Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

RPE, nöral retina ve vasküler koroid arasında yer alan pigmentli hücrelerin benzersiz bir tek katmanından oluşur ve RPE, fototransdüksiyon ^1,2 de dahil olmak üzere normal retina fonksiyonunun geliştirilmesinde ve sürdürülmesinde iyi bilinen rollere sahiptir. Daha yakın zamanlarda, RPE'ye göz büyümesi düzenlemesi^3'te ve dolayısıyla miyopi^4'ün gelişiminde ek bir anahtar rol verilmiştir. Bu atama, RPE'nin retina ve koroid arasına yerleştirilen kritik konumuna ve göz büyümesinin ve dolayısıyla kırma kusurlarının yerel olarak düzenlendiği yönündeki geniş kabule dayanmaktadır⁵. RPE'nin, büyüme modülatörü sinyallerin varsayılan kaynağı olan retinayı, iletilen sinyallerin iki hedefi olan koroid ve skleraya bağlayan bir sinyal rölesi olarak kilit bir rol oynadığına inanılmaktadır ^6,7,8.

Çoğu miyopiyi karakterize eden aksiyel uzunluktaki artış iyi huylu olarak kabul edilemez, retina, koroid ve / veya sklerasa içeren patofizyolojik değişiklikler aşırı oküler uzamanın kaçınılmaz ve şimdi iyi bilinen sonuçlarını temsil eder ^7,9. Bu bağlamda, RPE belki de en savunmasız olanıdır, çünkü mitotik olmayan bir doku olarak, genişleyen vitreus odasını ancak bireysel hücrelerin gerilmesi ve inceltilmesiyle barındırabilir. Miyop makula dejenerasyonu gibi miyopi ile ilişkili patolojilerdeki rolü henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, RPE, retina, RPE ve koroid^10,11'de belgelenmiş anormalliklerle ilişkili olan körlüğün önde gelen nedenlerinden biri olan coğrafi atrofi de dahil olmak üzere bir dizi başka retina hastalığının patogenezinde rol oynamıştır^{. 12}.

RPE hücrelerinin komşu oküler dokulardan kontaminasyondan arındırılmış başarılı izolasyonu, çeşitli göz / retina hastalıklarının altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler edinmek için potansiyel olarak birçok araştırma fırsatı sunmaktadır. Bununla birlikte, RPE'nin izolasyonunun zor olduğu kanıtlanmıştır, bu nedenle kombine retina / RPE veya RPE / koroid örneklerini kullanan birçok yayınlanmış çalışma ile^13,14,15. Moleküler biyoloji çalışmalarına uygun kalitede RPE'nin başarılı bir şekilde izole edilmesini içeren çalışmalar civciv ve fare gözleri ile sınırlı kalmıştır^16,17. Örneğin, Wang ve ^ark.18 tarafından tanımlanan eşzamanlı RPE izolasyonu ve RNA stabilizasyonu (SRIRS) yöntemi. Farelerde RPE hücrelerini izole etmek, kobay gözlerinde iyi çalışmıyor gibi görünmektedir. Burada açıklanan protokol, başlangıçta yazarlardan biri (M.F.) tarafından ağaç sivri gözlerle prototiplenen ve genç pigmentli kobayların gözlerinden RNA ve diğer moleküler biyoloji analizleri için uygun yüksek kaliteli RPE örnekleri verdiği kanıtlanmış bir yaklaşımın iyileştirilmesini temsil etmektedir¹⁹.

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan bakımı ve tedavileri, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Beyanı'na uygundur. Deneysel protokoller, Berkeley'deki Kaliforniya Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Gine domuzu gözünün enükleasyonu

1. Anestezi altında verilen intrakardiyak sodyum pentobarbital enjeksiyonu ile bir gine domuzu ötenazi yapın (oksijende% 5 izofluran).
2. Forseps ve makas yardımıyla gözleri enüklee edin ve hemen yıkamak için steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 10 cm'lik bir Petri kabına aktarın. Gözleri taze PBS çözeltisine aktarın.
   NOT: Kuyu başına 4 mL çözelti içeren 6 delikli bir plaka önerilir.

2. Oküler arka göz kapağı ve RPE/koroid/sklera kompleksinin izolasyonu

1. Diseksiyon mikroskobu yardımıyla, sklerada limbal sınırın yaklaşık 1.0 mm gerisinde (yani kornea ve sklera arasında) ilk küçük kesiyi yapmak için 18 G'lik bir iğne kullanın (Şekil 1A); Daha sonra kornea, iris, siliyer gövde ve kristalin lens dahil olmak üzere ön segmenti çıkarmak için makas kullanın.
2. Daha sonra, kalan posterior oküler segment göz kepçesi ile çalışarak, retinayı RPE / koroid / sklera kompleksinden ayırın; forseps kullanarak önce Zinn zonulünü kavrar ve sonra nazikçe çeker ve daha sonra retinayı parçalanmadan aşamalı olarak soyar (Şekil 1B).
   NOT: Retina parçalanmasını ve eksik retina dokusu izolasyonunu önlemek için retina doğrudan kavranmamalıdır. Bu diseksiyon adımı için mikroskop kullanımı esastır.

3. RPE'nin koroidden izolasyonu

1. Retina tamamen çıkarıldıktan sonra, RPE, koroid ve sklerayı içeren kalan arka göz kabını 5 dakika boyunca doku depolama reaktifine daldırın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Her biri 2 mL doku depolama reaktifi ile doldurulmuş, tanımlanmış kuyucuklara sahip 12 delikli bir plaka kullanın.
2. Vizör kabını 2 mL PBS ile dolu üçüncü bir kuyucuğa taşımadan önce 10 saniye boyunca 4 mL PBS ile dolu başka bir kuyucuğa aktarın.
3. Son RPE izolasyon adımı için PBS ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırıngaya 30 G'lik bir iğne takın. PBS'nin jet akışını oluşturmak için şırıngayı yavaşça itin; İlk olarak, içinde küçük bir yırtılma veya delik açmak için bu akışı RPE'ye hedefleyin ve ardından RPE'yi koroidden bir tabaka olarak ayırmak için PBS akışını oluşturulan açıklığa yönlendirin (Şekil 1C).
   NOT: RPE'nin bir tabaka olarak ayrılması en büyük RPE örneğini verir. Yine, bu adım için mikroskop kullanımı esastır.
4. RPE'yi koroidden ayırdıktan sonra (Şekil 1D), RPE dokusunu iğnesiz 1 mL'lik bir şırıngada toplayın ve ardından toplanan numuneyi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
5. Bir RPE peleti elde etmek için toplanan RPE ile 1.5 mL tüpü 8.000 × g'da 1 dakika boyunca santrifüj edin (Şekil 2A).
6. PBS çözeltisini atın ve RNA izolasyon kitlerine dahil edildiği gibi 350 mL lizis tamponu ile değiştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız); pipet 20x karıştırmak ve böylece numunenin kalitesini korumak. Daha uzun süreli depolama ve muhafaza için, numuneleri -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın.
   NOT: Lizis tamponu, RNA izolasyonu ve eşzamanlı RNA / DNA / protein izolasyonundan önce hücre ve doku lizisi için RNA izolasyon kitinin tescilli bir bileşenidir. Lizattaki RNAları inaktive etmek için, lizis tamponuna β-merkaptoetanol eklediğinizden emin olun (1 mL lizis tamponu başına 10 μL β-merkaptoetanol).

4. RPE-RNA ekstraksiyonu

1. Üreticinin verdiği talimatları izleyerek RNA'yı RPE örneklerinden izole etmek ve toplamak için bir RNA izolasyon kiti kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Numunenin kalitesini elektroforez yoluyla değerlendirin.
   NOT: Açıklanan protokol iyi kalitede bir ürün verdi (yani, 8.0 üzerinde RNA bütünlük numarası [RIN]).

Yukarıdaki protokol kullanılarak toplanan RPE örneklerinin analizi, göz başına 240.2 ng ± 35.1 ng (n = 8, NanoDrop, Şekil 2B) ile iyi korunmuş RNA (RIN >8.0, Şekil 2B) göstermiştir. İzole RPE örneklerinin kalitesini, özellikle koroidal ve skleral kirleticilerin yokluğunu daha fazla değerlendirmek için, RPE örneklerinde19 ikinci dokuların her biri için temsili genlerin ekspresyonunu inceledik. RPE örnekleri, koroid ve skleradaki Rpe65 ekspresyon seviyelerine kıyasla anlamlı derecede daha yüksek bir Rpe65 ekspresyonu (RPE'ye özgü bir gen) göstermiştir (Tablo 1 ve Şekil 2C). Buna karşılık, RPE örnekleri, seçilen koroid-skleraya özgü gen olan Col1a1'in minimal ekspresyonunu gösterdi (Şekil 2D).

Şekil 1: RPE sayfalarını toplama prosedürü . (A) İlk kesi yapılan 2 haftalık bir kobay gözü. (B) Ön segment (kornea, iris ve lens), vitreus ve retina daha sonra arka göz kapağından (RPE, koroid ve sklera) ayrılır. (C) 30 G'lik bir iğne ile verilen PBS'nin bir jet akımı, RPE'yi (D) koroidden bir tabaka (siyah oklar) olarak ayırmak için kullanılır. İlk insizyondan RPE koleksiyonuna kadar olan işlem 5-7 dakika sürer. Kısaltma: RPE = retinal pigment epiteli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İzole edilmiş RPE numunelerinin kalitesini değerlendirme prosedürü. (A) Bir RPE numunesinin döndürüldükten sonra 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde temsili görüntüsü. (B) Toplanan RPE örneklerinden ekstrakte edilen RNA için temsili biyoanalizör çıktısı. (C,D) RPE'ye özgü bir gen olan Rpe65 ve RPE'de ifade edilmeyen veya minimal olarak eksprese edilen Col1a1'in gen ekspresyon seviyeleri, n = 3 tedavi edilmemiş hayvanlardan RPE, koroid ve skleral örneklerde RT-qPCR ile ölçülür; Her iki veri seti de β-aktin'e normalleştirildi. ** P < 0,01; P < 0.001. Bu rakam Goto ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RPE = retinal pigment epiteli; β-aktin = beta-aktin; Col1a1 = kollajen tip-I alfa-1 zinciri; Rpe65 = retinoid izomerohidrolaz; RT-qPCR = ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Numune kalite analizinde PCR amplifikasyonu için kullanılan primerlerin nükleotid dizileri. Kısaltmalar: β-aktin = Beta-aktin; Col1a1 = kollajen tip I alfa 1 zinciri; Rpe65 = retinoid izomerohidrolaz.

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.