Hematopoetik kök hücre biyolojisini ve hematolojik maligniteleri daha iyi incelemek için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC’ler) somatik mutasyonları sadık bir şekilde modellemek için yeni stratejiler gereklidir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift rAAV donör transdüksiyonunu birleştirerek HSPC’lerde heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonlarını modellemek için bir protokol açıklanmaktadır.
Yaşamları boyunca, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC’ler) somatik mutasyonlar kazanırlar. Bu mutasyonlardan bazıları proliferasyon ve farklılaşma gibi HSPC fonksiyonel özelliklerini değiştirir, böylece hematolojik malignitelerin gelişimini teşvik eder. HSPC’lerin etkili ve kesin genetik manipülasyonu, tekrarlayan somatik mutasyonların fonksiyonel sonuçlarını modellemek, karakterize etmek ve daha iyi anlamak için gereklidir. Mutasyonlar bir gen üzerinde zararlı bir etkiye sahip olabilir ve fonksiyon kaybına (LOF) neden olabilir veya tam tersine, fonksiyonu artırabilir veya hatta işlev kazancı (GOF) olarak adlandırılan belirli bir genin yeni özelliklerine yol açabilir. LOF mutasyonlarının aksine, GOF mutasyonları neredeyse sadece heterozigot bir şekilde ortaya çıkar. Mevcut genom düzenleme protokolleri, bireysel alellerin seçici hedeflemesine izin vermemekte ve heterozigot GOF mutasyonlarını modelleme yeteneğini engellemektedir. Burada, verimli DNA donör şablonu transferi için CRISPR / Cas9 aracılı homoloji yönelimli onarım ve rekombinant AAV6 teknolojisini birleştirerek insan HSPC’lerinde heterozigot GOF hotspot mutasyonlarının nasıl tasarlanacağına dair ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Daha da önemlisi, bu strateji, başarılı bir şekilde heterozig olarak düzenlenmiş HSPC’lerin izlenmesine ve saflaştırılmasına izin vermek için çift floresan bir muhabir sisteminden yararlanmaktadır. Bu strateji, GOF mutasyonlarının HSPC fonksiyonunu nasıl etkilediğini ve hematolojik malignitelere doğru ilerlemesini tam olarak araştırmak için kullanılabilir.
Kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmiş kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / Cas9 teknolojisinin geliştirilmesiyle, bilim adamlarının araç setine yeni ve son derece güçlü bir cihaz eklenmiştir. Bu teknoloji, genomun hassas mühendisliğine izin verir ve sadece araştırma amaçlı değil (Hsu ve ark.1’de gözden geçirilmiştir) son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır, ancak daha yakın zamanda 2,3,4 klinik ortamına da başarıyla çevrilmiştir. CRISPR / Cas9 düzenleme stratejileri, bir Cas9 proteininin aktivitesine ve tek kılavuzlu bir RNA’ya (sgRNA) dayanır5,6,7. Konakçı hücrede, Cas9 proteini, DNA’da sgRNA dizisini tamamlayan ve bir DNA çift iplikçik kırılması (DSB) getirecek olan belirli bir bölgeye yönlendirilir. Bir DSB oluşturulduktan sonra, oluşabilecek iki ana ve rakip onarım mekanizması vardır: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolojiye yönelik onarım (HDR). NHEJ, yerleştirmelere ve silmelere (indels) yol açan hataya eğilimli, ağırlıklı olarak kullanılan bir onarım mekanizmasıdır, oysa HDR, kardeş kromatidini bir onarım şablonu olarak kullanarak, çok hassastır, ancak hücre döngüsü8’in S veya G2 fazı ile sınırlıdır. Genom mühendisliğinde, HDR, Cas9 ile indüklenen DSB’nin her iki DNA ucuyla aynı olan homoloji kolları tarafından kuşatılmış bir donör şablonu sağlayarak DNA’nın hedeflenen modifikasyonu için kullanılabilir (Şekil 1). HDR için kullanılan bağışçı şablonu türü, düzenleme verimliliğini büyük ölçüde etkileyebilir. İnsan HSPC’lerinde genetik mühendisliği için, adeno ilişkili virüs serotip 6 (AAV6) yakın zamanda tek sarmallı DNA şablonlarının 9,10’unun verilmesi için mükemmel bir araç olarak tanımlanmıştır.
CRISPR / Cas9 genom mühendisliği, zararlı mutasyonları düzeltmek için terapötik olarak kullanılabilir11, ancak kanser gelişimini modellemek için DNA’ya patojenik mutasyonlar sokmak için de kullanılabilir12. Lösemi gibi kan kanseri, sağlıklı HSPC’lerde somatik mutasyonların sıralı olarak edinilmesi yoluyla gelişir13,14. Erken genetik olaylar klonal proliferatif bir avantaja yol açarak, belirsiz potansiyele sahip klonal hematopoez (CHIP) ile sonuçlanır15,16. Mutasyonların daha fazla kazanılması sonunda lösemik transformasyona ve hastalığın gelişmesine yol açacaktır. Somatik mutasyonlar, kendini yenilemeyi, hayatta kalmayı, çoğalmayı ve farklılaşmayı kontrol eden genlerde bulunabilir17.
Genom mühendisliği yoluyla bireysel mutasyonların sağlıklı HSPC’lere tanıtılması, bu aşamalı lösemijenik sürecin hassas bir şekilde modellenmesini sağlar. Akut miyeloid lösemi (AML)18,19 gibi miyeloid neoplazmlarda bulunan sınırlı sayıda tekrarlayan mutasyon, bu hastalığı genom mühendisliği araçları kullanılarak özetlenmeye özellikle uygun hale getirmektedir.
Somatik mutasyonlar sadece bir alel (monoallelik/heterozigot mutasyonlar) veya her iki alel (bialelik/homozigot mutasyonlar) üzerinde ortaya çıkabilir ve genin fonksiyonu üzerinde derin etkilere sahip olabilir, bu da fonksiyon kaybına (LOF) veya fonksiyon kazancına (GOF) neden olabilir. LOF mutasyonları, genin azalmış (eğer bir alel etkilenirse) veya tam (her iki alel de etkilenirse) HOF’una yol açarken, GOF mutasyonları genin aktivasyonunun veya yeni fonksiyonunun artmasına neden olur. GOF mutasyonları tipik olarak heterozigot20’dir.
Daha da önemlisi, zigotluğun (hetero- vs homozigot) bir mutasyonu sadık bir şekilde modelleme girişimi için büyük etkileri vardır; Bu nedenle, heterozigot sıcak nokta GOF mutasyonlarını tasarlamak için bir genin sadece bir alelinin hedeflenen manipülasyonu gereklidir. Hataya eğilimli NHEJ, değişken, öngörülemeyen biyolojik sonuçlara yol açabilecek farklı uzunluklarda21 indellere yol açar. Bununla birlikte, NHEJ, bir DSB’nin tanıtılmasından sonra hücreler tarafından kullanılan baskın onarım programı olduğundan, şu anda HSPC’leri manipüle etmek için kullanılan çoğu CRISPR / Cas9 platformu, genetik sonucun22,23’ünü tam olarak tahmin etmeye izin vermemektedir. Buna karşılık, HDR yoluyla genom mühendisliği için rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) vektör tabanlı DNA donör şablonlarının kullanımı ile birlikte bir CRISPR / Cas9 aracılı çift iplikçik kırılmasının (DSB’ler) tanıtılması, insan HSPC’lerinde mutasyonların alele özgü olarak yerleştirilmesine izin verir11,24. Bir mutant ve vahşi tip (WT) dizisinin eşzamanlı entegrasyonu, bireysel aleller üzerindeki farklı floresan muhabirlerle birleştiğinde, heterozigot bir genotip seçmek için gerçekleştirilebilir (Şekil 2). Bu strateji, tekrarlayan, lösemik, heterozigot GOF hotspot mutasyonlarının HSPC fonksiyonu, hastalığın başlaması ve ilerlemesi üzerindeki etkilerini tam olarak karakterize etmek için güçlü bir araç olarak kullanılabilir.
Bu makalede, primer insan HSPC’lerinde tekrarlayan mutasyona uğramış heterozigot GOF mutasyonlarının verimli mühendisliği için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu strateji, heterozigot GOF mutasyonunun prospektif üretimi için WT ve mutant DNA donör şablonları sağlamak üzere CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift AAV6 transdüksiyonunu birleştirir. Örnek olarak, calreticulin (CALR) genindeki tekrarlayan tip 1 mutasyonlarının (52 bp delesyonu) mühendisliği25 gösterilecektir. CALR’nin ekzon 9’undaki heterozigot GOF mutasyonu, esansiyel trombositemi (ET) ve primer miyelofibroz (PMF)26 gibi miyeloproliferatif hastalıklarda tekrar tekrar bulunur. CALR, yeni sentezlenen proteinlerin katlanma sürecinde öncelikle kalite kontrol fonksiyonuna sahip endoplazmik retikulum yerleşik bir proteindir. Yapısı üç ana alana ayrılabilir: proteinin şaperon fonksiyonunda yer alan bir amino (N) terminal alanı ve prolin bakımından zengin bir P alanı ve kalsiyum depolama ve düzenleme27,28’de yer alan bir C-alanı. CALR mutasyonları +1 çerçeve kaymasına neden olur, bu da yeni bir genişletilmiş C-terminal ucunun transkripsiyonuna ve endoplazmik retikulum (ER) retansiyon sinyalinin (KDEL) kaybına yol açar. Mutant CALR’nin trombopoietin (TPO) reseptörünü bağladığı gösterilmiştir, böylece artmış proliferasyon ile TPO’dan bağımsız sinyalleşmeye yol açmıştır29.
Resim 1: NHEJ ve HDR onarımı. DNA’da çift sarmallı bir kırılmanın ortaya çıkmasını takiben NHEJ ve HDR onarım mekanizmalarının basitleştirilmiş şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bialelik HDR düzenleme stratejisine şematik genel bakış. Donör şablonlarının hedeflenen alellere entegrasyonunu ve ardından bunların işleyen mRNA’lara çevrilmesini gösteren şematik gösterim. Turuncu noktalı kutular, sol homoloji koluna (LHA) ve sağ homoloji koluna (RHA) karşılık gelen bölgeleri gösterir. HA’ların ideal boyutu her biri 400 bp’dir. Yeşil noktalı kutu, SA dizisine karşılık gelen bölgeyi temsil eder. SA’nın boyutu 150 bp’dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İnsan primer HSPC’lerinin verimli ve kesin genetik manipülasyonu, normal hematopoezi ve en önemlisi hematopoetik hücrelerin lösemik transformasyonunu etkileyen süreçleri keşfetmek ve anlamak için harika bir fırsatı temsil eder.
Bu protokolde, tekrarlayan heterozigot GOF mutasyonlarını ifade etmek için insan HSPC’lerini tasarlamak için etkili bir strateji tanımlanmıştır. Bu prosedür, WT ve mutant DNA dizilerini endojen gen lokuslarına hassas bir şekilde eklemek için DNA şablonları için bağışçı olarak CRISPR / Cas9 teknolojisinden ve rAAV6 vektörlerinden yararlandı. Tasarlanmış cDNA’ların (WT ve mutant) ayrı floresan muhabir proteinleri ile bağlanması, kesin bir heterozigot duruma sahip hücrelerin zenginleşmesini ve izlenmesini sağlar.
Bu strateji, sık kullanılan lentiviral (LV) tabanlı yöntemlere kıyasla çeşitli avantajlar sunmaktadır. Ana avantajlardan biri, CRISPR / Cas9 tabanlı sistemin endojen lokuslarda hassas düzenlemeye izin vermesidir, bu da endojen promotörlerin ve düzenleyici elemanların korunmasını sağlar. Bu, hücrelerde düzenlenmiş genin ekspresyonunda homojenliğe yol açar; bu, LV tabanlı bir yöntem kullanıldığında zorlukla ulaşılabilen bir hedeftir. AG vektörleri ile gen transferi, transkripsiyonel olarak aktif bölgeler tercih edilerek genin yarı rastgele entegrasyonuna yol açar34. Bu, aktarılan genin aşırı ekspresyonuna ve düzenlenmiş hücreler arasındaki heterojenliğe dönüşebilir ve sonuçta mutasyonların ve gen etkileşimlerinin rolünü araştırmak ve analiz etmek için zorluklara neden olabilir. İkinci bir avantaj, tarif edilen sistemin, siteye özgü bir düzenleme sistemi olarak, ekleme mutajenezi35 risklerini ortadan kaldırmasıdır.
Çift floresan muhabir stratejisi, her iki alel üzerinde başarılı bir şekilde düzenlenmiş hücrelerin hassas bir şekilde zenginleştirilmesine ve izlenmesine izin verir; bir alel WT cDNA’yı entegre eder ve diğer alel mutasyona uğramış cDNA dizilerini bütünleştirir. Yalnızca tek bir muhabiri ifade eden hücreler, HDR şablonlarının aynı floresan muhabirle yalnızca monoallelik entegrasyonunu veya bialelik entegrasyonunu temsil eder. Her iki senaryo da ancak tek hücreden türetilmiş klonlar üretilir ve ayrı ayrı analiz edilirse kesin olarak ayırt edilebilir. Bununla birlikte, HSPC’ler in vitro olarak sadece sınırlı proliferatif kapasiteye sahiptir ve kültürde uzun süre tutulduğunda, HSPC’ler daha olgun soylara farklılaşmaya başlar ve kendini yenileme ve aşılama kapasitelerini kaybeder. Bu, istenen heterozigot mutasyonu barındıran tek hücreli klonların seçilmesini ve genişletilmesini mümkün kılmaz. Çift floresan protein stratejisinin uygulanması ve heterozigot mutasyonu taşıyan hücreler için akış sitometrisi ile zenginleştirilmesi, genişletilmiş in vitro kültürün neden olduğu sorunların atlanmasına izin verir.
Bu özel örnekte, heterozigot CALRDEL / WT mutasyonunu taşıyan HSPC’lerin saf popülasyonlarını elde etmek için HSPC’lerin verimli bir şekilde tasarlanabileceği ve sıralanabileceği başarıyla gösterilmiştir.
Bununla birlikte, bu sistem heterozigot çerçeve kaydırma mutasyonlarının mühendisliği ile sınırlı değildir, aynı zamanda yanlış ve saçma mutasyonlar da dahil olmak üzere diğer mutasyon türlerini oluşturmak için kolayca benimsenebilir. WT içeren AAV’lerin farklı kombinasyonlarını veya farklı floresan raporlayıcı proteinleri ile mutasyona uğramış dizileri uygulayarak, bu sistem homozigot mutasyonların tanıtılması (her ikisi de mutant cDNA taşıyan ancak farklı floresan muhabirleri taşıyan iki rAAV ile eşzamanlı transdüksiyon) veya hatta mutasyonların düzeltilmesi (her ikisi de WT cDNA taşıyan iki AAV ile eşzamanlı transdüksiyon) için de kullanılabilir. Ek olarak, bu stratejinin onkojenik GOF mutasyonlarının tanıtılmasıyla sınırlı olmadığını belirtmek önemlidir. Aslında, tarif edilen protokol, gen nakavtı, gen replasmanı36,37, transgenlerin hedefli knock-in’i (yani, kimerik antijen reseptörleri)38 ve hatta hastalığa neden olan mutasyonların düzeltilmesi 11,39 dahil olmak üzere çoklu alternatif stratejiler için kullanılabilir.
CRISPR / Cas9 ve AAV6’yı çoklu floresan muhabirlerle birleştirme stratejisinin, T hücreleri, plazmasitoid dendritik hücreler, indüklenmiş pluripotent kök hücreler, nöronal kök hücreler ve hava yolu kök hücreleri 24,38,40,41,42,43,44 dahil olmak üzere diğer birçok hücre tipinde de uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. . Bu strateji, üstün kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin üretimi için uygulanabilir. Örneğin, yakın zamanda, CAR T hücrelerindeki TGFBR2 geninin CRISPR / Cas9 aracılı nakavtının, baskılayıcı TGF β zengin tümör mikroçevre45’teki işlevlerini büyük ölçüde arttırdığı yayınlanmıştır. Böyle bir yaklaşım, hem CAR’ı eksprese etmek için T hücrelerinin mühendisliğini yapmak hem de TGFBR2 genini CAR’ı TGFBR2 geninin her iki aleline özel olarak yerleştirerek bölgeye göre nakavt etmek için tek adımlı bir protokol sağlayabilir. Dahası, bu yaklaşım, CAR’ı T hücresi reseptörü alfa sabiti (TRAC) geni46,47’ye entegre ederek evrensel CAR T hücreleri üretmek için de yararlı olabilir.
Tekrarlanabilirliği arttırmak ve hücrelerin verimli bir şekilde düzenlenmesini garanti etmek için, bazı önemli hususlara dikkat edilmesi gerekir. Hücrelerin başarılı bir şekilde düzenlenmesini sağlamak için ana kritik noktalar (i) sgRNA’nın seçimi, (ii) HDR şablonunun tasarımı ve (iii) rAAV6 üretiminde bulunur.
İyi performans gösteren bir sgRNA’nın seçimi, HDR şablonunun entegre edilebileceği maksimum alel sayısını belirleyeceği için çok önemlidir. Şu anda mevcut olan çok sayıda yazılım nedeniyle, aday sgRNA’ların araştırılması basitleştirilmiştir. İlgilenilen bölgeyi seçerek, yazılım sırasıyla istenen lokusta ve istenmeyen lokusta düzenleme şansını gösteren hedef üstü puana ve hedef dışı puana sahip bir dizi sgRNA önerebilir. Bu puanlar daha önce yayınlanmış48,49 puanlama modellerine göre hesaplanmıştır. Bu, iyi performans gösteren bir sgRNA seçmek için iyi bir başlangıç noktası olmasına rağmen, silikodaki öngörülen performansı her zaman in vitro olarak verimli bir sgRNA’ya karşılık gelmediğinden, sgRNA’nın performansının doğrulanması gerekir. Bu nedenle, en iyi sgRNA’yı bulma şansını artırmak için en az üç sgRNA tasarlamanız ve test etmeniz şiddetle tavsiye edilir. Gerçek bir iyi performans gösteren sgRNA tanımlandıktan sonra, HDR şablonunun tasarımına devam edilmesi önerilir.
HDR şablonunu tasarlarken önlemler dikkate alınmalıdır. Sol ve sağ homoloji kollarının (sırasıyla LHA ve RHA) her biri sırasıyla sgRNA kesim bölgesinin yukarı ve aşağı yönünde 400 bp yayılmalı, çünkü daha kısa HA’lar HDR frekanslarının azalmasına neden olabilir. HDR ile tanıtılabilen cDNA’nın boyutu, kabaca 4,7 kb olan AAV’lerin paketleme yeteneklerine bağlıdır. HDR şablonunda zorunlu olan çok sayıda öğe (LHA, RHA, SA, PolyA, promotör ve floresan muhabir dizisi) nedeniyle, mutasyona uğramış veya WT cDNA için kalan alan sınırlıdır. İstenilen mutasyon bir genin 3′ ucunun yakınında veya genel olarak kısa bir CDS’ye sahip genlerde bulunuyorsa bu sorunsuzdur. Bununla birlikte, mutasyonun uzun bir CDS’li genlerin transkripsiyonel başlangıç tarafına (TSS) yakın bir yerde bulunduğu durumlarda (AAV’nin kalan paketleme alanını aşarak), bu tarif edilen yaklaşım mümkün olmayabilir. Bu sorunu aşmak için, HDR şablonunu iki AAV’ye bölmeye dayanan bir strateji yakın zamanda Bak ve meslektaşları tarafından geliştirilmiştir. Bu strateji, büyük bir gen50’nin nihai kesintisiz entegrasyonunu elde etmek için iki ayrı HDR aracılı entegrasyona dayanır.
Virüsün kalitesi ve titresi, hücrelerin başarılı genom mühendisliğini yapabilen veya bozabilen ek faktörlerdir. Optimum verim için, HEK293T’nin kültürde korunurken tam akıcılığa ulaşmasına izin vermemek önemlidir. İdeal olarak, HEK293T hücreleri% 70-80 akıcılığa ulaşıldığında bölünmelidir. Ek olarak, HEK293T uzun süre kültürlenmemelidir, çünkü bu onların virüs üretme yeteneklerini azaltabilir. Yeni HEK293T hücrelerinin 20 geçişten sonra çözülmesi gerekir. Yüksek virüs titreleri elde etmek, deneylerin verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmak için önemlidir. Düşük viral titreler, HSPC’lerin transdüksiyonu için gerekli olan büyük hacimli rAAV çözeltisine dönüşecektir. Genel bir kural olarak, çekirdeklendirilmiş hücrelere eklenen rAAV çözeltisi, HSPC tutma ortamının toplam hacminin% 20’sini geçmemelidir. Daha yüksek hacimli AAV solüsyonu hücre ölümünün artmasına, proliferasyonun azalmasına ve transdüksiyon verimliliğinin bozulmasına neden olabilir. Düşük virüs titreleri durumunda, bu nedenle virüsün daha da konsantre edilmesi önerilir.
Özetle, bu protokol, ek çift floresan muhabirlerle CRIPSR / Cas9 ve rAAV6 donör şablonlarının eşzamanlı kullanımı yoluyla insan HSPC’lerini hassas ve verimli bir şekilde manipüle etmek için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Bu yaklaşımın normal hematopoetik kök hücre biyolojisini ve mutasyonların löseminogeneze yaptığı katkıları incelemede harika bir araç olduğu kanıtlanmıştır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu’ndan (FWF; sayı P32783 ve I5021) A.R.’ye verilen hibelerle desteklenmektedir. A.R.’ye ek fon, Avusturya İç Hastalıkları Derneği (Joseph Skoda Bursu), Avusturya Hematoloji ve Onkoloji Derneği (OeGHO; Klinik Araştırma Bursu) ve MEFOgraz. T.K. Lösemi ve Lenfoma Derneği’nin Özel Üyesidir.
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated | Corning | 431080 | |
150 mm x 25 mm dishes | Corning | 430599 | |
293T | DSMZ | ACC 635 | https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635 |
4D Nucleofector Core Unit | Lonza | – | For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program. |
4D Nucleofector X Unit | Lonza | – | |
500 ml Centrifuge Tube | Corning | 431123 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
AAVpro Purification Kit | Takara | 6666 | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 1081058 | |
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | – | |
Benchling sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | – | |
Chemically modified synthetic sgRNA | Synthego | Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’ An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases. *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos) | |
CHOPCHOP sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no | ||
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3526 | |
CRISPick sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
CRISPOR sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net | ||
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864008 | |
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1863009 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
FACSAria Fusion | BD Biosciences | – | |
Falcon 5 mL Round Bottom | Corning | 352054 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml | Pan Biotech | P40-47500 | |
FlowJo 10.8.0 | BD Biosciences | – | |
GenAgarose L.E. | Inno-train | GX04090 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs Inc. (NEB) | E2611L | |
HEK293T | |||
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
ICE | Synthego | https://ice.synthego.com | |
IDT codon optimization tool | IDT | https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool | |
IDT sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM | ||
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7658-1KG | |
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7533-1KG | |
Midori Green Advance | Nippon Genetics | MG04 | |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010L | |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | NEB | T1020L | |
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987U | |
Nuclease-Free Water, 5X100 ml | Ambion | AM9939 | |
NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml | Gibco | 31985070 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix. |
pAAV-MCS2 | Addgene | 46954 | |
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
pDGM6 | Addgene | 110660 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966 | Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C. |
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap | |||
Primers | Eurofins | – | Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) Primer 1 Fwd: AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC |
PrimeTime qPCR Primer Assay | IDT | – | PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers) that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std – qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6 |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
QuantaSoft Software | Bio-Rad | ||
Quick Extract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | ||
Recombinant human Flt3-ligand | Peprotech | 300-19 | |
Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
Recombinant Human SCF | Peprotech | 300-07 | |
Recombinant Human TPO | Peprotech | 300-18 | |
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758-6X500ML | |
SnapGene | Dotmatics | Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used. | |
Soc outgrowth medium | NEB | B9020S | |
Sodium-butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | |
Stem Regenin 1 (SR1) | Biogems | 1224999 | |
StemSpan SFEM II | STEMCELL Technologies | 9655 | |
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X | Thermo Scientific | B49 | |
TIDE | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
TrypLE (with phenol red), 500 ml | Thermo Scientific | 16605-028 | |
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml | Thermo Scientific | 15575-038 | |
UM171 | STEMCELL Technologies | 72914 | |
Vector Builder codon optimization tool | Vector Builder | https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html |