Burada, tek hücreli dizileme için yüksek kaliteli tek hücreli bir tilapia bağırsağı süspansiyonunun hazırlandığını gösteriyoruz.
Nil tilapyası, dünya çapında en yaygın kültüre alınmış tatlı su balığı türlerinden biridir ve su ürünleri balık çalışmaları için yaygın olarak kullanılan bir araştırma modelidir. Yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanması, tek hücreli RNA veya genom dizilimi gibi tek hücreli seviyedeki çalışmalar için gereklidir. Bununla birlikte, su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri, özellikle tilapia bağırsağı için kullanıma hazır bir protokol yoktur. Etkili ayrışma enzimleri doku tipine bağlı olarak değişir. Bu nedenle, minimum hasarla yeterli canlı hücre elde etmek için uygun enzim veya enzim kombinasyonunu seçerek doku ayrışma protokolünü optimize etmek esastır. Bu çalışma, Nil tilapia bağırsağından kollajenaz / dispaz enzim kombinasyonu ile yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için optimize edilmiş bir protokolü göstermektedir. Bu kombinasyon, sindirim sonrası hücre agregasyonunu azaltmak için sığır serum albümini ve DNaz kullanımı ile ayrışma için oldukça etkilidir. Hücre çıkışı,% 90 hücre canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşılar. Bu protokol, diğer balık türlerinin bağırsaklarından tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için de değiştirilebilir. Bu araştırma, etkili bir referans protokolü sağlar ve su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri için tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasında ek denemelere olan ihtiyacı azaltır.
Hücreler organizmaların temel birimleridir. Toplu doku çalışmaları ile karşılaştırıldığında, tek hücre düzeyinde çalışmalar hücre heterojenliğini yansıtabilir ve daha yüksek çözünürlüklü bilgi sağlayabilir1. Son yıllarda, araştırmacılar memelilerde, zebra balıklarında ve diğer model organizmalarda genom, transkriptom, epigenom veya multi-omik çalışmalar için tek hücreli dizileme teknolojilerini tek hücreli seviyelerde uyguladılar ve büyük atılımlar bildirdiler 2,3,4,5,6,7 . Çoğu çalışma model organizmalara odaklanmış olsa da, ekonomik balık türlerinde tek hücreli dizileme için az sayıda referans protokolü veya ticari ayrışma kiti vardır, bu da su ürünleri yetiştiriciliği araştırmalarında tek hücreli dizilemenin uygulanmasını sınırlar. Bu nedenle, yüksek hücre canlılığına ve nükleik asit bütünlüğüne sahip yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar üreten doku ayrışma protokollerinin geliştirilmesi çok önemlidir.
Minimum hasarla yeterli sayıda canlı hücre elde etmek için doku ayrışma protokolünün uygun enzim veya enzim kombinasyonu ile optimize edilmesi esastır. Doku ayrışması için en etkili enzim doku tipine bağlı olarak değişir. Memelilerde, kollajenaz, dispaz, tripsin, papain, elastaz, hyaluronidaz, liberaz, accutaz ve trypLE 8,9 dahil olmak üzere memeli katı dokuları için tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için çeşitli enzimler kullanılmıştır. Mekanik bozulma ile birlikte tripsin sindirimi, balıklarda hücre kültürü için dokuları ayrıştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır10,11,12,13,14. Tripsin ayrıca sıçan bağırsağı15 ve zebra balığı solungaç dokusu16’da doku ayrışması için sindirim kokteyline kullanılmış veya eklenmiştir. Bununla birlikte, çeşitli nedenlerden dolayı, tripsin tek hücreli dizileme için en iyi seçenek değildir. Tek başına tripsin genellikle doku ayrışması için etkisizdir. Ek olarak, tripsin DNA ipliğinin17,18 kırılmasını ve RNA yıkımının19’u indükler.
Papain, hücreler arasındaki sıkı kavşakları oluşturan proteinleri bozar. Memeli sinir ve düz kas hücrelerinde, papain diğer proteazlardan daha verimli ve daha az yıkıcıdır20,21. Bununla birlikte, tripsin gibi, papain, enzimatik sindirim sırasında meydana gelen hücre lizisi nedeniyle hücrelerin serbest DNA kaynaklı toplanmasına neden olur9. Elastaz, tipik olarak ciltte, akciğerlerde, bağlarda, tendonlarda ve vasküler dokularda bulunan elastini parçalamaktadır22. Genellikle akciğer dokusunu ayırmak için kollajenaz, dispaz veya tripsin ile kombinasyon halinde kullanılır8. Hyaluronidaz hyaluronan’ın glikosidik bağlarını parçalayarak çeşitli bağ dokularında ve ciltte hücre dışı matriksin sindirimine katkıda bulunur 9,23.
Genel olarak, kollajenaz ve dispaz hücre dışı matriks parçalanması için iyi seçeneklerdir. İnsan, fare ve zebra balığı bağırsaklarının ayrışmasında kullanılmıştır24,25,26,27. Kollajenaz, kollajendeki peptit bağını yok eder, hücre dışı matrisin sindirimini teşvik eder ve hücreleri süspansiyona bırakır ve bu nedenle kollajenaz genellikle karaciğer 28,29, dalak30, pankreas31 ve bağırsak25 dahil olmak üzere insan ve fare katı doku ayrışması için kullanılır . Dispoz, polar olmayan amino asit kalıntılarının N-terminal peptid bağlarını hidrolize eden ve kollajenazdan daha hafif olan bir proteazdır. Fibronektin, tip IV kollajen ve daha az ölçüde tip I kollajen gibi hücre dışı matriks bileşenlerini, hücre-hücre kavşaklarını etkilemeden ayırır. Dispaz, bağırsak25,32, beyin33, karaciğer34, vb. gibi doku ayrışması için ayrı ayrı veya diğer enzimlerle birlikte kullanılır. Ek olarak, liberaz, accutaz ve trypLE dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen sindirim kokteylleri, özellikle cilt, karaciğer ve böbrek 8,9 için katı doku ayrışması için iyi alternatiflerdir.
Nil tilapiası (Oreochromis niloticus), Perciformes takımının Cichlidae familyasına aittir. Tropikal ve subtropikal bölgelerde en çok kültürlü tatlı su balığı türlerinden biridir ve 2022 yılında yıllık 4,5 milyon ton üretim gerçekleştirmiştir35. İyi açıklamalı bir genoma sahip en iyi çalışılmış su ürünleri yetiştiriciliği balık türlerinden biridir. Nil tilapyası, kısa üretim süresi, yetiştirme kolaylığı ve çok çeşitli yetiştirme ortamlarına adaptasyonu nedeniyle su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri için ideal bir araştırma modelidir. Bağırsak, beslenme, sindirim ve emilim, metabolizma ve mukozal bağışıklık organı olduğu için büyük araştırma ilgi çekicidir. Bağırsak, mikrobiyal popülasyonların yaşam alanıdır ve önemli bir bağışıklık dokusudur36. Makrofajlar, B hücreleri, granülositler ve T hücreleri dahil olmak üzere çok sayıda immün hücre tipinin varlığı nedeniyle immünolojik olarak aktiftir.
Bu çalışmada, su ürünleri balık türlerinde tek hücreli seviye çalışmalarını kolaylaştırmak için Nil tilapia bağırsağından yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için bir protokol geliştirdik. Bu dokuya özgü enzimlerin özelliklerine ve ön çalışmalara göre, kollajenaz / dispaz tilapia bağırsak dokusunun ayrışması için uygundur. Tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasında göz önünde bulundurulması gereken son enzim tipi, apoptotik yollarıbaşlatmadan enzimatik sindirim sırasında ölü hücre lizisi yoluyla salınan serbest DNA’yı parçalayarak hücre agregasyonunu önleyen DNaz-I’dir 9 ve canlı hücre verimini arttırır36. Ek olarak, hücre kümelenmesini azaltmak ve hücre canlılığını artırmak için yıkama tamponuna sığır serum albümini (BSA) eklenir. Birçok reaktif şirketi BSA’yı bir enzim stabilizatörü olarak tanımlamaktadır. PBS’ye (fosfat tamponlu salin) %0,04-%1 BSA ilavesi, olumsuz etkileri olmayan tek hücreli dizileme süspansiyonları hazırlamak için bir yıkama çözeltisi geliştirmek için kullanılmıştır38. Düşük bir BSA oranının eklenmesi, hücre canlılığının korunmasına yardımcı olabilir ve hücre lizisi nedeniyle hücrelerin serbest DNA kaynaklı toplanmasını önleyebilir. Bu protokol aynı zamanda diğer su ürünleri balık türlerinin bağırsaklarından hücre ayrışma protokolleri geliştirmek için değerli bir referans sağlayabilir.
Bu protokol, Nil tilapia bağırsağının yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonunun hazırlanmasını açıklar. Ayrışmadan önce, özellikle çok yağlı etçil balık bağırsakları için yağ ve mezenterin bağırsaktan çıkarılması gereklidir. Bağırsak içeriğini yıkamak için sert kazıma yerine bir şırınga kullanmak, hücrelere verilen mekanik hasarı azaltır. Hücre canlılığını sağlamak için, doku diseksiyonu ve durulama adımları için sıcaklığın 20 ° C veya altında tutulması da…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Çin’in Hainan İl Doğa Bilimleri Vakfı’nın (NO. 320QN211) ve Çin’in Sucul Hayvan Hastalıkları Kontrolü ve Sağlıklı Kültürü Guangdong İl Anahtar Laboratuvarı Araştırma Fonu Programı’nın desteğini kabul etmek istiyor (NO. PBEA2021ZD01).
0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |