Sıvı biyopsi, onkoloji translasyonel çalışmalarına yaklaşımımızda devrim yarattı ve örnek toplama, kalite ve depolama, başarılı klinik uygulaması için çok önemli adımlardı. Burada, çoğu translasyonel araştırma laboratuvarında uygulanabilecek aşağı akış dolaşımsız DNA uygulamaları için standartlaştırılmış ve doğrulanmış bir protokolü açıklıyoruz.
Sıvı biyopsisi (LB) terimi, birincil ve / veya metastatik tümörden kaynaklanan kan ve diğer vücut sıvılarındaki proteinler, DNA, RNA, hücreler veya hücre dışı veziküller gibi molekülleri ifade eder. LB, translasyonel araştırmalarda bir dayanak noktası olarak ortaya çıkmış ve solid biyopsiye minimal invaziv bir alternatif sunarak klinik onkoloji uygulamasının bir parçası haline gelmeye başlamıştır. LB, kan gibi minimal invaziv bir numune ekstraksiyonu yoluyla bir tümörün gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Uygulamalar arasında erken kanser tespiti, hastalık progresyonunun tespiti için hasta takibi, minimal rezidüel hastalığın değerlendirilmesi ve moleküler progresyon ve direnç mekanizmasının potansiyel olarak tanımlanması yer almaktadır. Klinikte rapor edilebilen bu örneklerin güvenilir bir analizini elde etmek için, preanalitik prosedürler dikkatlice düşünülmeli ve kesinlikle takip edilmelidir. Örnek toplama, kalite ve depolama, aşağı akış uygulamalarında kullanışlılıklarını belirleyen önemli adımlardır. Burada, dolaşımda olmayan DNA’ya dayalı aşağı akış sıvı biyopsi analizi için plazma ve serum örneklerinin toplanması, işlenmesi ve depolanması için sıvı biyopsi çalışma modülümüzden standartlaştırılmış protokoller sunuyoruz. Burada sunulan protokoller standart ekipman gerektirir ve biyolojik prosedürlere odaklanan çoğu laboratuvarda uygulanacak kadar esnektir.
“Sıvı biyopsi” terimi 2010 yılında1 birincil tümörden kaynaklanan kan ve diğer vücut sıvılarında moleküllerin (örneğin, protein, deoksiribonükleik asit (DNA), ribonükleik asit (RNA)), hücrelerin veya hücre dışı veziküllerin (örneğin, eksozomlar) varlığı olarak tanımlanmıştır. Sıvı biyopsi örneklerinin kullanımı, translasyonel onkoloji araştırmalarında devrim yaratmıştır, çünkü belirli bir anda belirli bir bölgeyle sınırlı olan doku biyopsileri, tümör heterojenliği nedeniyle ilgili klonları kaçırabilir. Ek olarak, sıvı biyopsi, primer dokunun az olduğu veya erişilemediği tümör tiplerinde ilgili bir rol oynar, çünkü invaziv bir biyopsiden kaçınabilir, hastalar için maliyetleri ve riski azaltabilir. Ayrıca, tümörün moleküler özellikleri esas olarak tedavi baskısı nedeniyle sürekli olarak gelişmektedir ve sıvı biyopsi örnekleri, tümör klonal dinamiklerini, hastalığın başlangıç, tedavi, en iyi yanıt ve hatta daha önce olduğu gibi hastalığın farklı klinik ve terapötik zamanlarında uzunlamasına alınabildikleri için yakalayabilir. “Gerçek zamanlı sıvı biyopsisi” kavramı, tümördeki dinamik değişikliklerin gerçek zamanlı olarak izlenebileceği ve böylece bu hastalıkta hassas tıbba izin verilebileceği anlamına gelir. Sıvı biyopsi, kanserin taranması ve erken teşhisi, hastalığın gerçek zamanlı izlenmesi, minimal kalıntı hastalığın tespiti, tedavi direnci için mekanizmaların incelenmesi ve hastaların terapötik düzeydesınıflandırılması dahil olmak üzere klinikte çok sayıda potansiyel uygulamaya sahiptir. Hastalığın nüksünün ve progresyonunun erken saptanması birçok tümör tipinde karşılanmamış bir klinik ihtiyaçtır ve kanser hastalarının sağkalımını ve yaşam kalitesini arttırmada anahtar faktördür. Rutin görüntüleme yöntemleri ve çözünür tümör belirteçleri bu görev için gereken duyarlılık ve/veya özgüllükten yoksun olabilir. Bu nedenle, klinikte, dolaşımdaki serbest nükleik asitlere dayananlar gibi yeni prediktif belirteçlere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Sıvı biyopsi çalışmaları için kullanılan örnek türleri kan, idrar, tükürük ve dışkı örneklerini içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Diğer tümöre özgü örnekler hücre aspiratları, beyin omurilik sıvısı, plevral sıvı, kist ve asit sıvısı, balgam ve pankreas suyu2 olabilir. Eski sıvılar, farklı tipte kanserden türetilmiş materyaller, dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC) veya eksozomlar ve hücresiz dolaşımdaki tümör DNA’sı (ctDNA) gibi fragmanlar içerebilir. Nükleik asitler hücre dışı veziküllerde (EV’ler) kapsüllenebilir veya hücre ölümü ve hasarı nedeniyle vücut sıvılarına salınabilir. Dolaşımdaki serbest DNA (cfDNA) esas olarak apoptotik veya nekrotik hücrelerden kan dolaşımına salınır ve tüm bireylerde bulunur, enflamatuar veya onkolojik hastalıklarda artmış seviyeler gösterir3. Eksozomlar, nükleik asitler, proteinler ve lipitler içeren hücreler tarafından salgılanan küçük hücre dışı veziküllerdir (~ 30-150 nm). Bu veziküller hücreler arası iletişim ağının bir parçasını oluşturur ve birçok vücut sıvısı türünde yaygın olarak bulunur2. EV’lerin içindeki nükleik asitler, vücut sıvıları içindeki sert ortamdan korunur, böylece bu molekülleri sıvı biyopsi ortamında incelemek için daha sağlam bir yol sağlar.
Genel olarak, sıvı biyopsi örneklerinde dolaşımdaki nükleik asit seviyeleri çok düşüktür ve bu nedenle dijital PCR veya yeni nesil dizileme (NGS) gibi algılama için hassas yöntemlere ihtiyaç vardır. Numunenin preanalitik yönetimi, kan hücresi lizisini ve bozulmamış DNA’nın salınmasını önlemek için çok önemlidir, bu da cfDNA’nın genomik DNA ile kontaminasyonuna neden olur. Ayrıca, enzim bazlı analiz yöntemlerinin inhibitörlerinin varlığından kaçınmak için numuneler çıkarılırken dikkatli olunmalıdır.
Burada, dolaşımdaki nükleik asit analizleri de dahil olmak üzere sıvı biyopsi bazlı aşağı akış uygulamaları için çok önemli bir ilk adım olan plazma ve serum örneklerinin toplanması ve depolanması için standartlaştırılmış bir yöntem sunuyoruz.
Sıvı biyopsi, kanser yönetimi sırasında farklı zamanlarda çok sayıda potansiyel uygulamaya sahiptir. İlk olarak, tanıda, klinik olarak daha fazla araştırılabilecek potansiyel bir tümör lezyonunun varlığını düşündürecek tümör moleküler belirteçlerini tanımlamak. İkincisi, hastalığın gerçek zamanlı izlenmesi için tedavi sırasında, tedavi moleküler yanıtının değerlendirilmesi, klonal evrim ve hastalık nükslerinin veya tedavi direncinin erken tespiti. Son olarak, cerrahi tedaviden …
The authors have nothing to disclose.
Kanserde Biyomedikal Araştırma Ağı’na (CIBERONC) destekleri ve aşağıdaki proje hibeleri için teşekkür ederiz: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC sıvı biyopsisinin standardizasyonu ve teşviki için platform. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |