Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücre Hücre İskeletinin Model Sistemi Olarak (Poro-)Elastik Kasılma Aktomyosin Ağlarının Mekaniği

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64377

⸱

10 Mart 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Ben Gurion University of the Negev, 2Department of Chemical Engineering, Ilse Kats Institute for Nanoscale Science and Technology, Ben Gurion University of the Negev

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, kontrollü koşullar altında aktomiyosin jellerinin poroelastisitesini incelemek için in vitro rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır. Aktomiyosin jelinin ve gömülü çözücünün dinamikleri, ağ poroelastisitesinin gösterildiği şekilde ölçülür. Ayrıca deneysel zorlukları, ortak tuzakları ve hücre hücre iskeleti mekaniği ile olan ilgisini tartışıyoruz.

Özet

Hücreler şekillerini aktif olarak değiştirebilir ve iç yapılarını aktif olarak yeniden düzenleme yeteneklerine bağlı bir özellik olan hareketli hale gelebilir. Bu özellik, hücre hücre iskeletinin mekanik ve dinamik özelliklerine, özellikle de polar aktin filamentlerinin, miyozin motorlarının ve içsel kasılma özellikleri sergileyen aksesuar proteinlerin aktif bir jeli olan aktomiyozin hücre iskeletine atfedilir. Genellikle kabul edilen görüş, hücre iskeletinin viskoelastik bir malzeme gibi davranmasıdır. Bununla birlikte, bu model, hücre iskeletini poroelastik bir aktif materyal olarak tanımlayan bir resimle daha tutarlı olan deneysel sonuçları her zaman açıklayamaz - sitosol ile gömülü elastik bir ağ. Miyozin motorları tarafından üretilen kontraktilite gradyanları, sitosolün jel gözenekleri boyunca akışını yönlendirir, bu da sitoiskeletin ve sitosolün mekaniğinin sıkıca bağlandığı sonucuna varır. Poroelastisitenin ana özelliklerinden biri, jel elastik modülüne, gözenekliliğine ve sitosol (çözücü) viskozitesine bağlı etkili bir difüzyon sabiti ile karakterize edilen, ağdaki streslerin difüzif gevşemesidir. Hücrelerin yapılarını ve malzeme özelliklerini düzenlemenin birçok yolu olduğu için, sitoiskelet mekaniğinin ve sitosol akış dinamiklerinin nasıl birleştiğine dair mevcut anlayışımız tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, poroelastik aktomiyosin jellerinin materyal özelliklerini hücre hücre iskeleti için bir model sistem olarak karakterize etmek için in vitro bir rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmaktadır. Jel büzülmesi, nüfuz eden çözücünün akışının ortaya çıkmasına neden olan miyozin motor kontraktilitesi tarafından tahrik edilir. Makale, bu jellerin nasıl hazırlanacağını ve deneylerin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Ayrıca, solvent akışının ve jel büzülmesinin hem yerel hem de küresel ölçekte nasıl ölçüleceğini ve analiz edileceğini tartışıyoruz. Veri nicelleştirme için kullanılan çeşitli ölçekleme ilişkileri verilmiştir. Son olarak, deneysel zorluklar ve ortak tuzaklar, hücre hücre iskeleti mekaniği ile ilgileri de dahil olmak üzere tartışılmaktadır.

Giriş

Canlı hücreler benzersiz mekanik özelliklere sahiptir. Uygulanan kuvvetlere pasif olarak tepki verme yeteneğinin yanı sıra, dış uyaranlara yanıt olarak aktif olarak kuvvet üretme yeteneğine de sahiptirler1. Özellikle hücre hareketliliği sırasında çeşitli hücresel süreçler için gerekli olan bu özellikler, öncelikle hücre hücre iskeletinin, özellikle polar aktin filamentlerinin, miyozin moleküler motorlarının ve aksesuar proteinlerinin aktif bir jeli olan aktomiyozin sitoiskeletinin mekanik ve dinamik özelliklerine atfedilir. Bu aktomiyosin ağları, aktin filamentlerini çapraz bağlayan ve ATP hidrolizi2 tarafından beslenen ağda aktif olarak mekanik stresler üreten miyozin motor proteinleri tarafından tahrik edilen içsel öz-organizasyon ve büzülme özellikleri sergiler.

Hücre iskeletinin malzeme özelliklerini incelemek için çok sayıda deneysel ve teorik çalışma yapılmıştır3. Yaygın olarak kabul edilen görüş, hücre iskeletinin viskoelastik bir materyal gibi davrandığı yönündedir4. Bu, kısa zaman ölçeklerinde, hücre iskeletinin elastik bir malzeme gibi davrandığı ve uzun zaman ölçeklerinde, çapraz bağlama proteinleri ve miyozin motor dekolmanı (ve yeniden bağlanması) nedeniyle viskoz bir sıvı gibi davrandığı anlamına gelir. ağın dinamik olarak dönmesini sağlar. Bununla birlikte, birçok durumda, viskoelastik model, hücre iskeletini ve daha genel olarak, poroelastik aktif madde 5,6 olarak tanımlanan hücre sitoplazmasını tanımlayan bir resimle daha tutarlı olan deneysel sonuçları tanımlayamaz. Bu tür malzemeleri karakterize eden iki ana özellik vardır. (i) İlk ana özellik, hücre kanaması7, motilitesi8 ve hücre şekli salınımları9 gibi işlemlerin altında yatan miyozin motorları tarafından tahrik edilen kontraktilite gradyanları tarafından jel gözenekleri boyunca nüfuz eden sitosol ("çözücü") akışının oluşturulmasıdır. Bu tür sitozolik akışların ortaya çıkışı, hücre hareketliliğinde olduğu gibi lokal, blebbing için veya küresel olabilir. İkinci durumda, hücre arkasındaki kontraktil uygulanan gerilmeler, sitozolik sıvının akışını hücre önüne doğru yönlendirir ve bu da lamellipodia montajı8 için gerekli protein havuzunu doldurur. (ii) İkinci ana özellik, gerilmelerin gevşemesinin difüzif olması ve jel elastik modülüne, jel gözenekliliğine ve çözücü viskozitesine bağlı olan etkili bir difüzyon sabiti ile karakterize edilmesidir5. Poroelastik difüzyon sabiti, sistemin uygulanan bir gerilime ne kadar hızlı tepki verdiğini belirler. Daha yüksek difüzyon sabitleri, daha hızlı gerilim yeniden dağılımına karşılık gelir. Bu da, hücre içi sitozolik sıvının, miyozin motorları tarafından üretilen aktif kontraktil stresler gibi harici veya dahili olsun, uygulanan mekanik stresi takiben hücre içinde yeniden dağıtılmasının ne kadar süreceğini belirler. Bu nedenle, bu örnekler, sitoiskeletin ve sitosolün mekaniğinin sıkıca bağlandığını ve ayrı ayrı tedavi edilemeyeceğini göstermektedir3.

Hücreler mekanik özelliklerini çeşitli şekillerde düzenleyebildiklerinden, ağ mekaniği ve akışkan akış dinamikleri arasındaki etkileşim tam olarak anlaşılamamıştır. Güçlü bir alternatif yaklaşım, çeşitli mikroskobik bileşenlerin ve sistem parametrelerinin tam kontrolüne izin veren in vitro yeniden yapılandırılmış sistemlerin kullanılmasıdır ve bu da bu model sistemleri fiziksel analiz için en uygun hale getirir10,11. Bu yaklaşım, protein bileşiminin ve sistem geometrisinin aktin bazlı motilitesi 12,13,14,15,16,17,18, aktomiyosin ağlarının 2D modellemesi 19,20,21,22 üzerindeki etkisini incelemek için başarıyla kullanılmıştır ve bu makalenin odak noktası olan poroelastik aktomiyosin jellerinin ağ kontraktilitesi ve akışkan akış dinamikleri arasındaki etkileşim23.

Bu yazıda, kontrol edilebilir boyutlara ve malzeme özelliklerine sahip kontraktil elastik aktomiyosin ağlarının hazırlanması, Ideses ve ark.23'ün çalışmalarına dayanarak tartışılmıştır. Sözleşme jelinin ve boşaltılmış çözücünün dinamikleri analiz edilir ve ölçülür, bu sayede bu aktomiyosin jellerinin poroelastik bir aktif madde olarak tanımlanabileceği gösterilmiştir. Solvent viskozitesinin stres difüzyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi, bu ağların poroelastik doğasını daha da doğrulamaktadır. Veri nicelleştirme için kullanılan çeşitli ölçeklendirme ilişkileri sağlanır. Son olarak, deneysel zorluklar, ortak tuzaklar ve deneysel sonuçların hücre hücre iskeleti ile ilgisi de tartışılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Cam yüzey işleme ve pasivasyon:

NOT: Bu bölüm üç ana adımı içermektedir (bkz. Şekil 1): (i) temizleme ve hidrofilizasyon, (ii) silinizasyon ve (iii) yüzey pasivasyonu.

  1. Temizleme ve hidrofilizasyon
    1. Cam yüzey temizliği için Piranha solüsyonunu kullanın.
      NOT: Piranha çözeltisi% 30 H2 O2 ve% 70 H2 S04(Malzeme Tablosu) karışımıdır. Başlıca amacı, kapak kayması yüzeylerinden organik kontaminasyonları gidermek ve cam yüzeydeki OH gruplarını açığa çıkarmaktır. Bu şekilde, cam yüzey hidrofilik hale gelir.
    2. Ev yapımı bir politetrafloroetilen tutucuya (taban alanı: 5,5 cm x 5,5 cm) 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) cam kapak fişleri (Malzeme Tablosu) yerleştirin. Politetrafloroetilen tutucuyu 400 mL'lik bir beher içine aktarın (Malzeme Tablosu) ve 2 saat boyunca 300 mL Piranha çözeltisi ile inkübe edin. Bu adımı buz üzerinde ve kimyasal bir başlıkta yapın.
      NOT: Tutucu tabanına vidalanan politetrafloroetilen direk, 12 cm uzunluğundadır ve beherden (11 cm) daha uzundur, bu da tutucunun Piranha çözeltisine / içinden güvenli bir şekilde aktarılmasını/çekilmesini sağlar. Piranha çözeltisi hala oldukça reaktif ve çok sıcak olabileceğinden, reaksiyonu durdurmak zorunludur. Reaksiyonu durdurmanın en kolay yolu, Piranha çözeltisini (en azından) 50x seyreltme elde etmek için (musluk) suyuna dökmektir. Çözelti daha sonra güvenli bir şekilde atılabilir. Kullanılmış Piranha çözeltisini asla kapalı bir cam şişede tutmayın – bu bir şişe patlamasıyla sonuçlanabilir.
    3. Politetrafloroetilen tutucuyu, fazla Piranha'yı kapaklardan yıkamak için taze çift damıtılmış su (DDW) ile doldurulmuş temiz bir beher içine aktarın.
    4. Beheri bir sonikasyon banyosuna (Malzeme Tablosu) aktarın ve 80 ° C'de 10 dakika boyunca tam güçte 25 Hz'de sonikleştirin. Bu adımı yeni DDW ile iki kez daha tekrarlayın. Her seferinde yeni DDW kullanın.
  2. Silanizasyon
    1. Tutucuyu 300 mL saf metanol (Malzeme Tablosu) ile doldurulmuş temiz bir beher (400 mL) ve daha sonra bir sonikasyon banyosuna (Malzeme Tablosu) aktarın. 80 ° C'de 30 dakika boyunca tam güçte 25 Hz'de sonikasyon.
    2. Sonikasyondan sonra, tutucuyu 15 mL DDW, 3.1 mL asetik asit (Malzeme Tablosu), 340 mL metanol ve 7.6 mL silan ((3-Merkaptopropil) trimetoksisilan (Malzeme Tablosu) kullanılarak hazırlanan bir silan çözeltisine aktarın. Beheri parafilmle kapatın ve gece boyunca buzdolabında 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Silan çözeltisinin hazırlanması ve işlenmesi kimyasal bir davlumbazda yapılmalıdır. Silanizasyon adımından sonra, kullanılan silan çözeltisini (atık) kimyasal başlık içindeki özel bir cam şişeye koyun.
    3. Ertesi gün, tutucuyu 15 s boyunca 300 mL saf metanol ile doldurulmuş temiz bir beher içine aktarın. Daha sonra, fazla metanolü gidermek için politetrafloroetilen tutucunun tabanını kurutmadan önce tutucuyu temiz bir beher içine aktarın. Cam kapakları 120 ° C'de 5 dakika kurutmak için beheri fırına (Malzeme Tablosu) aktarın.
  3. İnert polimer ile yüzey pasivasyonu
    1. Cam kapakları inert bir polimerle inkübe ederek yüzey pasivasyonu elde edin (Malzeme Tablosu). Her deney için, iki kapak parçası alın ve bunları başlangıçta etanol (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) ile temizlenmiş bir parafilm tabakası ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin (Malzeme Tablosu).
    2. Her bir kapak kaymasını, 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (PBS) (Malzeme Tablosu) içinde 1 saat boyunca 1 saat boyunca 4 mg · mL − 1 5 kDa moleküler ağırlıklı metoksi polietilen glikol maleimid (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (Malzeme Tablosu) (Malzeme Tablosu) ile inkübe edin.
      NOT: Kapakların hidrofobik bir parafilm tabakası üzerine yerleştirilmesi, hidrofilik PEG polimer çözeltisini cam kapak kayması yüzeyine sınırlar. Kuluçka süresi, optimum pasivasyon elde etmek için kritik öneme sahiptir. 45 dakika ile 2 saat arasında değişen inkübasyon süreleri kullanın. Bu inkübasyon süresinin üstünde, cam örtü kayma yüzeyi bozulabilir, bu da protein yapışmasına ve şeffaflık kaybına neden olabilir.
    3. Kuluçka işleminin sonunda, her bir kapağı 5 mL DDW ile durulayın veN2 (gaz) akışı ile kurutun. Kapakları vakum altında kurutmayın. Pasivasyondan sonra kapakların ıslak tutulması gerektiğinden, pegile yüzeylere derhal 1 mL 10 mM Tris koyun. Kapak fişlerini 2 saat içinde kullanın.
      NOT: Cam yüzey kontaminasyonunu önlemek için çeşitli adımlar laminer akış odasında gerçekleştirilmelidir.

2. Protein saflaştırma

  1. Jel filtrasyon yöntemi24'ü kullanarak G-aktin'i tavşan iskelet kası aseton tozundan arındırın.
    1. Aktin saflaştırma 1 hafta sürer. Saflaştırılmış G-aktin'i G-tamponunda tutun (5 mM Tris pH 7.8,% 0.01 NaN3, 0.1 mM CaCl 2,0.2 mM ATP ve 1 mM DTT) ve buz üzerinde saklayın. Çözeltiyi 2 hafta içinde kullanın.
      NOT: Buzu birkaç günde bir değiştirin.
    2. Aktin'i maleimidle modifiye edilmiş floresan boya16 (Malzeme Tablosu) ile etiketleyin. GST-fascin'i Ono ve ark.25 yöntemine dayanarak saflaştırın. Her iki proteini de sıvıN2'de flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
  2. Miyozin II'yi tavşan iskelet kasından arındırmak için standart bir protokol kullanın26. Saflaştırılmış miyozin II (dimer) stok tamponu 10 mM Tris pH 7.4, 0.5 M KCl ve %35 w/v sakkaroz içerir. Miyozini sıvı N2'de flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Yüksek KCl konsantrasyonu, miyozin motorlarını dimerik bir formda tutarken, yüksek sakkaroz yüzdesi, donma sırasında motorların aktivitesinin engellenmemesini sağlar. Miyozin II stok çözeltileriyle çalışırken viskoz sıvı elleçlemesi için özel bir pipet kullanın (Malzeme Tablosu).
    1. Miyozin II dimerlerini, mühendislik sistein kalıntıları çiftlerinde floresan bir boya (Malzeme Tablosu) ile etiketleyin19,27. Bu amaçla bir tavuk gizzard RLC mutant A kullanın26. Etiketli miyozin II'yi sıvıN2'de flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu etiketleme prosedürü, etiketli miyozinin doğal miyozin II proteini olarak aktif olmasını sağlar.
  3. Stok protein çözeltilerinin emilimini ölçmek için bir UV-Vis spektrofotometresi (Malzeme Tablosu) kullanın ve aşağıdaki yok olma katsayılarını kullanarak Beer-Lambert yasası ile protein konsantrasyonlarını çıkarın: G-aktin (ε290 = 26.460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), miyozin II dimer (ε280 = 268.800 M−1·cm−1), ve RLC mutant A (ε280 = 3.960 M−1·cm−1)19.

3. Numune hazırlama

NOT: Aktin monomerlerini, makroskopik olarak kontraktil elastik aktomiyosin ağları üretmek için büyük miyozin II motorlarının agregalarının ve güçlü pasif çapraz bağlayıcı fasisinin varlığında polimerize edin 19,23. Çözeltiye floresan boncukların eklenmesi, jel büzülmesi sırasında çözücü akışının izlenmesini sağlar.

  1. Protein ("aktomiyosin") çözeltisi
    1. G-aktin hariç, proteinleri küçük alikotlarda -80 ° C'de tutun ve kullanmadan önce 37 ° C'de çözün. Aktomiyosin çözeltisinin toplam hacmi 40 μL'dir.
    2. 10 mM Tris pH 7.4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, bir ATP yenileyici sistem (0.5 mg·mL−1 kreatin kinaz ve 5 mM kreatin fosfat), 200 μM EGTA (şelatlarCa2+ iyonları), bir anti-ağartma çözeltisi (0.1 mg·mL−1 glikoz oksidaz, 0.018 mg·mL−1 katalaz ve 5 mg·mL−1 glikoz) karıştırarak çözeltiyi hazırlayın, 5 μM G-aktin, 280 nM GST-fasin ve 1.67 nM miyozin II. Etiketli G-aktin'in yüzdesi% 5'tir (molar yüzde).
      NOT: Jel büzülmesinin ileri aşamalarında floresan sinyalinin doygunluğunu önlemek için düşük oranda etiketli G-aktin kullanın.
  2. Miyozin II motor agregalarının hazırlanması
    1. Miyozin motorlarını protein çözeltisine agrega şeklinde ekleyin. Büyük miyozin agregaları (150 miyozin dimerleri/agregası) oluşturmak için, 25 mM KCl'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için miyozin stok çözeltisini 10 mM Tris pH 7.4 ile seyreltin.
    2. Seyreltilmiş miyozin çözeltisini oda sıcaklığında (RT) 10 dakika bekletin ve kullanana kadar buza aktarın. Motorlar 2 saate kadar tamamen aktiftir.
  3. Solvent akışının ölçülmesi
    1. Jel gözenekleri boyunca çözücü akışını izlemek için, floresan boncukları aktomiyosin çözeltisine ekleyin. Boncukları pasifleştirerek boncuklar ve aktomiyosin ağı arasındaki etkileşimi azaltın. Pratik olarak, RT'de 20 dakika boyunca 5 μM G-aktin ile 1 μL boncuk (Malzeme Tablosu) inkübe edin ve daha sonra santrifüjleme (Malzeme Tablosu) ile fazla G-aktin'i çıkarın (koşullar: 4 ° C'de 5 dakika boyunca 6.000 x g ).
    2. Kalan kaplanmamış yüzeyi (muhtemelen) bloke etmek için bu adımı 10 mg · mL − 1 sığır serum albümini (BSA) (Malzeme Tablosu) ile tekrarlayın. Boncukları deneylerde 1:10.000 vol/vol son seyreltmede kullanın.
      NOT: Boncukların çapını, boncuk/gözenek boyutu oranı her aşamada <1 olacak şekilde jel gözenek boyutuna uyarlamak önemlidir.
  4. Çözelti viskozitesinin etkisi
    1. Aktomiyosin çözeltisine gliserol (Malzeme Tablosu) ekleyerek çözeltinin viskozitesini kontrol edin. % 0 ila% 34 arasında değişen bir ağırlık yüzdesinde gliserol eklenmesi, çözelti viskozitesinde η ω ila 2.76 η ω arasında karşılık gelen bir artışa neden olur, burada η ω, 20 ° C'de suyun viskozitesidir28.
      NOT: Gliserol ile çalışırken viskoz sıvı elleçlemesi için özel bir pipet kullanmak önemlidir (Malzeme Tablosu).

4. Deneme çalıştırma

  1. Ev yapımı numune tutucu elleçleme
    1. PEG pasifleştirilmiş kapaklardan birini alın, üzerine yağlanmış bir parafilm ara parçası yerleştirin ve numune tutucuya yerleştirin.
      NOT: Parafilm ara parçası herhangi bir ara parça ile değiştirilebilir.
  2. Aktomiyosin çözeltisinin hazırlanması
    1. Çeşitli mikroskobik bileşenleri birleştirerek, miyozin II motor agregalarını ekleyerek ve en son EGTA'yı ekleyerek bir mikrosantrifüj tüpünde buz üzerinde aktomiyosin çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi iyice karıştırın. EGTA'nın eklenmesi, deneyin başlangıç zamanını belirleyen aktomiyosin ağı polimerizasyonunu başlatır.
  3. Bu çözeltinin 1,1 μL'sini tutucuya monte edilmiş kapak kapağına koyun ve ikinci kapak kapağını üstüne yerleştirin. Numuneyi kapatmak için tutucuyu vidalayın. Bu işlem, disk benzeri bir şekil alan damlayı hafifçe sıkar. Düşme çapları 2.800-3.000 μm arasında değişmektedir.
  4. Numune tutucuyu mikroskop üzerine yerleştirin ve alımı başlatın. İlk edinme süresini azaltmak için mikroskobu önceden hazırlayın. Numune görüntülemeye başlamak için karıştırmadan sonra genellikle 1-2 dakika sürer.

5. Mikroskopi teknikleri

  1. Özel bir yazılım (Malzeme Tablosu) tarafından kontrol edilen ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu (Malzeme Tablosu) kullanarak numuneleri görüntüleyin.
    1. Tüm jel alanını görselleştirmek ve zamanla makroskopik büzülmesini takip etmek için 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR hedefinin (Malzeme Tablosu) düşük büyütmelerini kullanın.
    2. Ağ gözenekliliğini ve yapısını karakterize etmek ve ağın kendi kendine örgütlenmesini ve zamanla daralmasını takip etmek için 10x/0.3 Ph1 UPlanFL hedefi (Malzeme Tablosu) kullanın.
      NOT: Bu hedef, ağ içindeki miyozin II motor agregalarının lokalize edilmesi ve floresan boncukların jel gözenekleri boyunca hareketinin takip edilmesi için de yararlıdır. Daha yüksek büyütmeler, çift renkli görüntüleme modunda (Malzeme Tablosu) daha da önemli olan azaltılmış bir görüş alanı pahasına kullanılabilir.
  2. Numuneleri 488 nm (aktin/floresan boncuklar) ve 561 nm (miyozin motor agregaları/floresan boncuklar) sıcaklıklarında heyecanlandırın. Elektron çarpan yük bağlantılı cihaz (EMCCD) kamera (Malzeme Tablosu) ile akış modunda özel bir yazılımla (Malzeme Tablosu) kare başına 100 ms'de görüntüleri elde edin.
    NOT: Floresan lamba (Malzeme Tablosu) yoğunluğu, şebeke daralması sırasında sinyal doygunluğunu önlemek için mümkün olan en düşük değerde tutulmalıdır.
  3. Aynı anda iki renkli görüntüleme
    1. Bu modu iki amaç için kullanın: (i) aktin ağı içindeki miyozin motor agregalarının lokalizasyonunu tespit etmek ve (i) ağ büzülmesi sırasında içerideki ve dışarıdaki dışa doğru çözücü akışını karakterize etmek.
    2. Aktin ve miyozin II motorlarını sırasıyla 488 nm ve 561 nm'de heyecanlandırın ve görüntüleri aynı anda çift emisyonlu bir cihaz (Malzeme Tablosu) kullanarak bir EMCCD kameraya (Malzeme Tablosu) kaydedin. Aktin jelini (488 nm) ve floresan boncukları (561 nm) aynı anda görüntülemek için aynı görüntüleme sistemini kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deney başına iki cam kapak fişi kullanılır. Cam kapaklar PEG polimerleri ile temizlenir ve pasifleştirilir. Pasivasyon, çözünür proteinlerin erken deneysel aşamalarda cam yüzeylere yapışmasını önlemek ve sözleşme ağının cam duvarlarla etkileşimini en aza indirmek için gereklidir. İyi pasivasyon elde edilememesi verimsiz büzülmeye yol açabilir ve aşırı durumlarda aktin ağı oluşumunu bile engelleyebilir.

Şekil 1, yüzey işleme prosedürünün üç ana adımını açıklamaktad...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, poroelastik aktomiyosin jellerinin mekaniğini, hücre sitoiskeletinin ve daha genel olarak, poroelastik bir materyal olarak davrandığı gösterilen hücre sitoplazmasının model bir sistemi olarak karakterize etmek için in vitro bir yaklaşım kullanılmaktadır 3,5. Hücre sitoiskeletinin (sitoplazma) reolojisi, uygulanan mekanik stresi takiben hücre içi sitozolik sıvının hücre içinde yeniden dağılmasının ne kadar süreceğini belirleyen bir poroelastik dif...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Dina Aranovich'e protein saflaştırma ve etiketleme için teşekkür ederiz. G.L., Jabotinsky Doktora Bursu için İsrail Bilim, Teknoloji ve Uzay Bakanlığı'na minnettardır. A.B.G., İsrail Bilim Vakfı'na (hibe 2101/20) ve İsrail Devleti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'na (hibe 3-17491) mali destek için minnettardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(3-Merkaptopropil) trimetoksisilanSigma-Aldrich Company175617Argon atmosferi altında 4 ° C'de depolanır; C 
Asetik asitBio-Lab ltd1070521
Alexa-Fluor 488InvitrogeneA10254DMSO ile seyreltilmiş, Argon atmosferi altında -20 ° C'de saklanır; C 
Alexa-Fluor 647InvitrogeneA20347DMSO ile seyreltilmiş, Argon atmosferi altında -20 ° C'de saklanmış; C 
BSASigma -Aldrich CompanyA30594 & ° C'de saklanır; C 
KatalazSigma -Aldrich CompanyC9322Stok şişesi kuru atmosfer altında (silika jel) -20 ° C'de tutulur; C
LamellerMezel-glaserCG2222-1.5Piranha tedavisinden sonra miliQ-suda tutulur ve 3 hafta içinde kullanılır
Kreatin kinazRoche Yaşam Bilimleri Ürünleri10736988001Glisin tamponunda taze olarak hazırlanır, buz üzerinde tutulur ve 3 gün içinde kullanılır. Stok şişesi kuru atmosfer altında (silika jel) 4 ° C'de tutulur; C
Kreatin fosfatRoche Yaşam Bilimleri Ürünleri10621714001Çözündüğünde -20 ° C'de tutulmalıdır; C ve 3 ay içinde kullanılır. Stok şişesi Argon atmosferi altında tutulur ve 4 ° C'de saklanır; C
DTTRoche Yaşam Bilimleri Ürünleri10708984001Çözündüğünde -20 ° C'de tutulmalıdır; C ve 3 ay içinde kullanılır
Çift Görüntülü Eş Zamanlı Görüntüleme Sistemi FotometriDV2-CUBE
EGTAMP Biyomedikal195174
EM-CCD KameraAndor Technology LtdDV 887
EM-CCD KameraFotometriEvolve Delta
EtanolBio-Lab ltd525050300
Floresan LambasıRapp Optoelektronik
Floresbrit YG MicrospheresPolysciences17151-10200 nm çaplı
GlikozICN Biyomedikal A.Ş194024Çözündüğünde -20 ° C'de tutulmalıdır; C ve 3 ay içinde kullanılır.
Glikoz oksidazSigma-Aldrich CompanyG7141-20 °C'de Tutuldu; C ve 3 ay içinde kullanılır. Stok tozu Argon atmosferi altında tutulur ve -20 ° C'de tutulur; C
GliserolICN Biyomedikal A.Ş800687
GlisinMP Biyomedikal808822
Hidrojen PeroksitSigma-Aldrich Company2167634 & ° C'de saklanır; C 
KClEMD Millipore A.Ş.
MetanolBiyo-Laboratuvar ltd1368052100
MgCl < sub > 2 < / sub >EMD Millipore Corp.
MikroskobuLeica MicrosystemsDMI3000
mPEG-malNanocsPG1-ML-5k Mw = 5000 Da. Ağırlıkça küçük partilere bölünür. Argon atmosferi altında -20 ° C'de saklanır; C
Nil kırmızısı mikro kürelerSpherotechFP-2056-2 2300 nm çap
Objektif (10x)Leica AlmanyaHC PL AP0UPlanFL Sayısal Açıklık = 0.3
Objektif (2.5x)Leica Almanya506304  Plan-NEOFLUAR Sayısal Açıklık = 0.075
FırınWTC Bağlayıcı
ParafilmAmcorPM-996
PBS TamponSigma-Aldrich CompanyP4417
Deklanşör SürücüsüVincet AssociatesVMM D1
Silika jelMerck1.01907.5000
SonikatörElmaElmasonic P
Sülfürik asitCarlo Erba reaktifleri410301
DV2 Çift Kanallı Eşzamanlı Görüntüleme Sistemi Fotometri
TRISMP Biyomedikal819620
UV-VIS SpektrofotometrePharmaciaUltraspec 2100 pro
MICROMAN EGilsonFD100011– 10 uL
MATLAB R2017bMathWorksVeri ölçümü 
MetaMorph Moleküler cihazlarOptik görüntüleme sisteminin kontrol yazılımı; veri ölçümü (parçacık izleme analizi, ağ ağ boyutu)
. . 529552442615

Kaynaklar

  1. Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  2. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
  5. Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
  8. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
  9. Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
  10. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  11. Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
  12. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  13. Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005(2013).
  15. Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201(2009).
  16. Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413(2019).
  17. Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
  18. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  19. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
  20. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264(2006).
  21. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  22. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615(2016).
  23. Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461(2018).
  24. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  25. Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
  26. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
  27. Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
  28. Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
  29. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  30. Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
  31. Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907(2003).
  32. MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).
  33. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).
  34. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Poroelastik JellerMiyozin KontraktilitesiÇözücü AkışıFloresan MikroskopiAğ GözenekliliğiStres GevşemesiIn Vitro RekonstitüsyonElastik Modül
Hücre Hücre İskeletinin Model Sistemi Olarak (Poro-)Elastik Kasılma Aktomyosin Ağlarının Mekaniği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.