Bu protokol, lazer mikrodiseksiyonu kullanarak histoloji ile çözülmüş hücre popülasyonlarının zenginleştirilmesi için lekeli, ince doku kesiti görüntülerinden patoloji onaylı ilgi alanlarının yapay zeka odaklı segmentasyonu için yüksek verimli bir iş akışını açıklamaktadır. Bu strateji, ilgilenilen hücre popülasyonlarını gösteren sınırların doğrudan lazer mikroskoplara aktarılmasını sağlayan yeni bir algoritma içerir.
Tümör mikroçevresi (TME), tümör, stroma ve bağışıklık hücresi popülasyonları dahil olmak üzere düzinelerce farklı hücre tipinden oluşan karmaşık bir ekosistemi temsil eder. Proteom düzeyindeki varyasyonu ve tümör heterojenitesini ölçekte karakterize etmek için, solid tümör malignitelerinde ayrık hücresel popülasyonları seçici olarak izole etmek için yüksek verimli yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu protokol, lazer mikrodiseksiyonu (LMD) kullanarak histoloji ile çözülmüş hücre popülasyonlarının seçici hasadı için hematoksilin ve eozin (H & E) lekeli, ince doku bölümlerinin görüntülerini patoloji tarafından doğrulanmış ilgi alanlarına ayıran yapay zeka (AI) tarafından sağlanan yüksek verimli bir iş akışını tanımlar. Bu strateji, dijital görüntü yazılımı kullanılarak ek açıklamalı, ilgilenilen hücre popülasyonlarını gösteren bölgelerin doğrudan lazer mikroskoplara aktarılmasını sağlayan ve böylece daha kolay koleksiyonlara olanak tanıyan yeni bir algoritma içerir. Bu iş akışının başarılı bir şekilde uygulanması, bu uyumlaştırılmış yöntemin, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile kantitatif, çoklanmış proteomik analiz için TME’den tümör hücresi popülasyonlarını seçici olarak toplamak için faydasını gösteren bir uygulama gerçekleştirildi. Bu strateji, rutin histopatoloji incelemesi ile tamamen bütünleşir, ilgilenilen hücresel popülasyonların zenginleştirilmesini desteklemek için dijital görüntü analizinden yararlanır ve multiomik analizler için TME’den hücre popülasyonlarının uyumlu bir şekilde toplanmasını sağlayarak tamamen genelleştirilebilir.
TME, tümör hücreleri, stromal hücreler, bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri, diğer mezenkimal hücre tipleri ve adipositler gibi çok çeşitli hücre tipleri ile birlikte karmaşık bir hücre dışı matris1 ile doldurulan karmaşık bir ekosistemi temsil eder. Bu hücresel ekosistem, farklı hastalık organ bölgeleri içinde ve arasında değişir ve karmaşık tümör heterojenitesine neden olur 2,3. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, heterojen tümörlerin ve düşük tümör hücreselliğine (düşük saflık) sahip tümörlerin sıklıkla kötü hastalık prognozu ile ilişkili olduğunu göstermiştir 2,3.
TME içindeki tümör ve tümör dışı hücre popülasyonları arasındaki moleküler etkileşimi ölçekli olarak anlamak için, aşağı akış multiomik analiz için ilgi çekici farklı hücresel popülasyonları seçici olarak toplamak için standartlaştırılmış ve yüksek verimli stratejiler gereklidir. Kantitatif proteomik, kanser biyolojisinin anlaşılmasını ilerletmek için hızla gelişen ve giderek daha önemli bir tekniği temsil eder. Bugüne kadar, proteomik kullanan çalışmaların üstünlüğü, tüm tümör dokusu preparatlarından (örneğin, kriyopulverize) ekstrakte edilen proteinlerle bunu yapmış ve TME 4,5,6’da proteom seviyesi heterojenitesinin anlaşılmasında bir kıtlığa yol açmıştır.
Klinik patoloji iş akışlarıyla sorunsuz bir şekilde entegre olan ve bunlardan yararlanan numune toplama stratejilerinin geliştirilmesi, altın standart, tanısal patoloji iş akışlarını son derece tamamlayıcı nitelikte olan yeni nesil histoloji çözümlü proteomiklere olanak sağlayacaktır. LMD, histolojik olarak boyanmış doku ince kesitlerinin mikroskobik incelemesi yoluyla hücresel alt popülasyonların veya ilgili bölgelerin (ROI’ler) doğrudan ve seçici bir şekilde toplanmasını sağlar7. Dijital patoloji ve AI özellikli analizdeki son büyük gelişmeler, TME içindeki benzersiz bileşimsel özellikleri ve ROI’leri, birçoğu moleküler değişiklikler ve tedaviye direnç ve hastalık prognozu gibi klinik hastalık özellikleri ile ilişkili olan otomatik bir şekilde tanımlama yeteneğini göstermiştir8.
Burada sunulan protokolde açıklanan iş akışı, dijital histopatoloji görüntülerindeki tümör YG’lerine seçici bir şekilde açıklama eklemek için ticari yazılım çözümlerinden yararlanır ve bu tümör yatırım getirilerini lazer mikroskoplara aktarmak için şirket içinde geliştirilen yazılım araçlarından yararlanır ve böylece aşağı akış multiomik analiz iş akışlarıyla sorunsuz bir şekilde bütünleşen ayrı hücresel popülasyonların otomatik olarak toplanması sağlanır. Bu entegre strateji, LMD operatör süresini önemli ölçüde azaltır ve dokuların ortam sıcaklığında olması gereken süreyi en aza indirir. Otomatik özellik seçimi ve LMD hasadının yüksek verimli kantitatif proteomiklerle entegrasyonu, TME’nin iki temsili epitelyal over kanseri histolojik alt tipinden, yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSOC) ve yumurtalık berrak hücreli karsinomundan (OCCC) diferansiyel analizi ile gösterilmiştir.
9,12,13,14,15işleme sırasında numune kalitesini korumak için FFPE ve/veya taze dondurulmuş dokulardan hedef hücresel alt popülasyonların zenginleştirilmesi için iş akışları ve metodolojileri geliştirmeyi ve/veya iyileştirmeyi amaçlayan çok sayıda çalışma emsali bulunmakla birlikte, değişkenliği azaltmak için moleküler analizler için klinik doku örnekleri hazırlamak üzere otomatik stratejiler geliştirmek için önemli bir ihtiyaç vardır. tekrarlanabilirliği artırmak. Bu iş akışı, klinik doku örneklerinden LMD tarafından ayrık hücre popülasyonlarının histoloji tarafından çözümlenmiş hasadı için mevcut görüntü analizi yazılım araçlarını (Malzeme Tablosuna bakınız) entegre eden standartlaştırılmış, yarı otomatik bir protokolü tanımlar.
Ayrık hücre popülasyonlarını yakalayan ROI’ların mekansal olarak çözümlenmiş LMD zenginleştirmesi, moleküler karakterizasyonu ve tanımlamayı iyileştirmek ve hücre seçici biyobelirteç keşfini kolaylaştırmak için multiomik analizlerden önce yeni nesil bir doku işleme adımını temsil eder. Bu protokol, doku kesitlerinin bir histolog tarafından ROI’nin manuel olarak bölümlendirilmesiyle ilişkili ortam ortamına sıklıkla uzun süre maruz kalmasını azaltarak mevcut metodolojileri geliştirir (LMD toplanmasından önce >1-2 saat sürebilir). Bunun yerine bu iş akışı, YG’nin yapay zeka destekli sınıflandırma ve segmentasyon ile önceden tanımlanmasına olanak tanır. Doku bekleme süresinin sınırlandırılması, fosfopeptitler ve mRNA gibi son derece kararsız moleküler hedeflerin değerlendirilmesinde veya bir hedef proteinin tespit için doğal konformasyonunda olmasına dayanan antikor tabanlı analitik tekniklerdeki sahte varyasyonları azaltacaktır.
Taranan slayt görüntüsünde açıkça görülebilen PEN membran slaydı üzerine düzgün kalibratör referanslarının kesilmesi, görüntü analiz yazılımının ( Malzeme Tablosuna bakın) LMD iş akışıyla entegrasyonunu sağlayan temel bileşenlerden biridir. Kalibratörlerin “V” şeklinin altında hassas (“temiz”) bir noktaya sahip olmasını sağlamak, 5.1.6 ve 5.2.13 numaralı adımlarda açıklandığı gibi, çizilecek kalibratör hatları için görüntü analiz yazılımında hassas bir noktanın seçilmesine olanak tanır. LMD yazılımına içe aktarma sırasında bu noktaların hizalanması, ek açıklamaların (“Malleator” ve/veya “Dapọ” algoritmaları kullanılarak uyumlu bir .xml dosyasının oluşturulmasıyla kolaylaştırılır) fiziksel LMD slaytındaki ilgili doku yatırım getirisine düzgün bir şekilde bindirilmesi için kritik öneme sahiptir. Lazer mikroskopta slayt aşamasının dikey (z-düzlemi) konumunu kaydetmek için LMD yazılımına içe aktarma sırasında hizalama hassas olsa bile tüm şekilleri vurgulamak ve toplu olarak “sürükleyip bırakmak” gerekir. Ek açıklamaların doku yatırım getirisi üzerindeki konumlandırılmasında küçük ayarlamalar da gerekirse bu adımda yapılabilir.
Malleator algoritmasının mevcut sürümünün bir sınırlaması, görüntü analiz yazılımı tarafından sağlanan önceden tanımlanmış ek açıklama şekli araçlarıyla uyumlu olmamasıdır ( bkz. Malzeme Tablosu), ancak algoritmanın gelecekteki güncellemeleri / sürümleri bu uyumluluğu geliştirmeyi hedefleyecektir. Bu araçlar kullanılarak çizilen şekiller için .annotation dosyası, bu noktaların etrafında tam uzamsal yönlendirme olmadan, her bir detaylandırma için yalnızca iki eşleştirilmiş x ve y koordinat kümesi içerir. Bu araçların geçerli kullanımı, ek açıklamaların içe aktarma işlemi sırasında yalnızca iki nokta tarafından tanımlanan düz çizgilere dönüştürülmesine neden olur. XML formatına başarılı bir şekilde dönüştürme ve LMD içe aktarma için doku yatırım getirisi segmentlerinin manuel olarak tanımlanması gerekir. Bu, hedef alana özgü bağımsız serbest el poligonal ek açıklamalarıyla her bir yatırım getirisini manuel olarak tanımlayarak veya istenirse tüm doku yatırım getirisi segmentlerine yaklaşık dairesel veya dikdörtgen bir ek açıklama uygulayarak gerçekleştirilebilir ve bu iş akışıyla uyumlu olacaktır.
Burada sunulan iş akışı, taze dondurulmuş insan kanser dokusu örneklerinin proteomik analizi için gösterilmiş olsa da, bu AI güdümlü LMD iş akışı, FFPE dokuları, kanserli olmayan doku tipleri ve insan dışı kaynaklardan gelenlerle eşdeğer olarak kullanılabilir. Ayrıca, transkriptomik, genomik veya fosfoproteomik analizler dahil olmak üzere diğer aşağı akış moleküler profil oluşturma iş akışlarını da destekleyebilir. Bu iş akışı ayrıca, hücre sayımı veya “Multiplex IHC” modülü veya “Doku Mikrodizisi (TMA) Eklentisi” dahil olmak üzere diğer analitik modüllerle ilişkili yetenekler de dahil olmak üzere görüntü analiz yazılımının diğer kullanımlarından da yararlanabilir ( Malzeme Tablosuna bakınız). Bu iş akışının gelecekteki uygulamaları, ROI segmenti başına hücre sayısını önceden tanımlamaktan ve böylece birden fazla koleksiyonda eşdeğer hücresel girdiler sağlamaktan veya immünohistokimya veya hücre sosyolojisi gibi ilgilenilen hücresel YG’leri tanımlamak için alternatif yöntemler kullanmaktan da yararlanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu projenin finansmanı kısmen Savunma Sağlık Programı (HU0001-16-2-0006 ve HU0001-16-2-00014) tarafından Jinekolojik Kanser Mükemmeliyet Merkezi için Üniformalı Hizmetler Üniversitesi’ne sağlanmıştır. Sponsorların çalışmanın tasarımı, yürütülmesi, yorumlanması veya yazılmasında hiçbir rolü yoktu. Feragatname: Burada ifade edilen görüşler yazarların görüşleridir ve Ordu / Deniz / Hava Kuvvetleri Bakanlığı, Savunma Bakanlığı veya ABD Hükümeti’nin resmi politikasını yansıtmamaktadır.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |