Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde açlığa bağlı otofajinin analizi

Otofaji, amino asit açlığı¹ dahil olmak üzere çeşitli streslerin neden olduğu "kendi kendine yeme" sürecidir. Makrootofaji (bundan böyle otofaji olarak anılacaktır) en iyi çalışılmış otofaji türüdür ve hücresel homeostazın korunmasında yeri doldurulamaz bir rol oynar². Otofajinin arızalanması çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir³. Ek olarak, otofaji ile ilişkili bazı genler çeşitli hastalıkların tedavisinde potansiyel hedeflerdir⁴.

Otofaji son derece sofistike bir şekilde düzenlenir⁵. Açlıktan öldükten sonra, izolasyon membranları çift membranlı otofagozomlar oluşturmak için sitoplazmik materyalleri ayırır⁶. Otofagozomlar daha sonra amfizomlar ve otolizozomlar oluşturmak için endozomlar ve lizozomlarla kaynaşır. Lizozomal hidrolitik enzimlerin yardımıyla, yutulan sitoplazmik içerikler parçalanır ve besinler geri dönüştürülür⁷.

Otofaji evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir⁸. Drosophila melanogaster, in vivo otofaji sürecini incelemek için harika bir modeldir. Amino asit açlığı, insan karaciğeri ve yağ dokusunun bir analoğu olan sinek yağ vücut dokusunda otofajiyi kolayca indükler⁹. Otofajideki kusurlar, diğerlerinin yanı sıra Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ve p62 gibi otofaji ile ilişkili çeşitli proteinlerin farklı punkta paternlerini bozar¹⁰. Bu nedenle, bu otofaji belirteçlerinin paternlerini analiz etmek, otofaji defektlerinin oluşumunu ve kusurlu otofaji basamağını ayırt etmeye yardımcı olacaktır. Örneğin, ubikitin benzeri protein Atg8, en yaygın kullanılan otofaji belirteci^11'dir. Drosophila melanogaster'de, yeşil floresan protein (GFP) etiketli Atg8a içeren transgenik suşlar başarıyla geliştirilmiştir¹². GFP-Atg8a, beslenen hücrelerdeki sitosol ve çekirdeklerde yayılır. Açlıktan ölmek üzere, GFP-Atg8a fosfatidiletanolamin (PE) tarafından işlenir ve modifiye edilir ve izolasyon membranlarını ve tamamen gelişmiş otofagozomları^13,14 etiketleyen punkta oluşturur. Doğrudan floresan mikroskopi ile otofaji indüksiyonu, GFP-Atg8 punkta oluşumu^15'te bir artış olarak kolayca gözlemlenebilir. Atg8a puncta, otofaji başlatma defekti varlığında açlığa yanıt olarak oluşmaz. GFP-Atg8a, otolizozomlardaki düşük pH ile söndürülüp sindirilebildiğinden, otofaji geç evrelerde^16'da bloke edilirse, GFP-Atg8a puncta sayıları artabilir.

Otofaji beslenme mevcudiyetine karşı oldukça hassas olduğu için¹⁷, kültür koşullarındaki küçük farklılıklar genellikle fenotiplerde farklılıklara yol açar. Bu nedenle, aynı dokudaki vahşi tip kontrol hücrelerine karşı mutant hücreleri analiz eden bir yöntem olan klonal analiz, otofaji defektlerinin diseksiyonunda büyük bir avantaja sahiptir¹⁸. Homolog kromozomlar arasındaki flippas / flippase tanıma hedefi (FLP / FRT) aracılı bölgeye özgü rekombinasyondan yararlanarak, mozaik dokuları taşıyan sinekler kolayca^19,20 yapılır. Mutant hücreleri çevreleyen vahşi tip hücreler, bireysel farklılıkları önlemek için mükemmel bir iç kontrol oluşturur²¹.

Bu çalışma, amino asit açlığı ile otofajinin nasıl indükleneceğini ve GFP-Atg8a eksprese eden mozaik yağ vücut dokularının nasıl üretileceğini açıklamaktadır. Bu protokoller, mutant klonlar arasındaki otofajideki farklılıkları analiz etmek için kullanılabilir.

1. Drosophila geçişi ve yumurtlama

1. Çiftleşme için 3 erkek (genotip hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) ve 15 dişi (genotip y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP ) yetişkin sinekleri (bakınız Malzeme Tablosu) çiftleşme için bir kültür şişesine (25 ° C'de standart mısır unu / pekmez / agar Drosophila ortamı ile) koyun.
   NOT: Daha sonraki deneyler için yeterli larva sağlamak için aynı haçtan oluşan çoklu kültür şişeleri kurulmalıdır. Genotip hsFLP ubiRFP FRT19A ile erkek sinek suşu; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a, sentromerin (FRT19A) yakınındaki X kromozomunda bir FRT bölgesi taşır. Ayrıca 37 ° C'de ısı şoku üzerine FLP'yi ifade eder. Her yerde bulunan RFP ekspresyonuna sahip bir transgen, X kromozomuna yerleştirilir. GFP-Atg8a, larva yağ gövdesinde cgGal4 kontrolü altında eksprese edilir²². Genotip y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP ile dişi sinek suşu, X kromozomu üzerinde ölümcül bir mutasyon (Mu) ve FRT19A taşır. Ayrıntılı geçiş şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
2. Yumurtlama için, sinekleri yeni bir kültür şişesine aktarın. Giriş sonrası 48 saatte, sinekler sersemletilene kadar "çiftleşme" şişesine dokunun ve şişenin tabanındaki ortama bırakın.
   1. "Çiftleşme" şişesinin fişini çekin ve ağzını taze medya (taze kültür şişesi) ile fişi çekilmiş ters çevrilmiş bir şişe ile kapatın. Ardından, şişeleri çevirip dokunarak sinekleri taze kültür şişesine aktarın.
   2. Taze kültür şişesini (aktarılan sineklerle birlikte) takın ve eski kültür şişesini atın. Bu taze kültür şişesini, taze ortama yumurtlamak için 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
      NOT: Sinek transfer işleminden önce taze kültür şişelerinin 15 dakika boyunca 25 ° C'ye ısıtılması, sineklerin yeni ortama hızlı bir şekilde adapte olmalarına ve yumurtlamayı hızlandırmalarına yardımcı olacaktır.
3. 6 saatlik yumurtlamadan sonra sinekleri çıkarın. Deneylerin tekrarlanması gerekiyorsa, bu sinekleri başka bir kültür şişesine aktarın (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Aksi takdirde, sinekleri% 75 etanol içeren bir şişeye atarak atın).
   1. FLP ekspresyonunu indüklemek için şişeyi embriyolarla 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, onları 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve embriyoların gelişmeye devam etmesine izin verin.
      NOT: Mutant klonların başarılı oluşumu daha sonra görüntüleme yoluyla doğrulanabilir. RFP sinyallerinin yokluğu mutant klonları işaretler.

2. Amino asit açlığı otofajiyi indükler

1. Bir laboratuvar spatulası kullanarak, gelişmekte olan larvaları içeren ortamı, yumurtlamadan 75 saat sonra bir Petri kabına alın. Yemeğe 3 mL 1x PBS ekleyin ve uzun forseps kullanarak kültür ortamını ve larvaları yavaşça ayırın. 10 ila 15 erken üçüncü instar larvasını seçin.
   NOT: Erken üçüncü instar larvalarının dikkatlice seçilmesi gerekir. Larvaların gelişim aşaması bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. Kısıtlı yumurtlama süresi nedeniyle, kültür şişesindeki larvaların çoğunun 75 saatlik inkübasyonla erken üçüncü instar aşamasında olması beklenir. Bununla birlikte, farklı kültür ortamı tarifleri larvaların gelişimsel zamanlamasında değişikliklere yol açabilir. Erken üçüncü instar larvalarını ayırt etme kriterleri vücut uzunluğu, ön ve arka spiracles varlığı ve ağız aparatının mandibuler kancalarıdır²³.
2. 9 delikli cam çöküntü spot plakasının kuyucuklarını 1x PBS ile doldurun ( bkz. Ayrılmış üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak kuyucuklara yerleştirin ve tüm ortam kalıntılarını gidermek için larvaları iyice yıkayın.
3. Boş bir şişede 5 mL% 20 sakkaroz (1x PBS'de) çözeltisi alın ve temiz üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak bu çözeltiye yerleştirin. Bu şişeyi, diseksiyon için hasat etmeden önce 6 saat boyunca 25 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
   NOT: % 20 sakkaroz (1x PBS'de) çözeltisi, amino asit eksikliği olan açlık ortamı olarak işlev görür.

3. Üçüncü instar larva diseksiyonu ve örnek doku işleme

1. İki çift # 5 forseps ( Malzeme Tablosuna bakınız) her iki tarafta da bir bileme taşı ile eşit şekilde keskinleştirin.
2. 9 delikli cam çöküntü spot plakasının her bir kuyucuğuna 400 μL 1x PBS ekleyin ve larvaları uzun forsepslerle kuyucuklara aktarın. Bir larvayı dorsal tarafı (trakealı taraf) yukarı bakacak şekilde bir kuyuya yerleştirin.
   1. Larva gövdesinin ortasındaki iki # 5 forseps ile larva kütikülünü tutun ve tırnak etlerini yavaşça yırtın. Maruz kalan yağ gövdeleri, diğer larva iç dokuları ile birlikte, larvaların karkasına hala bağlanacaktır. İç organları mümkün olduğunca açığa çıkaracak kadar çekin. Tüm larvalar için bu adımı tekrarlayın.
      NOT: Her larva vücut gövdesi boyunca iki büyük yağ gövdesine sahiptir. Yağlı vücut dokusu, diseksiyon mikroskobu²⁴ altında kolayca ayırt edilebilen beyaz, opak ve düz bir tek katmanlıdır.
3. Larva karkası, 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri sallamadan 25 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   DİKKAT: %4 PFA toksiktir. Koruma için eldiven ve maske takın.
   NOT: 1x PBS arabelleğinde %4 PFA hazırlanması önerilir. PFA tozu anında 1x PBS'de çözünmez. Bu nedenle, karışım gece boyunca bir inkübatörde 65 ° C'de inkübe edilmeli veya 25 ° C'de 45 dakika aralıklı olarak çalkalanmalıdır.
4. Karkasın %4 PFA ile 30 dakikalık inkübasyonundan sonra, PFA çözeltisini pipetleyin, tüpe 500 μL 1x PBS ekleyin ve 1x PBS çözeltisini atmadan önce tüpü düz bir rotatörde 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayın (3x'i tekrarlayın).
5. Uzun forseps kullanarak, sabit ve yıkanmış larva karkasını, 1x PBS ile doldurulmuş 9 çöküntülü nokta plakasındaki bir kuyuya aktarın. # 5 forseps kullanarak, tüm yağ olmayan vücut dokularını çıkarın.
6. Yağ gövdesinin parçalarını, montaj ortamı olarak% 80 gliserol kullanarak bir mikroskop slaydına monte etmek için # 5 forseps kullanın ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin.
   NOT: GFP sinyalini korumak için monte etmeden önce, %80 gliserolün pH'ını kontrol edin (pH kağıtları kullanarak, pH = 7 en uygunudur). % 80 gliserol içinde DAPI ile montaj ortamı (bakınız Malzeme Tablosu), yağ vücut hücrelerinin çekirdeklerinin görüntülenmesinde yardımcı olacaktır. Bu slaytlar karanlıkta 4 °C'de saklandığında 1 hafta boyunca stabildir.

Beslenen koşullar altında, GFP etiketli ubikitin benzeri protein, GFP-Atg8a, hücrelerin içine yayılır. Açlıktan öldüğünde, yeşil punkta oluşturur ve otofagozomları etiketler. Otofagozomlar lizozomlarla kaynaştığında, GFP asidik otolizozomlarda söndürülür ve yeşil punkta kaybolur. Otofaji indüklenmezse veya otofagozom olgunlaşması hızlanırsa, GFP punkta sayısının düşük olması beklenir. Bununla birlikte, otofagozomlar ve lizozomlar arasındaki füzyon bloke edilirse veya otolizozomun pH'ı bazik hale gelirse, GFP punktasının sayısının ve / veya boyutunun yüksek olması beklenir.

Burada sunulan protokolde, FLP / FRT sistemi mitotik rekombinasyonu indükler ve hem vahşi tip hem de mutant hücrelere sahip dokular üretir. Vahşi tip hücreler RFP'yi eksprese ederken, mutant hücreler RFP ekspresyonundan yoksundur. Tüm yağ vücut hücrelerinde RFP'nin ekspresyonu, FLP / FRT aracılı mitotik rekombinasyonun başarılı bir şekilde indüklenmediğini veya mutasyonun hücre öldürücü olduğunu gösterir. İkinci durumda (yani, mutasyon hücre öldürücü ise), larva yağ gövdesinin, çevreleyen hücrelerden daha yüksek düzeyde RFP sinyallerine sahip birkaç hücreye sahip olması beklenir.

Şekil 2'de, GFP-Atg8a (yeşil), vahşi tip hücrelerde (kırmızı) punkta oluşturdu ve otofajinin başarılı bir şekilde indüklendiğini ima etti. Mutant klonlarda (RFP negatif), GFP-Atg8a puncta'nın paterni, çevredeki vahşi tip hücrelerdekinden farklıydı ve otofaji kusurlarını düşündürüyordu. Mu1 mutant klonlarında çok az GFP-ATG8a punkta tespit edildi (Şekil 2B), otofajinin başlatma aşamalarında bloke edildiğini veya otolizozom olgunlaşmasını hızlandırdığını gösteriyor. GFP-Atg8a punktasının sayısı ve büyüklüğü Mu2 mutant klonlarında (Şekil 2C) büyük ölçüde artmıştır, bu da otofagozom-lizozom füzyonu veya otolizozom asitleştirme kusurlarını düşündürmektedir. Bu olasılıkları ayırt etmek için daha fazla deney yapılması gerekmektedir. Ayrıca, gözlenen farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için punktanın boyutlarının ve sayısının ölçülmesi gerekir.

Şekil 1: Mutant klonlar taşıyan mozaik larva yağ gövdesinde otofaji belirteci GFP-Atg8a'nın izlenmesi için deneysel prosedürlerin şematik gösterimi. Larva yağ vücut dokularında GFP-Atg8a'yı eksprese eden ve mutant klonları taşıyan sinekler üretmek için geçiş şeması gösterilmiştir (X-kromozomunda ölümcül nokta mutasyonu [Mu] olan bir suş örnek olarak hizmet eder). FLP ekspresyonunu aktive etmek için 1 saat boyunca 37 ° C'de ısı şokundan sonra, GFP-Atg8a ekspresyonuna sahip homozigot mutant hücreler y' w * Mu FRT19A / hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / + larva yağ gövdesinde üretilebilir. Otofaji, larvaların 6 saat boyunca% 20 sakkaroz çözeltisi içinde inkübe edilmesiyle yağ gövdesinde indüklenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mu1 ve Mu2 klonlarındaki GFP-Atg8a puncta paternleri kontrol klonlarındakilerden farklıydı. Mu1 ve Mu2, X kromozomu üzerinde iki bağımsız ölümcül mutanttır. İzojenize y' w*, FRT19A sinekleri bir kontrol görevi görür. GFP-Atg8a (yeşil) desenleri kontrol, Mu1 veya Mu2 mozaik larva yağ gövdelerinde analiz edildi. Mutant klonlar (veya kontrol klonları) RFP (kırmızı) ile negatif olarak işaretlendi. (A) Kontrol klonlarında (RFP negatif), GFP-Atg8a puncta paternleri, çevredeki RFP pozitif hücrelerdekilere benzerdi. (B) Mu1 mutant klonlarında (RFP negatif), GFP-Atg8a punktası büyük ölçüde azaldı. (C) Mu2 mutant klonlarında (RFP negatif), GFP-Atg8a puncta'nın sayısı ve boyutu artmıştır. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.