Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transkripsiyon Tahlillerinin Temel Bileşenleri

Lyme hastalığı ve tekrarlayan ateş, Borrelia ve Borreliella ^1,2,3 cinslerindeki spiroket patojenlerinden kaynaklanır. Lyme hastalığı, Kuzey Amerika'da belirgin bir vektör kaynaklı hastalıktır ve sonuç olarak, Borreliella burgdorferi, spiroket biyolojisini incelemek için önde gelen bir model organizmadır ^4,5. Transkripsiyonel düzenlemenin B. burgdorferi mekanizmalarına yönelik araştırmalar, kene vektörü ile memeli konakçıları arasında dönerken çevredeki değişikliklere adaptasyonlarını daha iyi anlamayı amaçlamaktadır ^6,7. pH, sıcaklık, ozmolarite, besin mevcudiyeti, kısa zincirli yağ asitleri, organik asitler ve çözünmüş oksijen ve karbondioksit seviyelerindeki değişiklikler, B. burgdorferi'nin eklembacaklı vektöründe hayatta kalması ve hayvanları enfekte etmesi için önemli olan genlerin ekspresyonunu modüle eder 8,9,10,11,12,13,14,15^,16,17,18. Bu tepkileri uyaranlara düzenleyici mekanizmalarla ilişkilendirmek, B. burgdorferi araştırmasının önemli bir yönü olmuştur¹⁹.

Transkripsiyon faktörleri ve sigma faktörleri, hücresel süreçleri gerçekleştiren genlerin transkripsiyonunu kontrol eder. Lyme ve tekrarlayan ateş spiroketleri, nispeten seyrek bir transkripsiyon faktörleri seti ve alternatif sigma faktörleri barındırır. Buna rağmen, B. burgdorferi'nin çevreye verdiği tepkileri yönlendiren karmaşık transkripsiyonel değişiklikler vardır^20,21,22. Çevresel değişikliklere yanıt olarak B. burgdorferi'deki transkripsiyonel değişiklikleri yönlendiren spesifik mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. İn vitro transkripsiyon testleri, transkripsiyon faktörlerinin ve sigma faktörlerinin işlevini ve düzenleyici mekanizmalarını test etmek için biyokimyasal bir yaklaşım kullanmak için güçlü araçlardır^23,24,25,26.

B. burgdorferi RNA polimerazı kullanan bir in vitro transkripsiyon tahlil sistemi yakın zamanda kurulmuştur²⁴. Bakteriler genellikle benzersiz hücresel fizyolojilere sahip olduklarından, farklı türlerin ve cinslerin RNA polimerazları enzim saflaştırma, enzim depolama ve reaksiyon tamponu koşullarına farklı tepki verir²⁷. B. burgdorferi ayrıca RNA polimerazlarının incelendiği birçok bakteri türünden genetik olarak uzaktır²⁰. Lizis, yıkama ve elüsyon tamponu koşulları, depolama tamponu, in vitro transkripsiyon reaksiyon tamponu ve tahlil yapım yöntemi gibi enzim preparatının yönleri, RNA polimeraz aktivitesini değiştirebilir. Burada, RNA polimeraz ve sigma faktörü RpoD'nin saflaştırılması, doğrusal çift sarmallı DNA şablonunun üretimi ve bu sistemi kullanan laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için in vitro transkripsiyon testlerinin inşası için bir protokol sunuyoruz. RpoD'ye bağımlı transkripsiyon için doğrusal aralığı göstermek ve bu yaklaşımın sınırlamalarını ve alternatiflerini tartışmak için örnek bir reaksiyonu detaylandırıyoruz.

1. RNA polimerazın saflaştırılması ve RNA polimeraz stoğunun hazırlanması

1. Hücre peletini mikroaerofilik bir ortamda (34 °C, %5 CO 2, %3 O 2) BSKII ortamında kültürlenmiş 2-4 L B. burgdorferi RpoC-His10X'ten, daha önce tarif edilen hücre toplama protokolleri^28,29'u kullanarak_2-4 x 10⁷ hücre/mL yoğunluğa kadar toplayın. 500 mL santrifüjlü şişelerde 30 dakika boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'de santrifüjleme yapın ve süpernatanı dökün.
2. Hücreleri 30 mL buz gibi soğuk HN tamponunda (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8.0) yeniden askıya alın. Santrifüjleme adımını yukarıda açıklandığı gibi 50 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanarak tekrarlayın ve süpernatanı boşaltın.
   NOT: Durma noktası. Hücreleri 2 haftaya kadar saklamak için hücre peletini -80 ° C'de dondurun veya hemen hücre lizine devam edin.
3. Hücreleri, lizatı ve saflaştırılmış proteinleri donmadıkça 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun. Bu protokolde kullanılan her tampona 2 mM konsantrasyonda taze hazırlanmış DTT ekleyerek RNA polimerazı indirgeyici bir ortamda tutun ve pH 8.0'ı koruyun.
4. Kit talimatlarını izleyerek ticari bir bakteriyel lizis kiti kullanarak B. burgdorferi hücre peletinden lizat hazırlayın. Pelet, proteaz inhibitörü olmadan 10-15 mL oda sıcaklığı (RT) B-PER çözeltisinde tekrar askıya alın ve lizisin buz üzerinde 5 dakika ilerlemesine izin verin. Lizis hacmi, kit talimatlarında açıklandığı gibi hücre pelet boyutuna bağlıdır.
5. Lizis çözeltisine proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin, ardından temsili sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi üç tur sonikasyon ekleyin.
   NOT: Alternatif olarak, hücreleri daha önce^24'te açıklandığı gibi bir Fransız basınç hücresinde lize edin. 1.4 adımını atlayın. ve adım 1.5.
6. Santrifüjleme ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanarak filtreleme kullanarak hücre lizatını netleştirin. Çözeltiye kobalt kolon yükleme tamponu (Tablo 1) ekleyerek tüpün hacmini en az 30 mL toplam hacme doldurun. Hücre enkazını santrifüjleme ile 20.000 x g'de 30 dakika boyunca pelet haline getirin.
7. Süpernatantı 0,45 μm şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
8. Lizatı kobalt kolon yükleme tamponunda (Tablo 1) 1:10 nihai seyreltme oranı kullanarak seyreltin.
9. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir kobalt veya nikel-reçine sütunu kullanarak arıtılmış hücre lizat süpernatantı üzerinde afinite kromatografisi yapın. Örnek için temsili sonuçlar bölümüne bakın. Tablo 1'de listelenen arabellekleri kullanın. Analiz için akış, yıkama ve elüsyon örneklerini toplayın.
10. Elüsyon tampon çözeltisindeki RNA polimerazını, üreticinin talimatlarını izleyerek bir tampon değişim sütunu kullanarak derhal RNA polimeraz depolama tampon çözeltisine (Tablo 1) değiştirin.
11. RNA polimerazını 10 kDa-cutoff santrifüj filtre üniteleri kullanarak spektrofotometri ile belirlenen 0.2-0.4 mg / mL'lik bir konsantrasyona yoğunlaştırarak dondurucu stoklarını hazırlayın (Yok olma katsayısı ayarı olmadan_280nm [1 cm'de 1 abs = 1 mg · mL⁻¹]).
12. Aliquot RNA polimeraz dondurucu, PCR tüplerinde 20-50 μL hacimlerde stoklanır ve RNA polimerazı -80 ° C'de depolar.
13. Afinite kromatografisinin kalitesini SDS-PAGE ile belirleyin ve toplam protein verimini spektrofotometri veya BCA testi ile ölçün. SDS-PAGE ile iyi çözünürlük için numuneleri 120 V'ta 50 dakika boyunca% 7.5'lik bir poliakrilamid jel üzerinde çalıştırın.

2. Rekombinant RpoD'nin saflaştırılması ve RpoD stoğunun hazırlanması

1. BL21::MBP-RpoD_Bb'de Maltoz Bağlayıcı Protein etiketli rekombinant B. burgdorferi RpoD'nin (MBP-RpoD) ekspresyonunu kültüre alın ve indükleyin, Malzeme Tablosunda listelenen protein füzyon ve saflaştırma sistemi kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi ve hücreleri santrifüjleme yoluyla toplayın.
   NOT: Durma noktası. Hücreleri 2 haftaya kadar saklamak için hücre peletlerini -80 ° C'de dondurun veya hemen hücre lizine devam edin.
2. Ticari bir bakteri hücresi lizis kiti veya Fransız basınç hücresi kullanarak lizis gerçekleştirin. Tablo 1'deki örnek lizis arabelleğine bakın.
3. Santrifüjleme ve filtreleme kullanarak hücre lizatını netleştirin. Hücre enkazını santrifüjleme ile 20.000 x g'de 30 dakika boyunca pelet haline getirin. Süpernatantı 0,45 μm filtre kullanarak filtreleyin.
4. Ekspresyon sistemi için bir protein ekstraksiyon protokolü kullanarak MBP-RpoD'yi ayıklayın. Uygulama ayrıntıları ve sonuçları gibi temsili sonuçlar bölümüne bakın.
5. SDS-PAGE ile afinite kromatografisi işleminin ve elüsyonunun kalitesini belirleyin ve spektrofotometri ile protein verimini ölçün (Yok olma katsayısı ayarı olmadan_280nm [1 cm'de 1 abs = 1 mg · mL⁻¹]). SDS-PAGE'de ayırma için 30 dakika boyunca 200 V'ta %10 poliakrilamid jel kullanın.
6. MBP-RpoD'yi 10 kDa-kesme santrifüj filtre kullanarak spektrofotometri ile belirlenen >2 mg/mL konsantrasyonuna konsantre edin.
7. MBP'yi Faktör Xa bölünme bölgesinde RpoD'den ayırın. 2 mM'lik bir konsantrasyonda MBP-RpoD içeren afinite kromatografisi elüsyon fraksiyonlarına CaCl₂ ekleyin. Her 30 mg saflaştırılmış protein için 200 μg Faktör Xa Proteaz ekleyin. RT'de bir gecede kuluçkaya yatın.
8. MBP'nin RpoD'den SDS-PAGE ile tamamen ayrıldığını onaylayın. SDS-PAGE'de ayırma için 30 dakika boyunca 200 V'ta %10 poliakrilamid jel kullanın.
9. MBP ve RpoD içeren çözeltiyi, heparin bağlayıcı bir tamponla 1:10 oranında seyreltin.
10. Heparin sütunundaki MBP ve RpoD'yi FPLC ile ayırın. FPLC ayarları için Tablo 2'ye bakın.
11. SDS-PAGE ile afinite kromatografi ürünlerinin kalitesini belirleyin ve spektrofotometri ile protein verimini ölçün. SDS-PAGE'de ayırma için 30 dakika boyunca 200 V'ta %10 poliakrilamid jel kullanın.
12. RpoD içeren elüsyon fraksiyonlarını 10 kDa-kesme santrifüj filtre kullanarak 2-3 mL'lik son hacme kadar yoğunlaştırın.
13. Tampon, konsantre RpoD elüsyon fraksiyonlarını bir jel filtrasyon sütunu kullanarak depolama tamponuna değiştirin.
14. RpoD stoğunu, spektrofotometri ile belirlenen 0,2-0,8 mg/mL konsantrasyona kadar 10 kDa-kesme santrifüj filtre kullanarak konsantre edin.
15. Aliquot RpoD, PCR tüplerinde 20-50 μL hacimlerde stoklanır ve -80 ° C'de saklanır.

3. DNA şablon stoğunun hazırlanması

1. PCR, 200 μL'lik bir reaksiyon kullanarak B. burgdorferi genomik DNA'sından RpoD tahrikli bir promotör bölgesini çevreleyen 500 bp bölgesini güçlendirir (Tablo 3).
2. PCR ürünlerini ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Moleküler biyolojide DNA'yı H₂O sınıfında elute edin.
3. PCR tarafından üretilen DNA şablonlarının molar konsantrasyonunu, moleküler biyoloji sınıf_H2O'da seyreltme ile 100 nM'ye ayarlayın.

4. Radyoaktif işaretli nükleotidlerin dahil edilmesiyle in vitro transkripsiyon gerçekleştirin

1. Bir in vitro transkripsiyon deney planı hazırlayın. RNA polimeraz, RpoD ve DNA şablon konsantrasyonlarını belirleyin. Reaksiyon tüpleri için alikot hacimlerini ve pipetleme sıralarını belirleyin. Örnek için Tablo 4 ve Şekil 1'e bakınız.
   NOT: RNA polimeraz, alternatif polimeraz, şablon içermeyen reaksiyonlar veya alternatif şablonlar gibi kontrolleri deneysel plana dahil edin.
2. Deney için gereken ^α-32P-ATP hacmini hesaplayın. Bunu deneysel plana dahil edin. Tipik olarak, fosfor ekran tespiti için in vitro transkripsiyon reaksiyonu başına 2 μCi aktivite ekleyin.
3. Radyasyon kontaminasyon riskini azaltmak için radyasyon tezgahı da dahil olmak üzere çalışma yüzeylerini hazırlayın.
4. RNA polimeraz, Rpo, 5x tampon NTP ve şablon stok çözeltilerinin taze alikotlarını buz üzerinde çözün. Pipetlemeden önce çözülmüş tüm dondurulmuş stokları iyice karıştırın.
5. Deneysel plana göre radyoaktif işaretli nükleotidler için bir ana reaksiyon karışımı ve ayrı bir NTP karışımı hazırlayın.
6. Kontrol reaksiyonlarını ve deney setlerini, reaksiyona radyoetiket eklemenin hazırlanmasında PCR tüplerine dağıtın. H2 O, reaksiyon anakarışımı, RNA polimeraz ve RpoD'yi belirlenmiş PCR tüplerine nazikçe dağıtın ve pipetleme ile karıştırın.
7. Hazırlanan malzemeleri bir radyasyon tezgahına aktarın.
8. NTP'ye ^α-32P-ATP ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.
   DİKKAT: Radyoaktif malzemelerle çalışırken, radyoaktif izotoplar için uygun koruyucu ekipman ve taşıma prosedürleri kullanın.
9. Adım 4.6'dan itibaren in vitro transkripsiyon reaksiyon karışımlarını içeren tüplere NTP ekleyin.
10. Bir DNA şablonunun eklenmesiyle in vitro transkripsiyon reaksiyonunu başlatın. Reaksiyon hacmini nazikçe pipetleyerek karıştırın.
11. Tüpleri 37 ° C'de bir termosikler veya ısı bloğunda 5 dakika boyunca inkübe edin.
12. Reaksiyonları termosiklerden veya ısı bloğundan çıkarın ve in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını durdurmak için% 50 formamid içeren 2x RNA yükleme boyasını eşit bir reaksiyon hacmine ekleyin.
13. Bir termosiklet veya ısı bloğunda 5 dakika boyunca 65 ° C'de reaksiyonları inkübe ederek enzimleri denatüre edin.
14. 30-45 dakika boyunca 180 V'ta% 10-15 TBE üre poliakrilamid jelleri kullanarak% 10 -% 15 TBE üre poliakrilamid jelleri kullanarak jel elektroforezi ile in vitro transkripsiyon reaksiyonu karışımında RNA'yı ayırın.
    NOT: Jel elektroforezi koşullarına bağlı olarak, tampon çözeltisi radyoaktif işaretli nükleotitlerle kontamine olabilir veya jel, radyoaktif işaretli nükleotitlerin çoğunu veya tamamını içerebilir. Uygun radyoaktivite depolaması veya bertarafı için plan yapın.
15. Radyoaktif işaretli ATP içeren jelin herhangi bir bölümünü çıkardıktan sonra fosfoekran kullanarak radyoaktif etiketli RNA'yı görüntüleyin. Jeli gece boyunca (16 saat) fosfoekrana maruz bırakın ve bir fosfoekran görüntüleyici (100 μm çözünürlük, 700 V PMT tüp voltajı) kullanarak görüntüyü görüntüleyin.
16. Dansitometri yöntemlerini kullanarak verileri analiz etme²⁴.

Reaksiyonun sınırlayıcı adımının sigma faktörü aracılı transkripsiyon başlangıcı olduğu bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunda, transkripsiyon aktivitesi sigma faktörü miktarı ile doğrusal olarak artmalıdır. Radyoaktif işaretli nükleotidin RNA ürünlerine dahil edilmesinden kaynaklanan değişen sinyali gözlemlemek için iki RNA polimeraz konsantrasyonu ile birlikte bir dizi RpoD konsantrasyonunu test eden in vitro transkripsiyon deneylerinin hazırlanmasını sunuyoruz. RNA polimeraz, RpoD ve çift sarmallı DNA şablon stoklarının hazırlanmasının temsili sonuçları gösterilmiştir. Temsili in vitro transkripsiyon reaksiyonları, analiz için kabul edilebilir RNA polimeraz aktivite seviyelerinin bir örneği olarak hizmet eder.

RNA polimerazın saflaştırılması için, mikroaerofilik koşullar altında 34 ° C'de 4 L'lik bir B. burgdorferi RpoC-His10X kültürü yetiştirildi (% 5 CO2,% 3O2). Kültürler, karanlık alan mikroskobu kullanılarak spiroket yoğunluğu açısından yakından izlendi ve 4 x 107 spiroket / mL'den daha yüksek yoğunluklara ulaşmadan önce toplandı. Hücreler lizis için B-PER karışımında yeniden askıya alındı (Tablo 1). Hücre peleti pipetleme ile homojenize edildi, ardından RT'de 5 dakikalık inkübasyon yapıldı ve sonraki sonikasyon turları üçlü olarak 3 s boyunca gerçekleştirildi. Arıtılmış lizatlar, kobalt kolon yükleme tamponu ve 5 mL kobalt reçinesi ile toplam 180 mL hacme kadar seyreltildi. RpoC-His10X'in, karışımı 4 ° C'de 1 saat boyunca besleyerek kobalt reçinesine bağlanmasına izin verildi. Karışım bir yerçekimi akış kolonuna aktarıldı ve 40 mL kolon yıkama tamponu ile beş kez yıkandı. Bağlı protein, kolondan 5 mL elüsyon tamponu geçirilerek serbest bırakıldı ve elüpsiyon yedi kez tekrarlandı. Akış, yıkama ve elüsyon fraksiyonlarının örnekleri SDS-PAGE ile ayrıldı ve leke birleştirme ile görüntülendi (Şekil 1). RNA polimeraz çekirdek kompleksi, sırasıyla 154 kDa, 129 kDa ve 38.5 kDa boyutlarında RpoC, RpoB ve RpoA'dan oluşur. Şekil 1'de gösterilen temsili sonuç, RNA polimeraz kompleksini oluşturan üç peptidin boyutlarında üç belirgin bant göstermektedir. Afinite kromatografisinden gelen akış, 1.0 ile 1.7 arasında 260/280 oranına sahip 0.5-1 mg / mL protein içeriyordu ve bu da daha yüksek bir nükleik asit konsantrasyonunu gösteriyordu. Spektrofotometri ile belirlenen protein karışımının konsantrasyonunu takiben RNA polimeraz protein verimi 0.3 mg / mL idi.

RpoD protein stoklarını hazırlamak için, bir C-terminal Maltoz Bağlayıcı Protein etiketine sahip rekombinant RpoD, BL21 (DE3) pLysS E. coli'deki bir pMAL-C5X plazmidinden eksprese edildi. 2 L E. coli , 32 ° C'de 0.5 OD600nm'ye kadar yetiştirildi. Kültür daha sonra 1 saat boyunca RpoD ekspresyonunu indüklemek için 0.3 mM IPTG ile tedavi edildi. Hücreler santrifüjleme ile peletlendi ve B-PER'de lize edildi. Elde edilen 200 mL seyreltilmiş hücre lizatı, 10 mL amiloz reçinesi ile filtrelendi. Reçine, artık DNA ve peptitleri çıkarmak için sekiz kez 40 mL bağlayıcı tampon ile yıkandı. MBP etiketli RpoD, reçine kolonuna beş kez 5 mL elüsyon tamponu ile salındı. Bağlama ve yıkama basamaklarından ve elüsyon fraksiyonlarından gelen akış SDS-PAGE ile analiz edildi (Şekil 2A). Elüsyon fraksiyonundaki ana bileşen, MBP etiketli rekombinant B. burgdorferi RpoD'nin boyutuyla eşleşen ~ 115 kDa'lık bir peptittir. Elüsyon fraksiyonları birleştirildi, CaCl 2 konsantrasyonu2 mM'ye ayarlandı ve 40 mg saflaştırılmış proteine 100 μg FactorXa proteaz eklendi. Oda sıcaklığında gece boyunca sindirimi takiben, reaksiyon SDS-PAGE ile analiz edildi (Şekil 2B). Faktör Xa proteaz ile bölünmeyi takiben, karışımdaki iki ana ürün RpoD (73.6 kDa) ve MBP (45 kDa) idi. RpoD ve MBP proteinlerinin karışımı heparin afinite kromatografisi kullanılarak ayrıldı. Karışım, heparin bağlayıcı tamponda 1:10 oranında seyreltildi ve bir FPLC'de heparine bağlı bir reçine kolonuna yüklendi. RpoD, artan bir NaCl gradyanı ile 1 M'lik bir konsantrasyona salınıma edildi. Fraksiyonlar SDS-PAGE ile analiz edildiğinde, elüzyon fraksiyonunda 400-600 mM NaCl aralığında 73.6 kDa büyüklüğünde majör bir bant belirgindi (Şekil 2C). Bazı bozulmuş RpoD parçaları birlikte saflaştırıldı. RpoD içeren fraksiyonlar birleştirildi, tampon RpoD depolama tamponuna dönüştürüldü ve daha sonra 10 kDa-kesme santrifüj filtresi kullanılarak konsantre edildi. Son RpoD konsantrasyonu, spektrofotometri ile belirlenen 0.67 mg / mL (9.1 mM) idi.

B. burgdorferi flgB'nin promotör bölgesini kapsayan çift sarmallı bir DNA şablonu PCR tarafından üretildi. FggB promotörü, 30 ng B. burgdorferi DNA'sı24,30 içeren 200 μL'lik bir reaksiyon kullanılarak promotörün yukarı ve aşağı akımına (Tablo 6) karşılık gelen primerler tarafından güçlendirildi. PCR ürünü %1 agaroz jel içinde jel elektroforezi ile analiz edildi (Şekil 3). PCR ürünü, belirgin homojenliğe sahip kabaca 500 bp büyüklüğündeydi. Önemli olarak, tuzlar ve hücre bileşeni kontaminasyonu, in vitro transkripsiyon reaksiyon sonuçlarının değişkenliğine katkıda bulunabilir; DNA şablonunun PCR saflaştırma sütununda tamamen tuzdan arındırılmasını sağlıyoruz.

Transkripsiyonun şablon DNA'nın eklenmesiyle başlatıldığı deneysel bir şema, promotör tanıma ve transkripsiyon başlatma oranını test edebilir. Temsili deneylerimizde, 16 nM-1 μM arasında değişen suda iki kat seyreltme ile bir seyreltme serisi RpoD proteini hazırlanmıştır. Aktivite için gerekli iki değerli katyonları içeren bir reaksiyon tamponunda RNA polimeraz içeren bir ana karışım oluşturuldu (Tablo 4 ve Tablo 5). RpoD ve master mix, buz üzerinde birlikte alıntılandı. RNA polimeraz ve RpoD içeren ana karışımın inkübe edilmesine izin verilirken, in vitro transkripsiyonun diğer adımları hazırlandı. Üç kontrol reaksiyonu ekledik: ana karışımdan ayrı olarak hazırlanan pozitif bir kontrol reaksiyonu, in vitro transkripsiyon sinyalinin şablona bağımlı olmasını sağlamak için şablon DNA içermeyen negatif bir kontrol reaksiyonu ve sinyalin RNA polimerazın bağımlı olmasını sağlamak için RNA polimeraz içermeyen negatif bir kontrol reaksiyonu. Radyoaktif işaretli nükleotidler, geri kazanılamayan hacimleri telafi etmek için 20 reaksiyon için yeterli aliquot oluşturmak için 5 μL (α-32P-ATP) ila 20 μL 10x NTP stok karışımı karıştırılarak reaksiyona eklendi. Son olarak, flgB promotörünü kodlayan şablon DNA, daha önce planlanan pipetleme sırasını izleyerek pipetleme yoluyla reaksiyon tüplerine tanıtıldı (Şekil 4).

İn vitro transkripsiyon ile üretilen RNA fragmanlarından gelen sinyal, jel elektroforezi ile ayrılmış RNA içeren TBE-üre jelinin 16 saatlik bir maruz kalma süresini takiben fosfor ekranı ile tespit edildi. 500 nM ila 16 nM aralığında 50 nM RNA polimeraz ve RpoD içeren bir deney, 250 bp'lik RNA ürünleri üretti (Şekil 5). RpoD konsantrasyonunun her iki kat seyreltilmesi için, daha düşük bir birikmiş RNA ürünü seviyesi vardı. Belirgin bandın altında ortaya çıkan, transkripsiyon durması veya parçalanmış DNA şablonu nedeniyle eksik RNA fragmanlarını gösteren bir dizi düşük bp ürünü vardı. RNA ürünleri, şablon kontrolü olmadan yoktu, bu da bu tahlildeki sinyale katkıda bulunan eksojen DNA fragmanlarının olmadığını gösteriyordu. RNA polimeraz kontrolünde hiçbir sinyal tespit edilmedi, bu da B. burgdorferi RNA polimerazının bu tahlilde RNA üretimine katkıda bulunan tek polimeraz olduğunu gösteriyor.

İkinci bir deneyde, daha düşük bir konsantrasyonda 25 nM RNA polimeraz kullandık (Şekil 6). Şekil 5'e kıyasla test edilen RpoD konsantrasyonları aralığında daha az RNA ürünü tespit edildi ve arka plan sinyal yoğunluğu daha yüksekti. Bu, dansitometri ile aşağı akış analizi için sorunludur. Fosfor görüntüsü dansitometri ile analiz edildiğinde (Şekil 7), fosfoekrandan elde edilen dansitometri sinyali, her iki deneyde de reaksiyonda bulunan RpoD miktarı arasında doğrusal bir ilişki olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, yüksek arka plan sinyali ile yapılan deneyde, 25 nM RNA polimeraz ve 100 nM'den az RpoD içeren reaksiyon, göreceli transkripsiyon seviyesi karşılaştırmaları için güvenilmezdi.

Resim 1: Afinite kromatografisi ile saflaştırılan His-tagged B. burgdorferi RNA polimerazın ayrılması. Hücre lizatının akış fraksiyonu (şerit 1), ilk yıkama fraksiyonu (şerit 2), son yıkama fraksiyonu (şerit 3) ve beş elüsyon fraksiyonu (şerit 4-8) 2x numune yükleme tamponunda seyreltildi, kaynatıldı ve SDS-PAGE ile 200 V'ta bir gradyan poliakrilamid jel içinde 30 dakika boyunca ayrıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Jel elektroforezi ile RpoD saflaştırmasının analizi. (A) MBP etiketli RpoD'nin amiloz reçine afinite kromatografisi ile saflaştırılmasından havuzlanmış akış fraksiyonları (şerit 1 ve şerit 2), yıkama fraksiyonları (şerit 3-5) ve elüsyon fraksiyonları (şerit 6-10). (B) Faktör Xa proteaz kullanılarak MBP ve RpoD'nin bölünmesini takiben protein karışımı. (C) MBP ve RpoD'yi ayırmak için heparin afinite kromatografisinden artan bir NaCl gradyanı (şerit 2-9) ile akış çözeltisi (şerit 1) ve elüsyon fraksiyonları. Sunulan her jelde, numuneler 2x yükleme tamponu ile karıştırıldı, kaynatıldı ve 30 dakika boyunca 200 V'ta SDS-PAGE kullanılarak gradyan bir poliakrilamid jel içinde ayrıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İn vitro transkripsiyon şablonlarının PCR üretimi. 500 bp boyutunda amplikon içeren flgB promotörü (şerit 1 ve şerit 2) ve diğer promotör bölgelerin amplikonlarını içeren kontrol PCR reaksiyonları (şerit 3-4) gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Deneysel düzenleme ve pipetleme sıra planı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: B. burgdorferi RNA polimeraz kullanılarak in vitro transkripsiyon ile üretilen RNA'dan fosfor görüntü sinyalindeki RpoD'ye bağımlı değişkenlik. İn vitro transkripsiyon reaksiyonları 50 nM RNA polimeraz ve24 bantlarının üzerinde belirtilen değişen RpoD seviyelerini içeriyordu. RNA,% 10'luk bir TBE-üre jeli ile ayrıldı ve 16 saat boyunca radyoaktif bozunmadan gelen sinyali yakalamak için bir fosfor ekranı kullanıldı. Bu rakam Boyle ve arkadaşlarından değiştirilmiştir.24. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: İn vitro transkripsiyon tarafından üretilen RNA'dan fosfor görüntü sinyalindeki RpoD'ye bağlı değişkenlik. İn vitro transkripsiyon, 25 nM RNA polimeraz ve bantların üzerinde belirtilen çeşitli seviyelerde RpoD içeriyordu. RNA,% 15'lik bir TBE-üre jeli ile ayrıldı ve 16 saat boyunca radyoaktif bozunmadan gelen sinyali yakalamak için bir fosfor ekranı kullanıldı. Daha düşük RNA polimeraz konsantrasyonu ve daha yüksek arka plan sinyali, doğru ölçümün zorluğunu arttırdı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: RpoD seviyelerinin artması ile in vitro transkripsiyon reaksiyonlarında radyoaktif işaretli RNA birikiminin artması. Fosfor ekran görüntülemede tespit edilen sinyaller, arka plan çıkarma olmaksızın dansitometri ile analiz edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Medya tarifleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: FPLC ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: PCR reaksiyonları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: 50 nM RNA polimeraz deney planı ve hacim hesaplaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 5: 25 nM RNA polimeraz deney planı ve hacim hesaplaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 6: Bu protokolde kullanılan suşlar ve oligonükleotidler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.