Özet

Vaskülarize Kompozit Allotransplantasyon için Ex Vivo Perfüzyon Bazlı Biyoreaktör Kullanılarak Sıçan Arka Bacaklarının Tedariği ve Desellülarizasyonu

Published: June 09, 2022
doi:

Özet

Bu yazıda kompozit sıçan arka bacakları için cerrahi teknik ve desellülarizasyon süreci anlatılmaktadır. Desellülarizasyon, bir ex vivo makine perfüzyon sistemi aracılığıyla düşük konsantrasyonlu sodyum dodesil sülfat kullanılarak gerçekleştirilir.

Abstract

Ciddi travmatik yaralanmaları ve doku kaybı olan hastalar karmaşık cerrahi rekonstrüksiyon gerektirir. Vaskülarize kompozit allotransplantasyon (VCA), kompozit bir alt birim olarak birden fazla dokunun transferi için gelişen bir rekonstrüktif yoldur. VCA’nın umut verici doğasına rağmen, uzun süreli immünsüpresif gereksinimler, maligniteler, son organ toksisitesi ve fırsatçı enfeksiyonlar riskinin artması nedeniyle önemli bir sınırlamadır. Asellüler kompozit iskelelerin doku mühendisliği, immünsüpresyon ihtiyacını azaltmada potansiyel bir alternatiftir. Burada, bir sıçan arka bacağının tedariki ve ardından sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak desellülarizasyonu açıklanmaktadır. Sunulan tedarik stratejisi ortak femoral artere dayanmaktadır. Bir makine perfüzyon bazlı biyoreaktör sistemi inşa edildi ve arka bacağın ex vivo desellülarizasyonu için kullanıldı. Başarılı perfüzyon desellülarizasyonu gerçekleştirildi ve arka bacak beyaz yarı saydam benzeri bir görünüm elde edildi. Arka bacak boyunca sağlam, perfüzyona uğramış, vasküler bir ağ gözlendi. Histolojik analizler, nükleer içeriğin çıkarıldığını ve tüm doku bölmelerinde doku mimarisinin korunduğunu gösterdi.

Introduction

VCA, karmaşık cerrahi rekonstrüksiyon gerektiren hastalar için yeni ortaya çıkan bir seçenektir. Travmatik yaralanmalar veya tümör rezeksiyonları, rekonstrüksiyonu zor olabilen hacimsel doku kaybına neden olur. VCA, deri, kemik, kas, sinirler ve damarlar gibi çoklu dokuların bir donörden bir alıcıya kompozit greft olarak nakledilmesini sağlar1. Umut verici doğasına rağmen, VCA uzun süreli immünosüpresif rejimler nedeniyle sınırlıdır. Bu tür ilaçların yaşam boyu kullanımı, fırsatçı enfeksiyonlar, maligniteler ve son organ toksisitesi için artmış riske neden olur 1,2,3. İmmünsüpresyon ihtiyacını azaltmaya ve / veya ortadan kaldırmaya yardımcı olmak için, VCA için desellülarizasyon yaklaşımlarını kullanan doku mühendisliği iskeleleri büyük umut vaat etmektedir.

Doku desellülarizasyonu, hücresel ve nükleer içeriği uzaklaştırırken hücre dışı matriks yapısının korunmasını gerektirir. Bu desellülarize iskele, hastaya özgü hücrelerle yeniden doldurulabilir4. Bununla birlikte, ECM kompozit doku ağının korunması ek bir zorluktur. Bunun nedeni, bir iskele içinde değişen doku yoğunluklarına, mimarilerine ve anatomik konumlarına sahip çoklu doku tiplerinin varlığıdır. Mevcut protokol, bir sıçan arka bacağı için cerrahi bir teknik ve bir desellülarizasyon yöntemi sunmaktadır. Bu, bu doku mühendisliği tekniğini kompozit dokulara uygulamak için bir kavram kanıtı modelidir. Bu aynı zamanda reselülilarizasyon yoluyla kompozit dokuları yeniden oluşturmak için sonraki çabaları da tetikleyebilir.

Protocol

Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü’nden elde edilen kadavra erkek Lewis sıçanları (300-430 g) tüm deneyler için kullanıldı. Tüm cerrahi prosedürler için, aseptik tekniği sürdürmek için steril aletler ve malzemeler kullanıldı ( bakınız Malzeme Tablosu). Tüm prosedürler, Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü, Üniversite Sağlık Ağı’ndaki (Toronto, ON, Kanada) Hayvan Bakım Komitesi’nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Toplam dört arka baca…

Representative Results

Tedarik protokolü, sonraki perfüzyon adımları için ortak femoral arterlerin izole edilmesi ve kanülasyonunda başarılı olmuştur. Şekil 1A,B’deki temsili diseksiyon görüntüleri, bifurkasyon noktalarından yeterli mesafede femur damarlarının insizyon yerini ve maruziyetini göstermektedir. Şekil 2, biyoreaktör ve perfüzyon devresini hazırlamak için gerekli olan aparatı göstermektedir. Desellülarizasyonun bitiş noktası, do…

Discussion

Sıçan arka bacakları VCA 5’te deneysel modeller olarakkullanışlıdır. Asellüler iskelelerin doku mühendisliği, VCA ile ilişkili uzun süreli immünsüpresyon rejimlerinin eksikliklerini ele almada ilk adımı temsil eder. Kompozit greftlerin kullanımı, her biri benzersiz fonksiyonel, immünojenik ve yapısal özelliklere sahip çoklu dokuların varlığı göz önüne alındığında ek bir zorluk oluşturmaktadır. Mevcut protokol, asellüler kompozit sıçan arka bacaklarının elde …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Şekil 3A, BioRender.com yılında oluşturulmuştur.

Materials

0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL Baxter Corporation JB1308M
1 mL Disposable Serological Pipets VWR 75816-102
10 cc Disposable Syringes Obtained from Research Institution
3-way Stopcock Obtained from Research Institution
5cc Disposable Syringes Obtained from Research Institution
70% Isopropyl Alcohol Obtained from Research Institution
Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm VWR CA28143-310
Adson Forceps, Straight Fine Science Tools 11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”)  VWR 38112
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL Multicell 450-115-EL
Bone Cutter Fine Science Tools 12029-12
Connectors for  1/16" to 1/8" Tubes McMasterCarr 5117K52
Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID McMasterCarr 51525K328
Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Fine Forceps with Micro-Blunted Tips Fine Science Tools 11253-20
Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL LEO Pharma Inc. 006174-09
Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID McMasterCarr 51525K322
Micro Needle Holder WLorenz 04-4125
Microscissors WLorenz SP-4506
Peracetic Acid Sigma Aldrich 269336-100ML
Peristaltic Pump, 3-Channel Cole Parmer RK-78001-68
Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL Wisent 311-425-CL
Povidone Surgical Scrub Solution Obtained from Research Institution
Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL Cole Parmer RK-96450-40
Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone Cole Parmer RK-96410-16
Scalpel Blade – #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handle – #3  Fine Science Tools 10003-12
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg Bioshop SDS003.1
Surgical Suture #6-0 Covidien VS889

Referanslar

  1. Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
  2. Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
  3. Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
  4. Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
  5. Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
  6. Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
  7. Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
  8. Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
  9. Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
  10. Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
  11. Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
  12. Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Adil, A., Karoubi, G., Haykal, S. Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation. J. Vis. Exp. (184), e64069, doi:10.3791/64069 (2022).

View Video