İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM’lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM’lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.
İnsan kaynaklı kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), klinik öncesi kardiyotoksisite testi için hayvanlara ve hayvan hücrelerine olan bağımlılığı değiştirmek ve azaltmak için kullanılır. İki boyutlu tek katmanlı formatlarda, hiPSC-CM’ler, optimal bir hücre dışı matris (ECM) üzerinde kültürlendiğinde yetişkin insan kalp kası hücrelerinin yapısını ve işlevini özetler. İnsan perinatal kök hücre kaynaklı ECM (olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matriks-MECM), kaplamadan sonraki 7 gün içinde hiPSC-CM yapısını, işlevini ve metabolik durumunu olgunlaştırır.
Olgun hiPSC-CM monokatmanları da klinik olarak ilgili ilaçlara beklendiği gibi yanıt verir ve aritmilere ve kardiyotoksisiteye neden olma riski vardır. HiPSC-CM monokatmanlarının olgunlaşması, şimdiye kadar düzenleyici bilim ve güvenlik taraması için bu değerli hücrelerin yaygın olarak benimsenmesinin önünde bir engeldi. Bu makalede, hiPSC-CM elektrofizyolojik ve kontraktil fonksiyonun kaplanması, olgunlaşması ve yüksek verimli, fonksiyonel fenotiplemesi için doğrulanmış yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler, ticari olarak temin edilebilen saflaştırılmış kardiyomiyositlerin yanı sıra, yüksek verimli, odaya özgü farklılaşma protokolleri kullanılarak şirket içinde üretilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler için de geçerlidir.
Yüksek verimli elektrofizyolojik fonksiyon, voltaja duyarlı boyalar (VSD’ler; emisyon: 488 nm), kalsiyuma duyarlı floroforlar (CSF’ler) veya genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri (GCaMP6) kullanılarak ölçülür. Her fonksiyonel parametrenin optik kayıtları için yüksek verimli bir optik haritalama cihazı kullanılır ve elektrofizyolojik veri analizi için özel özel bir yazılım kullanılır. MECM protokolleri, pozitif inotrop (izoprenalin) ve insan Ether-a-go-go-ilişkili gen (hERG) kanalına özgü blokerler kullanılarak ilaç taraması için uygulanır. Bu kaynaklar, diğer araştırmacıların yüksek verimli, klinik öncesi kardiyotoksisite taraması, kardiyak ilaç etkinlik testi ve kardiyovasküler araştırmalar için olgun hiPSC-CM’leri başarıyla kullanmalarını sağlayacaktır.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler) uluslararası ölçekte doğrulanmıştır ve in vitro kardiyotoksisite taraması için mevcuttur1. Son derece saf hiPSC-CM’ler neredeyse sınırsız sayıda üretilebilir, kriyoprezerve edilebilir ve çözülebilir. Yeniden kaplama üzerine, aynı zamanda yeniden canlanırlar ve insan kalbini anımsatan bir ritimle büzülmeye başlarlar 2,3. Dikkat çekici bir şekilde, bireysel hiPSC-CM’ler birbirleriyle çiftleşir ve tek bir doku olarak atan fonksiyonel sinsiti oluşturur. Günümüzde, hiPSC’ler rutin olarak hasta kan örneklerinden türetilmektedir, bu nedenle in vitro hiPSC-CM kardiyotoksisite tarama testleri 4,5 kullanılarak herhangi bir kişi temsil edilebilir. Bu, çeşitli popülasyonlardan önemli temsillerle “Bir Tabakta Klinik Çalışmalar” gerçekleştirme fırsatı yaratır6.
Mevcut hayvan ve hayvan hücresi kardiyotoksisitesi tarama yaklaşımlarına göre kritik bir avantaj, hiPSC-CM’lerin tüm insan genomunu kullanması ve insan kalbine genetik benzerliklere sahip bir in vitro sistem sunmasıdır. Bu özellikle farmakogenomik ve kişiselleştirilmiş tıp için caziptir – ilaç ve diğer tedavi geliştirme için hiPSC-CM’lerin kullanımının daha doğru, kesin ve güvenli ilaç reçeteleri sağlayacağı tahmin edilmektedir. Gerçekten de, iki boyutlu (2D) hiPSC-CM tek katmanlı testlerin, aritmilere neden olduğu bilinen bir klinik olarak kullanılan ilaç paneli kullanılarak ilaç kardiyotoksisitesinin öngörücü olduğu kanıtlanmıştır 1,7,8,9. HiPSC-CM’lerin geniş potansiyeline ve ilaç geliştirmeyi kolaylaştırma ve daha ucuz hale getirme vaadine rağmen, bu yeni tahlilleri kullanma konusunda isteksizlik olmuştur10,11,12.
Şimdiye kadar, hiPSC-CM tarama testlerinin yaygın olarak benimsenmesi ve kabul edilmesinin önemli bir sınırlaması, olgunlaşmamış, fetal benzeri görünümlerinin yanı sıra işlevleridir. HiPSC-CM olgunlaşmasının kritik konusu ad nauseum13,14,15,16 bilimsel literatüründe gözden geçirilmiş ve tartışılmıştır. Benzer şekilde, 2D monokatmanlarda hücre dışı matriks (ECM) manipülasyonları ve 3D mühendislik kalp dokularının (EHT’ler) geliştirilmesi de dahil olmak üzere hiPSC-CM olgunlaşmasını teşvik etmek için birçok yaklaşım kullanılmıştır17,18. Şu anda, 3D EHT’lerin kullanımının 2D tek katmanlı yaklaşımlara göre üstün olgunlaşma sağlayacağına dair yaygın bir inanç var. Bununla birlikte, 2D monolayer’lar, 3D EHT’lere kıyasla daha yüksek bir hücre kullanımı verimliliği ve kaplamada daha fazla başarı sağlar; 3D EHT’ler daha fazla sayıda hücre kullanır ve genellikle sonuçları karıştırabilecek diğer hücre tiplerinin dahil edilmesini gerektirir. Bu nedenle, bu makalede, elektriksel ve mekanik olarak bağlanmış hücrelerin 2D tek katmanları olarak kültürlenmiş hiPSC-CM’leri olgunlaştırmak için basit bir yöntem kullanmaya odaklanılmıştır.
Gelişmiş hiPSC-CM olgunlaşması, bir ECM kullanılarak 2D tek katmanlarda elde edilebilir. HiPSC-CM’lerin 2D monokatmanları, bir Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu hücresi (fare ECM) tarafından salgılanan bazal membran matrisi ile kaplanmış yumuşak, esnek bir polidimetilsiloksan örtü kayması kullanılarak olgunlaştırılabilir. 2016 yılında raporlar, bu yumuşak ECM koşulunda kültürlenen hiPSC-CM’lerin işlevsel olarak olgunlaştığını ve yetişkin kalp değerlerine (~ 50 cm / s) yakın aksiyon potansiyeli iletim hızları gösterdiğini göstermiştir18. Ayrıca, bu olgun hiPSC-CM’ler, hiperpolarize dinlenme zarı potansiyeli ve Kir2.1’in ekspresyonu da dahil olmak üzere yetişkin kalbini anımsatan birçok elektrofizyolojik özellik göstermiştir. Daha yakın zamanlarda, raporlar, 2D hiPSC-CM’lerin yapısal olgunlaşmasını destekleyen insan perinatal kök hücre kaynaklı bir ECM kaplaması tanımladı19. Burada, yüksek verimli elektrofizyolojik ekranlarda kullanılmak üzere yapısal olarak olgun 2D hiPSC-CM tek katmanlara kullanımı kolay yöntemler sunulmaktadır. Ayrıca, voltaja duyarlı boyalar (VSD’ler) ve kalsiyuma duyarlı problar ve proteinler kullanarak 2D hiPSC-CM tek katmanlı elektrofizyolojik fonksiyonun otomatik olarak elde edilmesi ve analizi için optik bir haritalama cihazının doğrulanmasını sağlıyoruz.
HiPSC-CM’ler kullanılarak in vitro kardiyotoksisite taramasına birkaç farklı yaklaşım vardır. HiPSC-CM’lerin kullanımı ile ilgili yakın tarihli bir “En İyi Uygulamalar” makalesi, çeşitli in vitro tahlilleri, birincil okumalarını ve daha da önemlisi, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunu ölçmek için her bir tahlilin granülerliğini sunmuştur20. Membran delici elektrotların kullanılmasına ek olarak, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunun en d…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH hibeleri HL148068-04 ve R44ES027703-02 (TJH) tarafından desteklenmiştir.
0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
HBSS | Gibco | 14025-092 | |
iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | ||
iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
IWP4 | Tocris | 5214 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |