Burada, yüksek verimli, çok boyutlu bir formatta kültürlenmiş, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden kardiyak sferoidlerin (CSs) üretilmesi ve kriyoprezervasyonu için bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu üç boyutlu model, hastalık modellemesi, yüksek verimli taramalar için sağlam bir platform olarak işlev görür ve kriyoprezervasyondan sonra işlevselliğini korur.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), insan kalp hastalığı modellemesi ve terapötikleri için büyük önem taşımaktadır. Kısa bir süre önce, hiPSC-CM’lerin iki boyutta (2D) büyük ölçüde genişletilmesi için uygun maliyetli bir strateji yayınladık. İki ana sınırlama, hücre olgunlaşmamışlığı ve yüksek verimli tarama (HTS) platformlarında üç boyutlu (3D) düzenleme ve ölçeklenebilirlik eksikliğidir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, genleşmiş kardiyomiyositler, 3D kardiyak hücre kültürü ve doku mühendisliği tekniklerinin oluşturulması için ideal bir hücre kaynağı oluşturur. İkincisi, kardiyovasküler alanda büyük bir potansiyele sahiptir ve daha gelişmiş ve fizyolojik olarak ilgili HTS sağlar. Burada, 96 kuyucuklu bir formatta kardiyak sferoidlerin (CSs) üretimi, bakımı ve optik analizi için kolay ölçeklenebilirliğe sahip HTS uyumlu bir iş akışını açıklıyoruz. Bu küçük CS’ler, mevcut in vitro hastalık modellerinde ve / veya 3D doku mühendisliği platformları için üretimde mevcut boşluğu doldurmak için gereklidir. CSs oldukça yapılandırılmış bir morfoloji, boyut ve hücresel kompozisyon sunar. Ayrıca, CSs olarak kültürlenen hiPSC-CM’ler, artan olgunlaşma ve spontan kalsiyum kullanımı ve kontraktil aktivite gibi insan kalbinin çeşitli fonksiyonel özelliklerini gösterir. CSs’nin oluşturulmasından fonksiyonel analize kadar tüm iş akışının otomatikleştirilmesiyle, yüksek verimli (HT) görüntüleme ve kalsiyum işleme analizinin gösterdiği gibi parti içi ve partiler arası tekrarlanabilirliği artırıyoruz. Tanımlanan protokol, kalp hastalıklarının modellenmesine ve tam otomatik bir HTS iş akışında karmaşık bir 3D hücre ortamında tek hücre düzeyinde ilaç / terapötik etkilerin değerlendirilmesine olanak tanır. Ek olarak, çalışma, tüm sferoidlerin uzun süreli korunması ve biyobankacılığı için basit bir prosedürü tanımlamakta ve böylece araştırmacılara yeni nesil fonksiyonel doku depolaması oluşturma fırsatı sunmaktadır. HTS, uzun süreli depolama ile birleştiğinde, ilaç keşfi ve testi, rejeneratif tıp ve kişiselleştirilmiş tedavilerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere çok çeşitli alanlarda translasyonel araştırmalara önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC’ler) keşfi, insan gelişimini ve hastalığı hücresel düzeyde incelemek için benzeri görülmemiş fırsatlar sundu. Son on yılda, gelişimsel dersler kullanılarak, hiPSC’lerin kardiyomiyositlere (CM’ler) etkili bir şekilde farklılaşmasını sağlamak için çeşitli protokoller oluşturulmuştur1,2,3,4. hiPSC kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), genetik olarak kalıtsal kardiyovasküler hastalıkların (CVD’ler) modellenmesi, yeni ilaçlar için kardiyak güvenliğin test edilmesi ve kardiyak rejeneratif stratejiler 5,6,7,8 için bir kaynak olarak hizmet edebilir. HiPSC’lerin yönlendirilmiş kardiyak farklılaşmasına rağmen, belirsiz CM sayıları kardiyak alanda bir zorluk olmaya devam etmektedir, çünkü olgunlaşmış hiPSC-CM’ler genellikle proliferatif değildir ve birincil insan hücreleri yüksek miktarlarda mevcut değildir.
Son zamanlarda, düşük hücre yoğunluğu kültürü ile eşzamanlı Wnt sinyal aktivasyonunun, hiPSC-CMs 9,10’un büyük bir proliferatif yanıtı (250 kata kadar) ile sonuçlandığını açıkladık. Kültür şişesi formatında seri geçiş yoluyla hiPSC-CM’lerin büyük ölçüde genişletilmesine yönelik bu uygun maliyetli strateji, çok sayıda fonksiyonel hiPSC-CM’nin standardizasyonunu ve kalite kontrolünü kolaylaştırır. Ek olarak, çeşitli bağışçılardan gelen büyük miktarlarda hiPSC-CM’lere olan talebe ayak uydurmak için, hiPSC-CM’lerin biyobankacılığı10 olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu standart kültür yemeklerinde tohumlanan kardiyomiyosit monokatmanları, kalpte bulunan karmaşık 3D yapıyı temsil etmemektedir. Dahası, hiPSC-CM’lerin olgunlaşmamışlığı bir engel olarak kalmıştır, bu nedenle in vivo kardiyovasküler ortamın biyolojik ve fizyolojik fenotipini taklit etmede yetersiz kalmıştır.
HiPSC-CM’lerin kendi kendine organizasyon 11,12, hücre dışı matris (ECM) yeniden şekillenmesi 13, gelişmiş olgunlaşma 14,15,16 ve senkronize kasılma 17,18,19 gibi daha yakın fizyolojik davranışlar gösterdiği yeni 3D in vitro modeller geliştirilmiştir. . İlaç keşfi, ilaç kardiyotoksisite testi, hastalık modellemesi, rejeneratif tedaviler ve hatta ilk klinik çalışmalar20,21,22,23,24 için 3D modeller kullanılmıştır. En çok kullanılan modellerden biri, doku benzeri bir düzenleme ve kardiyak kontraktiliteyi 13,17,25 sergileyen fibrin bazlı mühendislik kalp dokusudur (EHT). Daha önce, genişletilmiş hiPSC-CM’lerden üretilen EHT’lerin, genişlememiş hiPSC-CM’lerden elde edilenlerle karşılaştırılabilir kontraktilite gösterdiğini ve genişleme9’dan sonra ödün vermeyen hücresel işlevsellik gösterdiğini gösterdik. Bununla birlikte, hiPSC-CM’lerden EHT’lerin üretimi iyi kurulmuş olsa da, bir HT değerlendirme platformunun kurulmasıyla ilgili daha fazla gelişme beklenmektedir. Burada, 96 kuyucuklu formatta çok sayıda kendiliğinden toplanan kardiyak sferoidin (CSs) hızlı bir şekilde üretilmesi, yüksek verimli tarama (HTS) amaçları için 3D koşullarda bir iyileşme sağlar.
Genel olarak, CSs’nin 3D hücre kültürü olarak avantajı, yüksek tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliğidir. Özellikle, robotik numune işleme ile birleştirilen CSs, CS kültürünü, ilaç tedavisini ve yüksek içerikli analizi standartlaştırabilir ve otomatikleştirebilir20. Burada, optik kalsiyum toplama ve analiz sistemi kullanarak Ca2+ geçici ölçümler yaparak verimli bir şekilde kriyokorunabilen ve kardiyak fonksiyon için taranabilen yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli CS’ler üretmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz. Bu model, yüz ila binlerce sferoid17,18 üzerinde yüksek verimli ekranlar gerçekleştirmek için basit ama güçlü bir araç sağlar.
Kardiyak ilaç keşfi, okumaları doğru bir şekilde gerçekleştirmek için yetersiz verim ve fizyolojik sadakate sahip insan dışı hayvan ve hücresel modellere güvenilmesi nedeniyle engellenmektedir. HT enstrümantasyonu ve fizyolojik problarla birlikte hiPSC-CM biyolojisi, insan modellerini kalp hastalığı modellemesinin ve ilaç keşfinin en erken aşamalarına yeniden sokma potansiyeline sahiptir. Optimal bir kalp hastalığı modellemesi ve ilaç tarama platformu için yüksek kaliteli ve fonksiyonel CSs üreten bir 3D kalp dokusu üretim yöntemi geliştirdik. Ek olarak, endüstriyel EV üretimi için 3D biyoreaktör sistemlerinde küresel teknolojiyi birleştirmek, EV tabanlı tedavinin klinik çevirisine yönelik gerekli bir adımı sağlar. Burada açıklanan yöntem birkaç önemli faktöre dayanır ve mevcut protokollerin 9,10,28,29 bir çeşididir. Bu yöntemler şunları içerir: 1) 3D doku yapılarının oluşturulması, 2) taramadan önce optimal hücre sayısı ve zamanlaması, 3) cihazların duyarlılığını ve yüksek verim kapasitesini artırmak ve 4) herhangi bir fonksiyonel analizden önce sferoidleri dondurabilmek. Daha önce açıklanan protokollerin aksine, önerilen protokol günde 1.500 sferoid üretimini ve HTS için uygunluğu açıklamaktadır. Mevcut 96 kuyucuklu kalsiyum görüntüleme sistemlerini veya 24 kuyucuklu çoklanmış mühendislik kalp dokularını kullanarak 10 replikasyon için 6 x 0.5 log dozunun üzerinde yüz bileşiğin geleneksel analizi, yaklaşık 500 milyon ila 3 milyar hiPSC-CM31,32 gerektirir. Önerilen uygulama, kardiyak taramaları geleneksel sistemlere kıyasla daha az maliyetli ve zaman etkili hale getirmektedir, çünkü 96 kuyucuklu plakalar, tarif edilen yönteme kıyasla tohumlama yoğunluğunun sadece% 10’unu gerektirmektedir. Dahası, asılı-damla yöntemi gibi önceki protokollerle karşılaştırıldığında, ultra düşük bağlantı plakalarında kendiliğinden toplanarak sferoidlerin üretilmesi, tek mikro dokuların yüksek kaliteli otomatik görüntülenmesini sağlar33.
Bu küçük 3D model, in vivo kardiyovasküler ortamın biyolojik ve fizyolojik fenotipini taklit eder. Daha önce gösterildiği gibi, kalsiyum geçicileri, 2D tek katmanlı hücre kültürlerine kıyasla 3D kalp dokusu yapılarında çarpıcı bir şekilde artmaktadır34.
Daha sonra, tohumlama yoğunluğunun ve uygun kültürleme süresinin de başarılı bir CS taraması için kritik faktörler olduğunu bulduk. Sferoid başına 10K-20K hiPSC-CM’lerin yoğunlukları ve nesilden sonraki 2-3. haftalar arasındaki tarama optimal iken, çok küçük veya çok eski sferoidler bozulmuş kalsiyum kullanımı göstermektedir (Şekil 2 ve Şekil 3). Bu nedenle, tohumlama yoğunluklarını mümkün olduğunca tutarlı tutmak önemlidir, çünkü boyut fonksiyonel parametreleri etkiler. Ayrıca, bu optik yöntem bir bütün doku olarak canlı 3D kültürler için iyi sonuçlar sağlasa da, zaman alıcı histoloji yöntemlerine güvenmeden (alt) hücresel düzeyde daha büyük sferoidler içinde veri elde etmek zordur. Son zamanlarda, işaretleyicilerin tek hücreli nicelleştirilmesi fırsatı ile tüm 3D sferoidlerin elde edilmesini sağlayan “optik olarak temizleme” kullanan çeşitli yaklaşımlar yayınlanmıştır. Burada, CS hasadından görüntü analizine 3 günlük bir protokol uyarladık, bu da konfokal mikroskopi29 kullanılarak 3D görüntüleme için optimize edilmiştir (Şekil 1C ve Şekil 4D).
Son olarak, 3D kalp dokusu uygulamaları ve ticari uygulamalardaki artışla birlikte, çeşitli donörlerden uzun süreli depolama ve hastaya özgü biyobankacılığa olan talep artmaktadır. Kriyoprezervasyon, zaman içinde birden fazla partiden HTS plakaları üretmek için etkili bir stratejidir. HiPSC-CM’lerin donması daha önce tanımlanmıştır ve diğer kültürlenmiş hücre tiplerine kıyasla farklı değildir 10,35,36. Son zamanlarda, 2D hücreli plakaları dondurmak için yaklaşımlar tanımlanmıştır37. Burada, PSC kriyoprezervasyon kitinin diğer üçüne kıyasla en uygun durum olduğunu (veriler gösterilmemiştir) bulduk ve bu ortamı sferoidlerin verimli bir şekilde dondurulması için kullandık. Kriyoprezervasyondan sonra, canlılık yüksek kalır (Şekil 4B, C), ancak CSs’nin elektrofizyolojik özellikleri etkilenir ve çözülmeden sonra bir kuluçka süresi gereklidir. Gerçekten de, çözülmeden 1 hafta sonra, CSs kendiliğinden atma aktivitesi ve kalsiyum kullanımı gösterdi. Bununla birlikte, taze ve geri kazanılmış hiPSC-CM’lerin her zaman aynı moleküler ve fizyolojik özellikleri göstermediği açıklanmıştır38. Bu sınırlama, ilaca bağlı kardiyak okumaları değerlendirmek için kriyokorunmuş hiPSC-CM’ler kullanıldığında dikkate alınmalıdır. Ayrıca, sferoid başına düşen hücre sayısını ve kalsiyum geçici görüntülemenin optimal zamanlamasını etkili bir şekilde modüle etmemize rağmen, hiPSC türevi kardiyomiyosit hücrelerini endotel hücreleri, fibroblastlar, hücre hücre kavşakları ve kitosan, kollajen IV, fibronektin, matrijel veya laminin gibi hücre dışı matrislerle karıştırarak kardiyak sferoidler geliştirilebilir. in vivo kardiyak ortamı taklit ederek39, 40. Genel olarak, hastalık modelleme ve HT ilaç taraması gibi aşağı akış uygulamaları için uygun olan CS’leri verimli bir şekilde oluşturmak için adım adım bir protokol öneriyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Cyteseer yazılım paketi ve otomatik 3D kalsiyum analizinin optimizasyonu için VALA bilimlerine teşekkür ederiz. PLN vakfının (RM) hibe desteğini kabul etmek istiyoruz. P.A.D. ve F.S. CUREPLaN Leducq tarafından desteklenmektedir. J.P.G.S., Avrupa Araştırma Konseyi’nin (ERC) H2020-EVICARE (#725229) tarafından desteklenmektedir. J.W.B., UMC Utrecht Klinik Bursu, Hollanda Kalp Enstitüsü Bursu ve CVON-Dosis genç yetenek bursu tarafından desteklenmektedir; Hollanda Kalp Vakfı (CVON-Dosis 2014-40). N.C., Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (RegmedXB #024.003.013) ve Marie Skłodowska-Curie Eylemleri (Hibe anlaşması RESCUE #801540) tarafından “Malzeme Güdümlü Rejenerasyon” Yerçekimi Programı tarafından desteklenmektedir. V.S.-P. İttifak Fonu (UMCU, UU, TU/e) tarafından desteklenmektedir. A.V.M., AB tarafından finanse edilen BRAVE projesi tarafından desteklenmektedir (H2020, ID:874827)
24 wells suspenion plate | Corning | 3738 | |
96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning | CLS3474-24EA | |
Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | Dilution: 1:200 |
Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932) | Abcam | ab45932 | Dilution: 1:200 |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Roche | 10735086001 | |
Cal-520, AM | Abcam | ab171868 | |
Confocal microscope | Leica | DMi8 | |
Confocal microscope software | Leica | Las X | |
Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Creatine monohydrate | Sigma-Aldrich | C3630 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | D3571 | Concentration: 1 µg/mL |
DMEM no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11966025 | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
Fructose | Sigma-Aldrich | 76050771.05 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glycerol | Boom | 76050771.05 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | Dilution: 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | Dilution: 1:500 |
Horizontal shaker | IKA | 4003000 | |
Human induced pluripotent stem cell lines | (Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank) | CVI-273 (control 1) | |
Human induced pluripotent stem cell lines | Germany | 141 (control 2) 144 (control 3) | |
Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem | 265.2.5L-PL | 10 M stock solution, corrosive |
Isotype control, FITC mouse IgM κ isotype | BD | 556652 | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828 | Protect from light |
L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
Myocyte calcium and contractility system | Leica | Thunder, DMi8 | |
Non essential amino acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140 | |
Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0–7.6 | Santa Cruz | SC281692 | Hazardous |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
PES Membrane Vacuum Filter system | Corning | 431097 | |
PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | Dilution: 1:1000 |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | A2644601 | |
RevitaCell | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875 | |
Silicone Elastomer Kit | SYLGARD | 184 | |
Sodium dodecyl sulfate solution (10%) | Sigma-Aldrich | 71736 | |
Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | 71718 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Tris Fisher | Scientific | 11486631 | |
Triton X-100 | Merck | X100-1L | Hazardous |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Urea | Sigma-Aldrich | 51456 | |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | |
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Tocris | 1254 | Protect from light |