birlikte tek bir lazer çizgisini açarak tanımlanabilir. Örneğin, 405 nm lazer diyotu GFP emisyon filtresinde görünür floresan üretiyorsa, kanama meydana gelir. Birden fazla kanalın kare kare görüntülendiğinden emin olun, böylece taşma meydana gelmesini büyük ölçüde azaltın.
   2. Bir mTmG muhabiri ile birlikte boyanmış Tet-On beyinleri için, ikincil antikor üzerinde kullanılan floroforla eşleşmesi için DAPI (ör. 405 nm, em. 450 nm), GFP (ör. 488 nm, em. 509 nm), tdDomates (ör. 555 nm, em. 582 nm) ve karşılık gelen uzak kırmızı floroforu seçin. Alexa Fluor 647'yi öneririz (ör. 651 nm, em. 667 nm).
   3. İlk önce hem GFP hem de floresan ikincil ile boyanmış bir Cre-control beyni ile ayarlar oluşturun. Bu beyin dilimleri, floresan antikorlarından gelen arka plan floresansını kontrol edecek ve gerçek GFP sinyali göstermeyecektir.
   4. Analizde hiçbir sinyalin kaçırılmadığını doğrulamak için her beyin bölümünü yukarıdan aşağıya, soldan sağa analiz edin. Aynı beyin bölümünü çeşitli büyütmelerde görüntülüyorsanız, daha yüksek büyütme mDomates sinyalini daha hızlı ağartacağından, önce daha düşük büyütmelerin kullanılması önerilir.
2. Temizlenmiş beyinleri görüntülemek için, otomatik bir aşama ve otomatik döşeme işlevine sahip ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanın. Leica Stellaris 5 mikroskobu kullanıyoruz. Numuneler çok kalın olduğundan (>500 μm), etkili bir şekilde elde edilebilecek büyütmeyi sınırlayan daha büyük çalışma mesafeleri gereklidir. Tüm temizlenmiş beyin görüntülemeleri için HC PL APO 10x/0.40 CS2 hedefini kullanıyoruz.
   1. Temizlenmiş bir beyin bölümünü cam tabanlı bir kaba düz bir şekilde yerleştirerek başlayın ve dibenzil etere batırın.
      NOT: Dibenzil eter, çoğu objektif lens ve çoğu plastik için aşındırıcıdır. Bu nedenle, cam alt tabaktaki herhangi bir iç plastiğin hızlı kuruyan silikon elastomer ile kaplanması gerekir.
   2. Doğru lazer çizgilerini ve emisyon filtrelerini yapılandırın. Bir mTmG muhabiri ile birlikte boyanmış Tet-On beyinleri için, ikincil antikor üzerinde kullanılan floroforla eşleşmesi için DAPI, GFP, tdDomates ve karşılık gelen uzak kırmızı floroforu seçin. İstediğiniz çözünürlüğü ayarlayın, en az 1024 x 1024 öneririz. İğne deliğini 1 AU olarak ayarlayın.
   3. Lazer yoğunluğunu ve dedektör kazancını ilk önce hem GFP hem de floresan ikincil ile boyanmış bir Cre-control beyni ile ayarlayın. Bu beyin dilimleri, floresan antikorlarından gelen arka plan floresansını kontrol edecek ve gerçek GFP sinyali göstermeyecektir.
   4. Lazer yoğunlukları ve dedektör kazancı optimize edildikten sonra, görüntüleme için beynin haritasını çıkarın. Görüntü alımının X ve Y eksenini ayarlamak için beyin bölümünün tüm çevresini bularak başlayın. Ardından, odak noktasını yaklaşık olarak dokunun merkez derinliğine ayarlayarak Z eksenini tanımlayın ve dokunun "en yüksek" noktasını (en pozitif Z değeri) bulmak için Z konumlandırma kontrollerini kullanın. Gerektiğinde maksimum Z ekseni yüksekliğini artırarak dokunun çeşitli bölgelerini tarayın.
      1. Dokunun tüm kalınlığını elde etmek için gereken "en düşük" (en negatif Z-değeri) nokta için tekrarlayın. Stellaris 5, odak noktasının ± 250 um'luk bir sınıra sahiptir. Bu, optik bölümleri Z ekseninde 500 μm kalınlığa sınırlar. Beyin bölümünün 3B alanı artık bilinmektedir.
   5. Z-adım boyutunu 6 μm olarak ayarlayın ve görüntüyü almaya başlayın. Edinme süresi çeşitli faktörlere bağlıdır ve istenen parametrelere bağlı olarak saatlerden günlere kadar değişebilir. Görüntü alma süresini kısaltmak için çözünürlükleri azaltmayı, lazer tarama hızını artırmayı veya adım boyutunu artırmayı deneyin.
   6. Temizlenmiş tüm beyin bölümünün döşenmiş görüntüsü yakalandıktan sonra, istediğiniz gibi analiz edin.

Bir floresan muhabiri olan bir Tet-On sisteminden kaynaklanan floresan sinyali, ilginin destekleyicisine ve kullanılan florofor (lar) a bağlı olarak değişmekle birlikte, bulguların mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG hayvanlarıyla nasıl analiz edildiğini açıklayacağız. Bir nabız kovalamacasından sonra yetişkin beyinlerinin analizi, çeşitli anatomik nişler boyunca membran GFP eksprese eden hücrelerle sonuçlandı. Çeşitli hücre tipleri arasındaki floresan yoğunluğundaki fark not edilmelidir. Floresan yoğunluğu ile ilgili bir değişken, hücre zarının boyutudur. Örneğin, koroid pleksustaki koroid epitel hücreleri (CPEC'ler), kalın bir hücre zarına ve çevredeki hücrelerden kolayca ayırt edilebilen güçlü floresan sinyaline sahiptir (Şekil 4A, B). Bununla birlikte, koroid pleksus stromadaki diğer küçük ve şu anda tanımlanamayan hücre tipleri daha zayıf bir GFP sinyaline sahipti (Şekil 4C). Beyincikte, Bergmann glial hücreleri sepet hücrelerinden daha yüksek mGFP seviyeleri ifade etti ve mGFP ekspresyonundaki varyasyon bireysel sepet hücreleri arasında bile vardı (Şekil 4D). Koku alma ampulünün glomerüler tabakası içindeki koku duyusal nöron aksonları da yüksek düzeyde mGFP eksprese etti (Şekil 4A, E). Tüm mGFP + hücrelerinin tanımlanmasını sağlamak için, mTmG hayvanlarının beyinleri boyunca hem parlak hem de loş GFP + hücrelerini tanımlamak önemlidir. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG hayvanlarında, serebral korteks de dahil olmak üzere beyin bölgelerinde düşük arka plan mGFP ekspresyonu gözlemledik (Şekil 4A). İlginç bir şekilde, beyincik ve beyin sapı bu şekilde daha düşük arka plan mGFP ekspresyonu gösterdi (Şekil 4A).

Bir soy izinden sonra beyin dokusunun analizi sırasında, hem beyin bölgelerinde hem de hücre tiplerinde mGFP ve mDomates ekspresyon modellerinde farklılıklar olacaktır. Koku alma ampulünün glomerüler tabakasını dolduran koku duyusal nöron aksonları, aynı nöronlar mGFP + olsa bile, diğer beyin bölgelerinin çoğuna kıyasla yüksek düzeyde membran domatesi ifade etti ve bu da bazı hücrelerin mDomates sinyalini daha yavaş kaybettiğini gösterdi (Şekil 4D). Buna karşılık, koroid pleksusta, mGFP + hücreleri düşük mDomates eksprese etti (Şekil 4B, C). Diğer beyin bölgelerinin çoğunda domates sinyali hücre tipleri arasında eşit olarak yayılır, endotel hücreleri, floresan sinyali kırmızı floresan arka plandan sıyrılacak kadar parlak olan tek hücrelerden bazılarıdır (Şekil 4B). mGFP ekspresyonunun aktivasyonu ve mDomates'in rekombinasyon sırasında genomdan bölünmesi, mDomates ekspresyonunun kaybına neden olur, ancak membran üzerinde eksprese edilen mDomates floroforları bozulana kadar korunur. Bu nedenle, mGFP + hücreleri genellikle rekombinasyonun güncelliğine, hücre tipine ve hücre zarının boyutuna bağlı olacak değişken mDomates sinyalini ifade edecektir. Bu nedenle, hücreleri mGFP ekspresyonuna dayanarak analiz etmek ve hem mGFP hem de mTomato'yu ifade ediyorlarsa onları analizden dışlamamak önemlidir.

Alternatif muhabirler Tet-On sistemi ile birlikte de kullanılabilir. Cre rekombinasyonu, normalde Rosa-GFP veya Rosa-RFP hayvanlarında herhangi bir floresan etiketi ifade etmeyecek hücrelerde GFP veya RFP ekspresyonunu indüklemek için hareket edebilir. Burada, GFP veya RFP'nin analizi, ilgilenilen promotörün ifadesini gösterecek ve mTmG hayvanlarında olduğu gibi hiçbir florofor sinyali kaldırılmayacaktır. Tek florofor muhabirleri, mTmG hayvanlarındaki membran domatesi kırmızı dalga boyunda lekelenmeyi önlediğinden, daha fazla floresan antikor kombinasyonu ile immün boyama sağlar.

Şekil 1. Tet-On fare hattının oluşturulması. (A) Tek tek fare çizgilerinden mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG farelerinin oluşturulması için ıslah şemasının ana hatları. (B) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fare hattındaki Tet-On sisteminin şeması. (C-D) Germline olmayan (C) ve germline (D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG farelerden bir epifloresan mikroskobun FITC kanalı ile görüntülenen kulak klipslerinin temsili görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Soy izleme Tet-On fareleri ile deneysel tasarımlar. Tet-On fareleri ile bazal proliferasyon, migrasyon ve farklılaşmadan (1) rejenerasyon veya yeniden dengelenme kovalamacası olmadan doks nabız sırasındaki tedavilere (2), uzun vadeli etkileri görselleştirme fırsatı ile nabız sırasındaki müdahalelere kadar mümkün deneylerin illüstrasyonları (3). Daha sonra kovalama olmadan 2 günlük kısa bir nabız, TERT + hücrelerinin bazal durumuna dair fikir verecektir, çünkü bu hücrelerin aktive edilmesi, çoğalması, göç etmesi veya farklılaşması için çok az zamanı olacaktır (4). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fare beyinlerinin beyin temizliği. (A) Fiksasyondan sonra 1 mm beyin kesitinin Sagital kesitlenmesi. (B) Bireysel beyin bölümleri, iDISCO beyin temizliği39 için 5mL tüplere yerleştirilir. (C) Temizlenmiş beyinler cam alt tabaklara yerleştirilir ve görüntü elde etme sırasında kırılma indisi eşleşmesi için DBE'ye batırılır. (D) Beynin tüm alanını, beynin kapsamlı bir 3D görüntüsünü oluşturmak için bir araya getirilecek bir dizi Z-yığını olarak yakalayın. Bu daha sonra 3B veri kümesinden bir 2B görüntü oluşturmak için öngörülen Z-maksimum yoğunluk olabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Yetişkin mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fare beyinlerinin soy takibi 3 haftalık nabız ve 11 günlük doksisiklin kovalamacasından sonra. (A) Yetişkin mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG farenin temizlenmiş beyin bölümü, iç kısımlarla gösterilen mGFP sinyalinin belirli alanları ile (N = 3 erkek fare). (B-C) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG koroid pleksusunun mGFP+ CPEC'leri (B) ve daha küçük, daha sönük mGFP+ hücre tiplerini (C; N = 4 erkek, N = 6 kadın). (D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG serebellar Bergmann glia (parlak) ve sepet hücrelerinin sepet hücrelerinin sepetli görüntüsü, beyinciğin moleküler tabakasında (loş; N = 4 erkek, N = 6 kadın). (E) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG beyinlerinin koku alma glomerüler tabakasının temsili görüntüsü. Noktalı çizgiler glomerüler bölmeleri gösterir (N = 4 erkek, N = 6 dişi). Ölçek çubukları 100 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 1. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 2. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.